西瓜NPR基因家族的鑒定及其在鹽脅迫下的表達分析

摘" " 要：以擬南芥NPR基因家族成員蛋白序列為查詢序列，在西瓜基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定西瓜NPR基因家族成員，并對其進行生物信息學分析及鹽脅迫下的表達分析。共鑒定到4個成員，將其命名為ClNPR1～ClNPR4，其編碼蛋白的理化性質、保守功能結構域、重要氨基酸殘基及motif分析結果與其他物種有較高的一致性，順式作用元件分析顯示，ClNPRs與非生物脅迫相關。300 mmol·L-1 NaCl處理耐鹽材料和鹽敏感材料，分別取鹽脅迫0、8、24 h的葉片進行4個NPR基因的表達模式分析，結果表明，ClNPR1在鹽敏感和耐鹽材料中都顯著上調表達，但鹽脅迫24 h，ClNPR1在鹽敏感材料中顯著下調表達，在耐鹽材料中雖然下調但還保持較高的表達水平，且在耐鹽材料中的表達量顯著高于鹽敏感材料；鹽脅迫24 h，ClNPR2和ClNPR3在鹽敏感和耐鹽材料中都顯著上調表達，在耐鹽材料中的表達量均顯著高于鹽敏感材料。推測ClNPRs基因在西瓜響應鹽脅迫的過程中扮演重要角色。

關鍵詞：西瓜；NPR家族蛋白；鹽脅迫；表達

中圖分類號：S651 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）01-016-09

Identification of NPR gene family and its expression under salt stress in watermelon

JIA Yunhe

（Horticulture Branch， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150069， Heilongjiang， China）

Abstract： Using Arabidopsis NPR gene family members as query sequences， watermelon NPR gene family members were identified in watermelon genome database， and their bioinformatics and expression under salt stress were analyzed. A total of four members were identified and named ClNPR1-ClNPR4. Their physicochemical properties， conserved functional domains， important amino acid residues and motif analysis had high consistency with those reported in other species. Cis-acting element analysis showed that NPR gene was associated with abiotic stress in watermelon. Salt-tolerant and salt-sensitive material were treated with 300 mmol·L-1 NaCl， and the expression patterns of 4 NPR genes were analyzed in leaves under salt stress for 0， 8 and 24 h. The results showed that the expression of ClNPR1 was significantly up-regulated in both salt-sensitive and salt-tolerant materials， but the expression of ClNPR1 was significantly down-regulated in salt-sensitive materials for 24 h under salt stress. The expression level of ClNPR1 was significantly higher in salt-tolerant materials than in salt-sensitive materials. After 24 h of salt stress， ClNPR2 and ClNPR3 were significantly up-regulated in both salt-sensitive and salt-tolerant materials， and their expression level in salt-tolerant materials were significantly higher than those in salt-sensitive materials. It is speculated that ClNPRs play an important role in watermelon response to salt stress.

Key words： Watermelon; NPR family protein; Salt stress; Expression

我國是全球西瓜生產(chǎn)與消費第一大國。據(jù)FAO統(tǒng)計，2020年我國西瓜種植面積140.59萬hm2，占全球的46.05%；產(chǎn)量6 024.69萬t，占全球的59.29%，面積和產(chǎn)量均居世界第1位[1]。2021年產(chǎn)量達6 101.4萬t[2]。西瓜在土壤含鹽量0.2%以下時可以正常生長[3]，可以利用鹽堿地土壤富含鉀的特點種植出高品質西瓜[4]。然而，土壤含鹽量高于0.3%的鹽脅迫會導致西瓜減產(chǎn)25%～35%[5]，西瓜幼苗的耐鹽性更弱[6]。我國天然鹽堿地的面積約為14.8億hm2，由于肥水的不合理應用造成的次生鹽漬化土壤面積不斷增加[7]，鹽脅迫嚴重制約著我國西瓜優(yōu)質高效可持續(xù)性發(fā)展。

鹽脅迫會對植物產(chǎn)生滲透脅迫和離子毒害[8]；過氧化氫和丙二醛的含量顯著增加[9]，形成氧化脅迫，破壞細胞膜[10]；造成氣孔關閉，光合作用效率下降[11]。植物會對鹽脅迫產(chǎn)生響應，如調節(jié) Ca2+水平、維持較高的K+/Na+離子比率進行離子平衡，降低Na+的積累[12]；積累脯氨酸進行滲透調節(jié)[13]；提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性來清除活性氧[14]；多種激素通過協(xié)同或拮抗作用參與植物鹽脅迫的響應[15]。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，已經(jīng)從水稻[16]、玉米[17]、小麥[18]、擬南芥[19]等多種作物中鑒定到鹽脅迫響應基因。NaCl脅迫處理后，與二倍體相比，四倍體西瓜幼苗受DNA超甲基化調控發(fā)生了一些基因的上調表達[20]。通過RNA-seq分析，共鑒定出21 069個基因，KEGG表明，一個TCP 轉錄因子在根和葉中同時存在，推測其可能受miR319調控，從而提高西瓜的耐鹽性[21]。轉錄組學和代謝組學聯(lián)合分析揭示了鹽脅迫后使用外源海藻糖處理，西瓜幼苗根系bHLH家族轉錄因子在緩解鹽脅迫過程中發(fā)揮了重要作用[22]。西瓜7個ClTPS基因廣泛表達于根、莖、葉、花，鹽脅迫對ClTPS3的誘導作用顯著，ClTPS3過表達擬南芥的耐鹽性顯著提高[23]。

NPR1（non-expressor of PR genes）是植物水楊酸（SA，salicylic acid）信號通路的重要組成部分；也參與了水楊酸與茉莉酸/乙烯信號途徑的相互作用[24]。NPR基因為組成型表達，NPR蛋白以寡聚體形式存在于細胞質中，當植物細胞內(nèi)SA濃度上升時，寡聚體NPR發(fā)生解聚并進入到細胞核中，繼而在植物系統(tǒng)獲得抗性、PR基因表達等過程中發(fā)揮作用[25]。在擬南芥中，NPR基因家族共有6個成員：NPR1、NPR2、NPR3、NPR4、BOP2/NPR5和BOP1/NPR6 [26-28]。NPR蛋白含有3個典型的結構域，分別是位于N端的BTB/POZ結構域、位于中心區(qū)域的多個錨蛋白重復序列（ANK repeat）和位于C端NPR1_like_C結構域[29]。擬南芥的6個NPR 蛋白家族成員根據(jù)進化關系及功能分成三類，AtNPR1和AtNPR2為第一類，是水楊酸的受體蛋白，對水楊酸介導的植物免疫反應有正調控作用；AtNPR3和AtNPR4為第二類，同樣作為水楊酸的受體蛋白，但對擬南芥抗病過程起負調控作用[19，30]；AtNPR5和AtNPR6為第三類，蛋白C端不含 NPR1_like_C 結構域，參與葉、花發(fā)育。NPR1基因在植物抗病過程中發(fā)揮重要作用。在蘋果中發(fā)現(xiàn)8個NPR1同源基因，經(jīng)過分析鑒定，蘋果NPR蛋白同樣可以被分成三類，分類結果與擬南芥類似，在接種后的抗感品種中表達量差異顯著[31]。在水稻中鑒定到3個NPR1同源基因，參與不同的抗病反應[32]。在香蕉中鑒定出15個NPR基因，其中MaNPR4和MaNPR11基因參與香蕉抗枯萎病過程[33]。在低溫下，細胞質NPR1寡聚物釋放單體，并轉運到細胞核，與熱休克轉錄因子1（HSFA1）相互作用，促進耐冷基因的表達，提高擬南芥的耐冷性[34]。

關于植物NPR蛋白對非生物脅迫響應的研究較少，筆者利用生物信息學方法鑒定西瓜NPR基因，分析其結構，探究其在鹽脅迫下的表達模式，以期為挖掘耐鹽相關基因、探究西瓜耐鹽分子機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 西瓜NPR基因家族成員鑒定

在西瓜基因組數(shù)據(jù)庫CuGenDBv2（cucurbitgenomics.org）中，以6個已報道的擬南芥NPR蛋白為查詢序列進行BLASTP搜索（E 值≤1×10-5）。通過SMART網(wǎng)站分析所得西瓜NPR成員蛋白序列結構域，去除冗余序列。利用在線網(wǎng)頁ExPASy（http：//web. expasy.org/ protparam/）對西瓜NPR蛋白序列的分子質量、理論等電點、穩(wěn)定性、亞細胞定位等進行預測分析。

1.2 西瓜NPR家族成員的系統(tǒng)發(fā)育及結構分析

從TAIR （https：//www. arabidopsis.org/）下載6個擬南芥NPR蛋白的氨基酸序列。使用MEGA X 軟件，輸入西瓜和擬南芥的NPR蛋白序列，使用MUSCLE進行多序列比對，輸出數(shù)據(jù)以MEGA格式保存，采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復值為1000，用iTOL （https：//iTOL .embl.de/）對系統(tǒng)發(fā)育樹進行可視化。

從西瓜基因組中獲得NPR家族成員的外顯子、內(nèi)含子位置，使用MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite. org/）預測西瓜NPR蛋白中的保守基序，參數(shù)設置如下：最大基序數(shù)為10，最小圖案寬度為6，最大圖案寬度為100。使用NCBI保守結構域數(shù)據(jù)庫CDD （https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）進行結構域分析，確定所有西瓜NPR蛋白序列的結構域類型和位置。通過PlantCARE（http：//bioin‐ formatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）在線網(wǎng)站對家族成員上游2000 bp啟動子序列的順式作用元件進行預測。利用TBtools軟件對西瓜NPR成員的保守基序、外顯子-內(nèi)含子結構及順式作用元件進行可視化分析。

1.3 西瓜NPR家族成員的多序列比對及共線性分析

經(jīng)過CLUSTALW分析和Espript可視化，多序列比對西瓜、擬南芥及水稻的NPR家族成員。運用TBtools軟件的McScanX 功能對西瓜、甜瓜及擬南芥基因組進行共線性分析。

1.4 西瓜NPR家族成員在鹽脅迫下的轉錄組分析

試驗材料為前期篩選到的西瓜耐鹽材料和鹽敏感材料。于2024年2月在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院園藝分院溫室中使用無菌基質播種育苗。耐鹽材料為野生西瓜PI296341，鹽敏感材料為栽培品種分離出的純合自交系。在幼苗2葉1心時，將育苗花盆置于托盤中，對照組澆清水，處理組澆300 mmol·L-1 NaCl溶液。分別采集鹽脅迫0、8、24 h的耐鹽材料和鹽敏感材料幼苗葉片樣品，-80 ℃冷凍保存。鹽脅迫0、8 h的耐鹽材料和鹽敏感材料樣品送華大基因公司測序。從轉錄組數(shù)據(jù)庫中提取西瓜NPR基因的FPKM（每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長度的fragments數(shù)），通過計算3個生物學重復值平均數(shù)獲得每個處理表達量值。

1.5 西瓜NPR基因家族成員在鹽脅迫下的表達驗證

使用Primer Premier 5.0軟件設計4對NPR基因熒光標記定量引物，1對內(nèi)參基因特異性引物（表1）。使用北京百泰克RNA提取試劑盒從耐鹽材料和鹽敏感材料的葉片中提取總RNA，在Veriti96 孔熱循環(huán)儀（ABI，美國）中進行逆轉錄。qRT-PCR試驗在QuantStudio 7 Flex實時熒光定量 PCR 儀上進行（ABI，美國）。反應體系10 μL：2×SYBR Premix EX TaqTM 5μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL、ddH2O 3.2 μL。PCR擴增反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)。對熔解曲線進行分析，以驗證數(shù)據(jù)的準確性，熒光定量試驗進行3次重復。采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析，采用Excel軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 西瓜ClNPR基因家族鑒定

在西瓜基因組數(shù)據(jù)庫中搜索NPR蛋白，經(jīng)過SMART網(wǎng)站鑒定，西瓜基因組中共有4個NPR基因，分別位于01、04、07、10號染色體，分別命名為ClNPR1、ClNPR2、ClNPR3、ClNPR4。每個基因編碼蛋白的具體理化性質見表2。ClNPR1和ClNPR3基因編碼的蛋白含有保守的BTB/POZ、ANK repeat、NPR1_Like_C結構域，而ClNPR2和ClNPR4基因編碼的蛋白無NPR1_Like_C結構域。編碼蛋白質含有475～590個氨基酸，分子質量51.77～65.68 kD、等電點5.99～6.28、穩(wěn)定系數(shù)41.02～54.62，亞細胞定位于細胞核內(nèi)。

2.2 西瓜NPR家族成員的系統(tǒng)發(fā)育及序列分析

利用MEGA X軟件對西瓜和擬南芥共10個NPR蛋白的全長序列進行比對，同時構建系統(tǒng)發(fā)育樹。從種間進化樹分支情況看，西瓜中4個NPR蛋白在2個分支中各有2個成員，其中ClNPR1和ClNPR3聚在一起，ClNPR2和ClNPR4聚在一起（圖1）。

西瓜ClNPR基因家族序列分析表明，ClNPR1和ClNPR3基因DNA序列含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，編碼區(qū)包括3個domain，domain由10個motif組成。ClNPR2和ClNPR4基因DNA序列含有2個外顯子和1個內(nèi)含子，編碼區(qū)包括2個domain，domain由8個motif組成（圖2）。

對ClNPRs基因5’端上游2000 bp的序列分析發(fā)現(xiàn)，與其發(fā)生作用的順式元件主要與激素（茉莉酸13個、水楊酸4個、生長素4個、赤霉素2個、ABA2個）、MYB（2個）、防御與脅迫（2個）、光響應（11個）等相關（圖2、圖3）。

2.3 西瓜NPR家族成員的多序列比對及共線性分析

經(jīng)過CLUSTALW分析和Espript可視化，多序列比對顯示，NPR蛋白重要的功能結構域、氨基酸殘基在多物種間高度保守，表明NPR基因在植物中行使相似功能（圖4）。西瓜、甜瓜、擬南芥基因組共線性分析表明，ClNPR3和ClNPR4與甜瓜、擬南芥存在共線性（圖5）。

2.4 西瓜ClNPR基因家族轉錄組分析

為了解西瓜NPR基因家族成員對鹽脅迫的響應模式，從轉錄組數(shù)據(jù)中查找4個NPR基因的FPKM值，分析4個基因在NaCl處理下的表達情況（圖6）。結果表明，與清水對照相比，NaCl脅迫處理8 h后，ClNPR1基因在鹽敏感和耐鹽材料中均上調表達，且耐鹽材料的表達量顯著高于鹽敏感材料，清水對照的耐鹽材料的ClNPR1基因表達量顯著高于鹽敏感材料；ClNPR2和ClNPR3基因的表達趨勢與ClNPR1基因相似，但鹽敏感材料和耐鹽材料之間無顯著差異；與清水對照相比，NaCl脅迫處理8 h后，ClNPR4基因在鹽敏感和耐鹽材料中都上調表達，但耐鹽材料的表達量顯著低于鹽敏感材料，且清水對照的耐鹽材料的ClNPR4基因表達量顯著低于鹽敏感材料。

2.5 西瓜ClNPR基因家族表達分析

qRT-PCR結果表明，與對照相比，NaCl脅迫8 h，ClNPR1基因在鹽敏感和耐鹽材料中都顯著上調表達；但鹽脅迫24 h，ClNPR1基因在鹽敏感材料中顯著下調表達，在耐鹽材料中雖然下調但還保持較高的表達水平，在耐鹽材料中的表達量顯著高于鹽敏感材料。NaCl脅迫24 h，ClNPR2和ClNPR3基因在鹽敏感和耐鹽材料中都上調表達，在耐鹽材料中的表達量顯著高于鹽敏感材料。NaCl脅迫后，ClNPR4基因在鹽敏感材料中顯著上調表達，在耐鹽材料中先上調再下調表達，且在耐鹽材料中的表達量顯著低于鹽敏感材料（圖7）。

3 討論與結論

筆者應用生物信息學分析的方法在西瓜基因組中鑒定出4個NPR基因，分別位于西瓜01、04、07、10號染色體。串聯(lián)重復在植物基因家族成員增加中起關鍵作用[35]，擬南芥基因組中包含6個NPR基因，分別位于1、2、3、4、5號染色體，其中AtNPR2（AT4G26120）和AtNPR4（AT4G19660）都位于4號染色體，表明擬南芥4號染色2個NPR基因為串聯(lián)重復產(chǎn)生；在生菜基因組中鑒定到4個NPR基因，3個位于5號染色體，1個位于8號染色體，表明生菜5號染色體的3個NPR基因為串聯(lián)重復產(chǎn)生[36]；西瓜NPR基因家族未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復和片段重復事件，說明4個ClNPR基因具有不同的起源。

植物中NPR蛋白家族具有3個保守結構域：BTB/POZ結構域、ANK repeat結構域和NPR1_like_C結構域。西瓜ClNPR基因家族序列分析表明，ClNPR1和ClNPR3編碼的蛋白包含BTB/POZ、ANK repeat和NPR1_like_C結構域，與AtNPR4（AT4G19660）、AtNPR3（AT5G45110）為同源基因；ClNPR2和ClNPR4編碼的蛋白缺少NPR1_like_C結構域，與AtNPR5（AT2G41370）、AtNPR6（AT3G57130）為同源基因；這可能由于NPR基因在進化過程中，不同成員間功能差異性造成的，推測ClNPR2和ClNPR4可能參與不同的生物進程[30-31]。motif 1、5、2、4組成BTB/POZ結構域，motif 6、3、9組成 ANK repeat domains結構域，motif 9、10組成C-Terminal結構域，motif 7屬于DUF（未知）結構域，這與前人的研究相符[37]。西瓜中4個NPR基因具有不同的外顯子和內(nèi)含子結構，說明他們表達時要進行選擇性剪切。研究表明，選擇性剪接在植物的生長發(fā)育過程以及響應非生物脅迫中發(fā)揮重要的調控作用[38]，在蘋果中，NPR正是通過選擇性剪切發(fā)揮抗病作用的[31]。Ser 11高度保守，因此西瓜4個NPR蛋白能夠在SAR誘導劑存在的情況下發(fā)生磷酸化，并參與調節(jié)植物的脅迫響應；Cys 82高度保守，在不受誘導的狀態(tài)下，NPR低聚體不會解聚成為單體進入核內(nèi)，不會誘導SAR的建立[37]。

擬南芥NPR1基因啟動子中存在3個W-box，能與SA誘導表達的 WRKY蛋白特異性結合，在轉錄水平對NPR1基因的表達進行調控[39]。對水稻中OsNPR1基因起始位點上游1005 bp啟動子區(qū)的順式作用元件分析表明，啟動子區(qū)包含W-box和ASF1，分別是轉錄因子WRKY和亮氨酸拉鏈（bZIP）的結合域，這兩個區(qū)域是SA誘導SAR所必需的[40]。CDK8和WRKY18蛋白與OsNPR1基因啟動子結合，不但促進了NPR1 表達，還促進了RNA聚合酶Ⅱ與NPR1靶基因PR1啟動子及其編碼區(qū)的結合，正調控其表達。NPR1在SA存在下，與RNA聚合酶Ⅱ一起富集CDK8、WRKY18和TGA 轉錄因子，從而促進自身表達以建立植物免疫的機制[41]。以上研究都表明植物NPR基因啟動子對于響應脅迫的作用至關重要。西瓜NPR基因家族的啟動子區(qū)存在許多和激素及防御相關的順式作用元件，所有基因均含有水楊酸響應元件，同時還鑒定出茉莉酸響應元件，這預示著西瓜NPR基因家族成員可能在植物逆境脅迫反應中發(fā)揮重要作用。

擬南芥npr1-5突變體，缺乏npr1依賴的SA信號通路，而nudt7（nudix hydrolase7），既表達npr1依賴的SA信號通路，也表達npr1獨立的SA信號通路。與野生型（Col-0）相比，npr1-5突變體對鹽脅迫敏感，而nudt7突變體則具有耐受性。與野生型和nudt7突變體相比，急性鹽脅迫導致npr1-5根的膜電位去極化最強，鈉和質子流入最多，鉀流失最多，且長期鹽脅迫導致npr1-5突變體莖部鈉含量最高，鉀含量最低。以上結果表明，依賴npr1的SA信號對控制Na+進入根組織及其隨后的長距離運輸?shù)角o部，以及防止鉀的流失至關重要，可見npr1依賴的SA信號通路是擬南芥耐鹽的核心[42]。在高粱中鑒定出5個NPR1基因，qRT-PCR表明，SbNPR1基因可能是高粱響應鹽脅迫的一個功能基因[43]。qRT-PCR表明，在大白菜中鑒定到11個NPR基因，均在鹽脅迫后6～12 h顯著表達，推斷大白菜BrNPR家族基因極可能參與了植物對鹽脅迫的響應，并起到正向調控的作用[44]。馬鈴薯StNPR4具有典型的NPR1家族的功能結構域，啟動子上具有響應生物脅迫和非生物脅迫的順式作用元件，受SA誘導表達，轉基因馬鈴薯在高鹽脅迫下生根率更高，說明StNPR4在馬鈴薯非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[45]。在本研究中，西瓜ClNPR1、ClNPR2、ClNPR3都在鹽脅迫后上調表達，且在耐鹽材料中的表達量高于鹽敏感材料，推測西瓜NPR基因為西瓜鹽脅迫響應途徑中的功能基因，此結果與前人的研究相互印證。

綜上所述，筆者在西瓜全基因組中鑒定出4個NPR基因，其編碼蛋白的理化性質、保守功能結構域、重要氨基酸殘基及motif分析結果與其他物種有較高的一致性，順式作用元件分析表明，西瓜NPR與非生物脅迫相關。ClNPRs基因在鹽脅迫24 h的鹽敏感材料和耐鹽材料中顯著差異表達，推測ClNPRs基因在西瓜響應鹽脅迫的過程中扮演重要角色。研究結果為挖掘耐鹽相關基因及探究西瓜耐鹽分子機制提供了參考依據(jù)。

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