高效液相色譜法測(cè)定荔枝酒中山梨酸含量的不確定度評(píng)定

摘 要：目的：評(píng)定高效液相色譜法測(cè)定荔枝酒中山梨酸含量的不確定度。方法：按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）進(jìn)行檢測(cè)，并依據(jù)測(cè)量不確定度的規(guī)程要求，構(gòu)建數(shù)學(xué)模型和評(píng)估方法，分析不確定度來(lái)源并進(jìn)行計(jì)算、合成。結(jié)果：荔枝酒中山梨酸含量為

0.178 6 g·kg-1，擴(kuò)展不確定度為0.011 6 g·kg-1（置信概率P=95%，k=2）。結(jié)論：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度以及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合是不確定度的主要來(lái)源，測(cè)定時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制這些因素，以提升檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：不確定度；山梨酸；高效液相色譜；荔枝酒

Evaluation of Uncertainty in the Determination of Sorbic Acid Content in Litchi Wine by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Yanshao， ZHOU Tingting， TANG Fengqiao， LI Xiaomei， LIN Cailan*

（Lingshan County Product Quality Inspection Center， Qinzhou 535499， China）

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty of determination of sorbic acid in litchi wine by high performance liquid chromatography. Method： According to the GB 5009.28—2016， a mathematical model and evaluation method were constructed according to the requirements of the procedure for measuring uncertainty， and the sources of uncertainty were analyzed， calculated and synthesized. Result： The content of sorbic acid in litchi wine was 0.178 6 g·kg-1， and the extended uncertainty was 0.011 6 g·kg-1 （confidence probability P=95%， k=2）. Conclusion： The purity of reference material and the fitting of standard working curve are the main sources of uncertainty， and these factors should be strictly controlled to improve the accuracy of detection results.

Keywords： uncertainty; sorbic acid; high performance liquid chromatography; litchi wine

荔枝酒是以新鮮荔枝為原料，經(jīng)發(fā)酵或浸泡等工藝釀制而成的果酒[1]，其色澤晶瑩，帶有濃郁的荔枝果香[2]，口感醇厚甘甜，既保留了荔枝的風(fēng)味，又增添了酒的韻味，是一款獨(dú)具特色的飲品。受荔枝酒原料本身的熱敏性、易褐變等因素的影響[3]，其易發(fā)生酸敗影響口感，當(dāng)前常在荔枝酒中添加適量的山梨酸以防腐保鮮[4]。山梨酸能抑制微生物生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荔枝酒的保質(zhì)期，防止酒在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中因微生物滋生而變質(zhì)，能夠確保產(chǎn)品在一定時(shí)間內(nèi)保持較好的品質(zhì)和口感。但山梨酸添加過(guò)量可能對(duì)人體產(chǎn)生危害[5]，如過(guò)敏反應(yīng)、影響人體新陳代謝等[6-10]，

因此準(zhǔn)確測(cè)定荔枝酒中的山梨酸含量可確保產(chǎn)品符合安全標(biāo)準(zhǔn)，保障消費(fèi)者健康，而且有助于企業(yè)規(guī)范使用食品添加劑，促進(jìn)荔枝酒行業(yè)健康發(fā)展。

為明確測(cè)定結(jié)果可靠程度及判斷數(shù)據(jù)質(zhì)量，本文依照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）中高效液相色譜法，對(duì)荔枝酒中的山梨酸含量進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012），對(duì)實(shí)驗(yàn)中各影響因素所引入的不確定度進(jìn)行評(píng)定。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

荔枝酒樣品，超市購(gòu)買。

甲醇（色譜純），天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；乙酸銨（優(yōu)級(jí)純），上海麥克林生化科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)純水，阿修羅超純水機(jī)制備；水相微孔濾膜（0.22 μm）；水中山梨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[濃度為1.00 mg·mL-1，編號(hào)為GBW（E）100007]，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Ultimate 3000），美國(guó)賽默飛世爾公司；電子分析天平（FA2004），上海衡平儀器儀表廠；移液器，德國(guó)BRAND公司。

1.3 液相色譜條件

C18型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇與乙酸銨溶液的混合液（5∶95，V/V）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL；流速為1 mL·min-1。

1.4 樣品前處理

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）第一法液相色譜法測(cè)定荔枝酒中山梨酸含量。準(zhǔn)確稱取2 g（精確到0.000 1 g）荔枝酒置于50 mL容量瓶中，用純水定容至刻度線，充分搖勻后，移取適量的上清液，采用0.22 μm的水相微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，從而得到上機(jī)待測(cè)液。

1.5 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

準(zhǔn)確移取2.0 mL濃度為1.00 mg·mL-1的山梨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，將其置于10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度線，制得濃度為0.2 mg·mL-1的山梨酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。分別移取0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 mL和1.250 mL的山梨酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，依次置于5 mL容量瓶中，并用純水定容至刻度線，配制成濃度分別為0.005、0.010、0.020、0.030、

0.040 mg·mL-1和0.050 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.6 數(shù)學(xué)模型

按照GB 5009.28—2016中液相色譜法，計(jì)算荔枝酒中山梨酸含量的公式為

（1）

式中：X為荔枝酒樣品中的山梨酸含量，g·kg-1；ρ為通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的樣品待測(cè)液中山梨酸的質(zhì)量濃度，mg·L-1；V為樣品的定容體積，mL；m為樣品的稱樣量，g；1 000為換算因子。

1.7 不確定度來(lái)源

在測(cè)定荔枝酒中的山梨酸含量時(shí)，不確定度有諸多來(lái)源。①樣品前處理引入的不確定度。②標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度。③標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度。④樣品重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度。根據(jù)各種不確定度分量繪制來(lái)源因果分析圖，如圖1所示。

圖1 不確定度來(lái)源因果分析圖

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.1.1 樣品稱量引入的不確定度

荔枝酒樣品稱量2.0 g，查檢定證書，稱量樣品使用的電子天平（FA2004）的精準(zhǔn)度為0.000 1 g，

偏載誤差為±0.000 2 g，以均勻分布進(jìn)行考量，k=。

則在稱量過(guò)程中所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

樣品稱量所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.1.2 樣品定容引入的不確定度

處理樣品時(shí)，將搖勻后的樣品用50 mL的A級(jí)容量瓶進(jìn)行定容，根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）可知，50 mL容量瓶的允許誤差為±0.05 mL，此時(shí)采用B類評(píng)定方法，按照均勻分布考慮，k=。

則樣品定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

樣品定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.1.3 樣品在定容過(guò)程中溫度變化引入的不確定度

實(shí)驗(yàn)室溫度嚴(yán)格控制在（20±5）℃，即溫度變化量ΔT為5 ℃。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所使用純水的體積膨脹系數(shù)α取值為2.1×10-4 ℃-1，按照均勻分布考慮，k=。

使用50 mL容量瓶進(jìn)行定容，則溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜合上述3個(gè)分量，荔枝酒樣品在進(jìn)行前處理時(shí)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度

本實(shí)驗(yàn)所使用的是水中山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)查閱標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書后得知，其濃度值為1.00 mg·mL-1，此標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2%，包含因子k=2。

則山梨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2 配制標(biāo)準(zhǔn)中間工作液引入的不確定度

用移液器（規(guī)格為500～5 000 μL）移取2.0 mL山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度線，配制成0.2 mg·mL-1的山梨酸標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。查此移液器的檢定證書，顯示2.0 mL校準(zhǔn)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度U=0.004 mL（k=2），考慮到移取的體積小，溫度效應(yīng)忽略不計(jì)。

則使用10 mL容量瓶定容配制標(biāo)準(zhǔn)中間工作液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.3 配制標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線溶液引入的不確定度

用移液器（規(guī)格為100～1 000 μL）分別移取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.125、0.250、0.500、0.750、

1.000 mL和1.250 mL至5 mL容量瓶中，用純水定容至刻度線，即可得到相應(yīng)的各點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線濃度。查此移液器的檢定證書，因移液器采用多點(diǎn)校準(zhǔn)方法進(jìn)行檢定，所以在移取不同體積時(shí)具有不同的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液過(guò)程中移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果見表1。

根據(jù)表1中計(jì)算得到的各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，考慮到移取的體積小，溫度效應(yīng)忽略不計(jì)，在此情況下，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中移液器引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜合上述3個(gè)分量，山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在配制過(guò)程中所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本實(shí)驗(yàn)配制了6個(gè)不同濃度梯度的山梨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，并對(duì)荔枝酒樣品進(jìn)行了6次平行測(cè)定。運(yùn)用最小二乘法，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合操作，經(jīng)擬合后得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為y=1 175.5x-0.000 03，截距a=

-0.000 03，斜率b=1 175.5，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 7。測(cè)得的峰面積與樣品濃度結(jié)果見表2。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差以及線性擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式分別為

（2）

（3）

式中：b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，b=1 175.5；p為被測(cè)樣品的測(cè)定次數(shù)，p=6；n則是山梨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的測(cè)定次數(shù)，n=6；Ai為峰面積；Ay為標(biāo)準(zhǔn)峰計(jì)算值；為

荔枝酒樣品濃度的平均值，=0.007 47 mg·mL-1；為山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度平均值，=0.025 8 mg·mL-1；Ci為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值，mg·mL-1。

代入數(shù)據(jù)，得到標(biāo)準(zhǔn)工作溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差為

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4 樣品重復(fù)性測(cè)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本實(shí)驗(yàn)考察了儀器測(cè)試穩(wěn)定性，對(duì)荔枝酒樣品中的山梨酸含量進(jìn)行6次重復(fù)性測(cè)定，所得結(jié)果

見表3。

由表3數(shù)據(jù)可得，樣品重復(fù)性測(cè)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度

采用高效液相色譜法測(cè)定荔枝酒中的山梨酸含量，其不確定度的來(lái)源及各分量的匯總結(jié)果見表4。

則荔枝酒樣品中測(cè)定山梨酸含量的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

樣品中山梨酸含量的平均值X=0.178 6 g·kg-1，則其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

取置信區(qū)間為95%，包含因子k=2，則其擴(kuò)展不確定度為

因此，在置信概率為95%，k=2時(shí)，本實(shí)驗(yàn)荔枝酒中的山梨酸含量的測(cè)量不確定度可表示為（0.178 6±

0.011 6）g·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

本研究對(duì)高效液相色譜法測(cè)定荔枝酒中山梨酸含量的不確定度進(jìn)行評(píng)定。經(jīng)分析可知，在測(cè)定過(guò)程中，由山梨酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度影響最為顯著，山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制所帶來(lái)的不確定度次之?；诖?，在后續(xù)的實(shí)際測(cè)量中，為有效提升測(cè)定的準(zhǔn)確度，應(yīng)選用相對(duì)擴(kuò)展不確定度較低的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，增加標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度點(diǎn)數(shù)量，從而提高曲線的準(zhǔn)確性。同時(shí)，對(duì)每個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行多次測(cè)量，以減少測(cè)量過(guò)程中的隨機(jī)誤差。此外，還需定期對(duì)測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)。采取上述措施，能夠進(jìn)一步降低測(cè)定結(jié)果的不確定度，切實(shí)提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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作者簡(jiǎn)介：張彥紹（1986—），男，廣西靈山人，本科，工程師。研究方向：化學(xué)工程、食品檢驗(yàn)及質(zhì)量控制。

通信作者：林彩蘭（1983—），女，廣西靈山人，本科，工程師。研究方向：食品工程、食品檢驗(yàn)及質(zhì)量控制。E-mail： 84981262@qq.com。