Fiber-knob嵌合型溶瘤腺病毒對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外感染和殺傷活性分析

摘要： 針對惡性膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤， 患者的平均生存時(shí)間較短， 傳統(tǒng)治療方法難以實(shí)現(xiàn)根治， 而新興的溶瘤病毒療法存在擴(kuò)散能力有限， 治療效果不理想等問題， 通過基因工程技術(shù)對人5型腺病毒（Ad5）衣殼蛋白進(jìn)行修飾， 構(gòu)建一種纖維蛋白頭節(jié)區(qū)（knob）嵌合替換型溶瘤腺病毒， 以提升其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的感染和靶向能力. 利用來自B亞群Ad37的knob替換Ad5的knob， 證實(shí)其可利用唾液酸為受體， 從而增強(qiáng)對膠質(zhì)瘤等CAR（coxsackievirus and adenovirus receptor）低表達(dá)腫瘤細(xì)胞的感染和殺傷能力， 并在體外模型中提升對血腦屏障的穿透效率， 為惡性膠質(zhì)瘤的治療提供新的解決方案.

關(guān)鍵詞：" 惡性膠質(zhì)瘤； 溶瘤腺病毒； 基因工程

中圖分類號：" Q789" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A" 文章編號： 1671-5489（2025）01-0201-06

Analysis of" in vitro Infection and Killing Activity of

Fiber-knob Chimeric Oncolytic Adenovirus on Glioma Cells

LIU Wenmo， WANG Lizheng， YU Bin， YU Xianghui

（School of Life Sciences， Jilin University， Changchun 130012， China）

Abstract：""" Based on the fact that glioblastoma multiforme is the most common malignant tumor in the brain，" an average survival time of" patients is relatively short，" and traditional treatment methods are difficult to achieve" cure. However， emerging oncolytic virotherapy has limited dissemination capability and" suboptimal treatment effects. By using genetic engineering technology to modify the capsid protein of human adenovirus type 5 （Ad5）， we constructed a chimeric oncolytic adenovirus with a fiber knob replacement to enhance its ability to infect and target" glioma cells. By replacing the" knob of Ad5 with the knob" of Ad37 from subgroup B Ad37， it was confirmed that it could utilize sialic acid as a receptor， thereby improving its ability to infect and kill tumor cells with low expression of" CAR （coxsackievirus and adenovirus receptor） such as glioma， and improving its penetration efficiency through the blood-brain barrier in in vitro models，" providing a new solution for the treatment of glioblastoma multiforme.

Keywords： glioblastoma multiforme; oncolytic adenovirus; genetic engineering

惡性膠質(zhì)瘤（glioblastoma multiforme， GBM）是發(fā)病率最高的顱內(nèi)惡性腫瘤， 目前患者的平均生存期通常不足15個(gè)月［1］. 由于其發(fā)生部位獨(dú)特， 生物學(xué)特征復(fù)雜， 傳統(tǒng)的治療手段如手術(shù)、 化療和放療難以對其實(shí)現(xiàn)根治. 近年來， 溶瘤病毒療法作為一種新興的惡性腫瘤治療策略備受關(guān)注. 2022年， 溶瘤單純皰疹病毒在日本被批準(zhǔn)上市用于治療惡性膠質(zhì)瘤［2-3］， 目前已有多個(gè)溶瘤病毒治療惡性膠質(zhì)瘤的方案進(jìn)入臨床研究階段， 所采用的溶瘤病毒包括腺病毒、 單純皰疹病毒、 呼腸孤病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等， 其中以腺病毒的應(yīng)用最廣泛［4］.

目前臨床上使用溶瘤病毒治療膠質(zhì)瘤一般通過手術(shù)在顱內(nèi)腫瘤處直接注射溶瘤病毒， 雖然原位注射局部藥物濃度高， 但其擴(kuò)散受限［5］. 對較大的腫瘤需多部位注射， 增加操作次數(shù)； 對易轉(zhuǎn)移、 容易多中心復(fù)發(fā)的惡性膠質(zhì)瘤， 病毒難以有效擴(kuò)散至轉(zhuǎn)移灶， 因此治療效果欠佳， 這也是目前溶瘤病毒治療膠質(zhì)瘤普遍面臨的問題［6］. 若實(shí)現(xiàn)溶瘤腺病毒靜脈全身給藥， 需改變?nèi)芰鱿俨《驹镜母腥拘再|(zhì)， 使其具有血腦屏障及惡性膠質(zhì)瘤的雙重靶向性.

溶瘤腺病毒多由人5型腺病毒（Ad5）經(jīng)改造而成， 稱為條件復(fù)制型Ad5（CRAd5）［7］. Ad5感染細(xì)胞依賴于其纖維蛋白（fiber）和細(xì)胞表面柯薩奇-腺病毒受體（coxsackie and adenovirus receptor， CAR）的結(jié)合， 從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的感染［8］. 然而， CAR在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平通常較低， 正常組織細(xì)胞顯著高于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的CAR表達(dá)量［9］. 這種特性導(dǎo)致溶瘤腺病毒在靶向感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞時(shí)效果不佳， 嚴(yán)重限制了其在惡性膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用. 因此， 通過基因工程手段對溶瘤腺病毒衣殼進(jìn)行遺傳修飾， 構(gòu)建新的衣殼修飾型溶瘤腺病毒， 使其具有更適合應(yīng)用于惡性膠質(zhì)瘤治療的性質(zhì)， 提升溶瘤腺病毒對惡性膠質(zhì)瘤的治療效果.

由于不同亞群的腺病毒纖維蛋白序列和結(jié)構(gòu)具有差異性， 因此來自不同亞群甚至不同型別的腺病毒感染所依賴的受體不同［10］. 其中來自B 亞群的Ad37可通過唾液酸作為受體感染細(xì)胞. 唾液酸是神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要生物學(xué)功能的分子， 在腦內(nèi)高豐度存在， 而且唾液酸的表達(dá)量和腫瘤的惡性程度正相關(guān)， 腫瘤惡性程度越高， 唾液酸表達(dá)越多［11-12］. 基于此， 本文通過使用Ad37 的knob 替換Ad5 的knob， 構(gòu)建fiber-knob 替換型溶瘤腺病毒載體， 以使其具備用唾液酸作為感染受體的性質(zhì)， 實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的感染性， 并在一定程度上提升溶瘤病毒靜脈給藥后對血腦屏障的靶向及穿透能力.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 唾液酸表達(dá)水平分析

細(xì)胞生長至對數(shù)生長階段， 用胰酶消化后， 用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞2次， 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)， 取1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn). 加入生物素標(biāo)記的唾液酸抗體， 4 ℃孵育1 h后， 用預(yù)冷的PBS洗滌2次， 加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的鏈霉素， 4 ℃孵育30 min， 再用預(yù)冷的PBS洗滌2次， PBS重懸細(xì)胞， 流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測.

1.2 病毒感染性檢測

用相同劑量感染細(xì)胞， 在感染16 h后， 用熒光顯微鏡觀察紅色熒光蛋白（RFP）的表達(dá)， 并在相同拍攝條件（如曝光、 曝光時(shí)間和激發(fā)光強(qiáng)等）下拍照. 成像后， 用不加乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化細(xì)胞， 利用流式細(xì)胞術(shù)分析RFP的熒光強(qiáng)度.

1.3 細(xì)胞活力檢測

采用噻唑藍(lán)（MTT）法測定細(xì)胞活力. 病毒以不同劑量感染細(xì)胞， 37 ℃培養(yǎng)72 h后， 加入MTT， 避光孵育4 h， 加入二甲基亞砜（DMSO）溶解藍(lán)色顆粒， 在490 nm處檢測吸收值. 細(xì)胞活力計(jì)算公式為

細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組OD490-背景值對照組OD490-背景值×100%.

每種病毒每次感染劑量設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔.

1.4 穿透血腦屏障能力分析

將hCMEC/D3細(xì)胞在0.4 mm PTFE Transwell腔中培養(yǎng)6～7 d， 用伏特/歐姆計(jì)測定細(xì)胞的跨膜電阻（TEER）， 分析細(xì)胞單層膜的完整性和功能. 當(dāng)TEERgt;50 Ω/cm2時(shí)， 在該模型中評估溶瘤腺病毒跨hCMEC/D3細(xì)胞層的轉(zhuǎn)運(yùn)能力. 將病毒加入Transwell細(xì)胞層上側(cè)培養(yǎng)基中， 37 ℃孵育4 h后， 檢測細(xì)胞層下側(cè)（基側(cè)）培養(yǎng)基中的病毒量.

1.5 體內(nèi)靶向?qū)嶒?yàn)

用18～20 g雌性Balb/c裸鼠建立模型. 小鼠先腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉劑（10 mg/mL生理鹽水）， 劑量為每10 g體質(zhì)量給藥100 μL. 小鼠深度麻醉后， 固定在腦立體鏡上， 用手術(shù)刀使頭頂皮膚露出顱骨. 根據(jù)小鼠腦圖， 將U87細(xì)胞（5×105個(gè)細(xì)胞， 5 μL）注射到所需部位（x=+2.5 mm， y=+0.5 mm， z=-3.5 mm）. 縫合小鼠的傷口， 并注射青霉素以防止細(xì)菌感染. 腫瘤接種7 d后， 經(jīng)尾靜脈注射1×1011 VPs（病毒顆粒數(shù)）溶瘤病毒. 5 d后， 通過小鼠腫瘤組織內(nèi)溶瘤病毒RFP的表達(dá)進(jìn)行活體成像， 分析溶瘤病毒的靶向作用.

1.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

用Graphpad進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖， 使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析. 采用T-test檢驗(yàn)對兩組進(jìn)行比較. 在對兩個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)集的顯著性進(jìn)行分析時(shí)， 采用單因素方差分析和Newman-Keuls檢驗(yàn). 當(dāng)Plt;0.05時(shí)， 其組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 唾液酸在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平分析

為評價(jià)唾液酸在不同類型和種屬腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平， 先分析膠質(zhì)瘤、 肝癌和乳腺癌， 再分別選擇人腫瘤細(xì)胞和小鼠腫瘤細(xì)胞， 對各表面的唾液酸表達(dá)水平進(jìn)行檢測， 結(jié)果如圖1所示. 由圖1可見， 人腫瘤細(xì)胞均顯著高于小鼠細(xì)胞中唾液酸的表達(dá)水平（***， Plt;0.001）， 為Ad5/K37溶瘤腺病毒的體內(nèi)外評價(jià)提供了種屬提示.

2.2 Ad5/K37在不同腫瘤細(xì)胞中的感染性質(zhì)分析

與Ad5相比， 為探究Ad5/K37對不同腫瘤細(xì)胞的感染性質(zhì)是否發(fā)生改變， 分別評價(jià)10個(gè)不同的人腫瘤細(xì)胞系和5個(gè)小鼠腫瘤細(xì)胞系， 分別利用Ad5和Ad5/K37在相同感染滴度下感染細(xì)胞， 結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見， 在10個(gè)不同人腫瘤細(xì)胞系中， 除A2780細(xì)胞外， Ad5/K37均能顯著提升對腫瘤細(xì)胞的感染性（*， Plt;0.05; **， Plt;0.01）， 尤其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中， 對細(xì)胞的感染率提升了12.42倍. 在小鼠腫瘤細(xì)胞中， 與Ad5相比， Ad5/K37能顯著增加對細(xì)胞的感染能力， 最高提升4.75倍（圖2）. 表明通過knob37替換后得到的Ad5/K37在人腫瘤細(xì)胞和小鼠腫瘤細(xì)胞中均能顯著增加溶瘤腺病毒對腫瘤細(xì)胞的感染性.

2.3 體外殺傷活性評價(jià)

選擇6個(gè)不同人腫瘤細(xì)胞系， 分別利用Ad5和Ad5/K37的不同滴度感染細(xì)胞， 在感染72 h后檢測細(xì)胞活力， 結(jié)果如圖3和表1所示. 由圖3可見， 在不同腫瘤細(xì)胞中， Ad5/K37均具有顯著的殺傷活性， 如在膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中， Ad5/K37顯著高于Ad5的殺傷效果， 通過計(jì)算EC50值（表1）可見， 達(dá)到EC50的Ad5/K37顯著低于Ad5的MOI值， Ad5組是Ad5/K37組EC50值的28.5倍， 進(jìn)一步證明Ad5/K37增強(qiáng)了對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力.

2.4 靶向能力評價(jià)

為確定Ad5/K37增強(qiáng)細(xì)胞感染性是否僅針對腫瘤細(xì)胞， 是否更有可能具有靶向感染腦部細(xì)胞的性質(zhì)， 利用Ad5/K37在體外以相同的MOI感染人腎細(xì)胞（HEK293）、 人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（hCMECD/3）和膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U87）， 結(jié)果如圖4所示." 由圖4可見， Ad5/K37具有明顯的腦細(xì)胞靶向性， 可較好地感染hCMECD/3細(xì)胞和U87細(xì)胞. 此外， 用相同MOI的Ad5和Ad5/K37分別感染hCMECD/3細(xì)胞， 發(fā)現(xiàn)Ad5/K37對hCMECD/3的感染性顯著高于Ad5， 提高了21.13倍， 表明該修飾后的Ad5/K37能實(shí)現(xiàn)靶向感染腦部細(xì)胞的預(yù)期.

為進(jìn)一步驗(yàn)證該腦靶向效應(yīng)是否可穿過血腦屏障， 利用hCMEC/D3細(xì)胞在體外建立血腦屏障模型. 當(dāng)hCMEC/D3細(xì)胞生長到TEERgt;50 Ω/cm2時(shí)， 將病毒加入細(xì)胞培養(yǎng)基的上層孵育4 h. 收集下層培養(yǎng)基， 對下層穿透細(xì)胞屏障的病毒進(jìn)行定量分析， 結(jié)果如圖5所示. 由圖5可見，" 病毒孵育4 h后， 血腦屏障細(xì)胞的電阻無明顯變化， 說明病毒并未破壞血腦屏障. 與Ad5相比， Ad5/K37在下層可檢測到更多病毒數(shù)， 說明Ad5/K37能增強(qiáng)其穿透血腦屏障的能力.

為評價(jià)Ad5/K37在體內(nèi)對膠質(zhì)瘤的靶向能力， 利用U87細(xì)胞系建立BALB/c裸鼠顱內(nèi)荷瘤模型， 通過靜脈注射溶瘤腺病毒進(jìn)行治療， 5 d后， 通過檢測病毒載量和病毒的RFP表達(dá)分析Ad5/K37穿透血腦屏障的能力和腫瘤靶向能力， 結(jié)果如圖6所示. 由圖6可見， Ad5/K37在顱內(nèi)荷瘤小鼠模型中未提高穿透血腦屏障的能力， 由于Ad5/K37在小鼠各組織器官中的分布均少于Ad5， 因此， 在體內(nèi)Ad5/K37可降低溶瘤腺病毒對正常組織器官的感染， 但未顯著提高血腦屏障穿透能力.

綜上所述， 通過對人5型溶瘤腺病毒knob區(qū)域進(jìn)行嵌合替換， 改變?nèi)芰鱿俨《镜母腥拘裕?顯著提升了溶瘤腺病毒對多種CAR低表達(dá)腫瘤細(xì)胞的感染能力， 顯著增強(qiáng)了對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性， 并增強(qiáng)了對腦部細(xì)胞的感染性. 在體外血腦屏障模型中， Ad5/K37病毒可有效穿過血腦屏障. 在體內(nèi)腦原位膠質(zhì)瘤的靶向?qū)嶒?yàn)中并未發(fā)現(xiàn)Ad5/K37能有效穿過血腦屏障而到達(dá)腫瘤部位， 這可能與種屬差異有關(guān)， 由于在小鼠模型中人腺病毒不能較好地實(shí)現(xiàn)腦組織靶向性， 因此將利用其他動物模型進(jìn)一步分析評價(jià)Ad5/K37在體內(nèi)的靶向性. 此外， 通過體內(nèi)靶向?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)， Ad5/K37可減少病毒在體內(nèi)其他臟器中的病毒富集量， 從而減少病毒的組織毒性， 有利于Ad5/K37在體內(nèi)腫瘤治療的應(yīng)用.

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（責(zé)任編輯： 單 凝）