一株雞滑液囊支原體的分離鑒定及藥物篩選

摘 要：為探究引起父母代種雞腿部癱瘓、關(guān)節(jié)腫脹的病原并制定有效的治療方案，本研究收集山東省某肉種雞場(chǎng)表現(xiàn)瘸腿、癱瘓癥狀的病雞，采用改良Frey氏培養(yǎng)基成功分離與純化了滑液囊支原體（Mycoplasma Synoviae， MS）。隨后，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了MS 16S rRNA基因序列，并進(jìn)行序列比對(duì)。同時(shí)采用MS野毒株P(guān)CR檢測(cè)試劑盒對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，并測(cè)定不同抗生素對(duì)分離菌株的最小抑菌濃度（MIC）和藥物的臨床應(yīng)用評(píng)估。結(jié)果顯示，從山東省某肉種雞場(chǎng)具有瘸腿、癱瘓癥狀的患病雞中成功分離并鑒定出一株MS，命名為MS-17103株。該菌株具有典型的支原體菌落形態(tài)，經(jīng)PCR鑒定為MS野毒株陽性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，MS-17103株對(duì)鹽酸沃尼妙林（MIC為0.00076 mg/L）和泰萬菌素（MIC為0.00153 mg/L）敏感。在感染過MS的種雞場(chǎng)進(jìn)行藥物應(yīng)用，結(jié)果顯示兩種藥物均能有效降低雞群感染MS的陽性率。本研究結(jié)果為后期該病的治療方案提供了重要的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：種雞；滑液囊支原體；分離鑒定；最小抑菌濃度（MIC）

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-1085（2025）01-0037-07

雞滑液囊支原體（Mycoplasma Synoviae，MS）可引起雞和火雞急性或慢性傳染性滑膜炎，對(duì)雞群的整體健康和生產(chǎn)性能造成嚴(yán)重影響。由于MS具有潛伏期長(zhǎng)、傳播途徑多樣、疫苗免疫接種效果不理想等特點(diǎn)，導(dǎo)致其難以凈化，在我國(guó)雞群中廣泛流行，尤其是近5年間，MS感染對(duì)我國(guó)的養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-4，18-19]。目前針對(duì)MS的防控，主要采取藥物控制和疫苗免疫兩種方法。然而，疫苗免疫的實(shí)際效果會(huì)受到疫苗質(zhì)量、免疫程序等多種因素的影響。因此，篩選治療MS的敏感藥物以制定合理的用藥方案，并加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和生物安全措施是防控該病的關(guān)鍵。

本研究收集山東省某父母代種雞場(chǎng)的18周齡發(fā)病種雞，臨床表現(xiàn)腳趾、腿跗關(guān)節(jié)處腫脹，發(fā)病率10%左右，剖檢可見炎性滲出物等病理變化，臨床疑似MS感染。為進(jìn)一步確診，取發(fā)病雞關(guān)節(jié)處病料分離培養(yǎng)病原、16S rRNA基因序列鑒定分析以及進(jìn)行藥物篩選試驗(yàn)，旨在篩選出敏感藥物，為后續(xù)支原體的防控治療提供重要的參考數(shù)據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試劑

改良Frey氏培養(yǎng)基，購(gòu)自北京中海生物科技有限公司；MS野毒株P(guān)CR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自青島英賽特生物科技有限公司；支原體基因組提取試劑盒、DL 2 000 DNA Maker，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2" 主要儀器

PCR儀（型號(hào)為T30），購(gòu)自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；電泳槽（型號(hào)為DYCP-31DN），購(gòu)自北京六一儀器公司；凝膠成像儀（型號(hào)為JY04S-3C），購(gòu)自北京君意東方公司；超凈臺(tái)（型號(hào)為BBS-SDC），購(gòu)自山東歐萊博醫(yī)療器械有限公司。

1.3" 病料來源

病料來自山東省某肉種雞場(chǎng)18周齡發(fā)病種雞，發(fā)病雞腳趾、腿跗關(guān)節(jié)處腫脹，剖檢可見炎性滲出物，見圖1。采集發(fā)病雞的關(guān)節(jié)液和肌腱組織用于病原分離鑒定。

1.4" 病原菌的分離與純化

取關(guān)節(jié)液、肌腱組織，按照體積比1：5加入改良Frey氏液體培養(yǎng)基，在勻漿器勻漿后，將組織研磨液反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心10 min，取上清液用0.45 μm濾器過濾，濾液接種改良Frey氏液體培養(yǎng)基，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天觀察培養(yǎng)基顏色變化，當(dāng)培養(yǎng)基顏色由玫紅色變?yōu)槌吻宓狞S色時(shí)進(jìn)行傳代，至少連續(xù)傳3代，培養(yǎng)條件與雞毒支原體相似[5]，但培養(yǎng)時(shí)間較雞毒支原體更長(zhǎng)，初次分離大約需3～9 d。按照參考文獻(xiàn)方法純化MS，將變色后的菌液涂布在改良Frey氏固體培養(yǎng)基上，倒置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)5～7 d，挑取固體培養(yǎng)基上的單菌落至改良Frey氏液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)以上操作3次即得純化后的支原體培養(yǎng)物[6]。

1.5" 病原菌的鑒定

取培養(yǎng)的支原體菌液，按照支原體基因組提取試劑盒的方法提取基因組DNA，利用MS的16S測(cè)序引物（MS-F5'TAGACTGGAATAACGGTGAGAAA 3'，MS-R5'GAAGATGTCAAGAGTGGGTAAGG3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段長(zhǎng)度860 bp，陽性產(chǎn)物測(cè)序后與GenBank收錄的支原體序列比對(duì)確定臨床分離株種屬。參考菌株信息見表1。

按照支原體野毒株P(guān)CR檢測(cè)試劑盒的操作方法，取MS-wild PCR反應(yīng)液22 μL于PCR管中，加入3 μL DNA，同時(shí)加陽性、陰性對(duì)照，分裝后混勻離心。PCR的反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃終止反應(yīng)。凝膠電泳觀察結(jié)果，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳成像分析：若樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳無目的條帶，則為陰性；若樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳在260 bp處存在目的條帶，則說明檢測(cè)結(jié)果為MS野毒陽性。

1.6" 最小抑菌濃度測(cè)定

參考吳清民等方法[7]測(cè)定分離株的顏色改變單位（Colour Change Unit，CCU）。將11種抗生素藥物用無菌純化水溶解稀釋至200 mg/L，過濾除菌備用。參考陳美安等[8]方法測(cè)定，在無菌96孔培養(yǎng)板的各孔中加入改良Frey氏培養(yǎng)基100 μL，從左起第1列的A～G行加入 200 mg/L藥物100 μL，稀釋混勻后從第1孔吸取100 μL加入后一孔，依次倍比稀釋至第18孔，第18孔稀釋完畢后吸取100 μL棄去。取分離株用改良Frey氏培養(yǎng)基稀釋后作為工作液，將所有藥物的1～20孔加入工作液使所有孔的液體總體積均為200 μL，菌液最終濃度為5 000 CCU/mL。19～20孔作為陽性對(duì)照，每個(gè)96孔板的H行設(shè)置為陰性對(duì)照。

稀釋完畢后，蓋上板蓋，置于37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)陽性對(duì)照孔顏色發(fā)生改變即培養(yǎng)液中酚紅指示劑由紅色變?yōu)辄S色或橘黃色且無混濁時(shí)，作第1次結(jié)果判定。觀察5 d后，當(dāng)所有孔不再發(fā)生顏色變化時(shí)，作第2次結(jié)果判定。加藥孔發(fā)生顏色變化前1孔的最小藥物濃度為最小抑菌濃度即MIC。

1.7" 藥物的臨床應(yīng)用

根據(jù)步驟1.6選取對(duì)分離株敏感的藥物，在感染過MS的規(guī)?；N雞場(chǎng)進(jìn)行藥物臨床應(yīng)用。選擇22周齡同品種的種雞群，按照養(yǎng)殖棟舍分為3個(gè)組進(jìn)行試驗(yàn)，1、2組采用不同藥物飲水，連用7 d；3組為對(duì)照組，不使用藥物，正常飼喂。每棟次固定相同欄舍的雞群作為試驗(yàn)雞進(jìn)行采樣，試驗(yàn)前采集試驗(yàn)雞喉頭拭子，MS野毒株P(guān)CR檢測(cè)試劑盒核酸檢測(cè)，評(píng)估雞群感染MS的陽性率。藥物停用后1 、7 、14 、21 d分別采集試驗(yàn)雞喉頭拭子進(jìn)行MS核酸檢測(cè)，根據(jù)試驗(yàn)組雞群感染MS的陽性率，評(píng)估對(duì)比不同藥物對(duì)MS野毒感染的治療效果。

2" 結(jié)果

2.1" 病原菌分離與純化

病料接種改良Frey氏培養(yǎng)基，經(jīng)過傳代培養(yǎng)獲得能使所用培養(yǎng)基顏色變黃的分離物，將分離物接種至固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d，肉眼可觀察到針尖大小的菌落，低倍鏡下可見圓形、隆起、有中心的菌落，呈典型的“煎蛋”樣，直徑為1～3 mm，命名為MS-17103株，見圖2。

2.2" 病原菌的鑒定

分離株MS-17103的16S rRNA基因序列，與GenBank上公布的MS參考株MF196177.1、MF196175.1有99%的同源性（圖3），證實(shí)該分離株MS-17103為滑液囊支原體。

MS野毒株P(guān)CR檢測(cè)試劑盒鑒定結(jié)果顯示，分離株MS-17103擴(kuò)增出大小約為260 bp的條帶，與預(yù)期相符，見圖4。

2.3" 最小抑菌濃度測(cè)定

通過微量稀釋法測(cè)得11種抗菌藥物對(duì)分離株MS-17103的MIC值，測(cè)定結(jié)果見表2。鹽酸沃尼妙林預(yù)混劑和酒石酸泰萬菌素可溶性粉的MIC分別為0.00076 mg/L和0.00153 mg/L，對(duì)分離株MS-17103較敏感；酒石酸泰樂菌素可溶性粉、泰拉菌素、鹽酸大觀林可霉素、鹽酸多西環(huán)素可溶性粉、延胡索酸泰妙菌素預(yù)混劑的MIC在0.04880～0.19530 mg/L之間，敏感性次之；替米考星溶液、泰地羅新注射液、加米霉素注射液、鹽酸金霉素可溶性粉的MIC在0.39062～12.500 mg/L之間，敏感性較差。

2.4" 藥物的臨床應(yīng)用

藥物臨床應(yīng)用結(jié)果見表3、圖5。由此可知，鹽酸沃尼妙林預(yù)混劑、酒石酸泰萬菌素可溶性粉在試驗(yàn)雞群使用后均能夠有效降低感染MS的陽性率。

3" 討論

MS是雞和火雞易感的一種急慢性傳染病[9]，常與雞毒支原體、大腸桿菌等病原混合感染，導(dǎo)致更嚴(yán)重的呼吸道癥狀或關(guān)節(jié)病變，增加治療難度和死亡率。目前MS在我國(guó)肉雞、蛋雞、種雞群中呈現(xiàn)暴發(fā)性、普遍性[10]特點(diǎn)。該病感染商品肉雞，造成肉雞生長(zhǎng)速度和飼料轉(zhuǎn)化率降低、淘汰率較高和屠體質(zhì)量下降；感染育成蛋雞后，雞群個(gè)體和生殖器官發(fā)育不整齊，無產(chǎn)蛋高峰或產(chǎn)蛋高峰延遲；感染種雞后，孵化率較低，產(chǎn)死胚或弱雛多，導(dǎo)致持續(xù)不斷的循環(huán)感染[11-13，20-21]。該病傳染性強(qiáng)，既可以水平傳播又可以垂直傳播，病情發(fā)展緩慢和病程長(zhǎng)，雞群一旦感染很難凈化，給全球養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前MS的控制主要通過疫苗免疫和藥物控制兩種方法，國(guó)內(nèi)大部分養(yǎng)殖場(chǎng)主要依靠抗菌藥物進(jìn)行控制[14] 。隨著該病在我國(guó)的發(fā)病率不斷呈上升趨勢(shì)[15-16]，防控和治療工作也愈加緊迫。藥物治療是防控MS感染的另一重要手段，但是過分依賴和濫用藥物，增加了菌株的耐藥性[17]。因此，針對(duì)生產(chǎn)養(yǎng)殖中MS感染，通過分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)選擇敏感藥物，可以在很大程度上提高疾病的治療效率。

本研究從疑似MS感染的雞關(guān)節(jié)中成功分離到1株MS菌株，并從11種抗生素中篩選出對(duì)分離株MS-17103最敏感的藥物鹽酸沃尼妙林。該藥物應(yīng)用于MS感染病例的臨床治療，能夠有效降低MS陽性率，與進(jìn)口泰妙菌素產(chǎn)品相比，價(jià)格更低、適口性更好。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)藥物療效與感染雞群的MS陽性率有相關(guān)性，臨床上可以通過監(jiān)測(cè)雞群感染MS的陽性率來指導(dǎo)用藥頻率，該藥物在控制MS感染的使用頻率還需要進(jìn)一步探究。在未來的研究工作中，會(huì)繼續(xù)探索新的治療方案，提高防治效果。同時(shí)，加強(qiáng)生物安全體系的建設(shè)和綜合防治措施的實(shí)施，也是控制MS的重要手段。

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Isolation， Identification and Drug Screening of a Strain of

Mycoplasma Synoviae

XU Mingqing1，2， WANG Jianhua1，2， LIU Xiaoyu1，2， LIU Dandan1，2， LI Fujin3， XU Huaiying4，

LI Yufeng4

（1.Shandong Hekangyuan Biological Breeding Co. Ltd， Ji'nan 250001，China;

2. Jinan Engineering Research Center for Poultry Breeding and Disease Prevention and Control，

Ji'nan" 250023，China;

3.Qilu Animal Health Products Co. Ltd， Ji'nan" 250100，China;

4.Poultry Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Ji'nan" 250023，China）

Abstract： To investigate the pathogen causing leg paralysis and joint swelling in parental breeder chickens and develop effective treatment strategies， sick chickens exhibiting lameness and paralysis symptoms were collected from a broiler breeder farm in Shandong Province. The Mycoplasma synoviae （MS） was successfully isolated and purified using modified Frey's medium. Subsequently， the 16S rRNA gene sequence of MS was amplified using PCR technology and subjected to sequence alignment. Additionally， the isolated strain was identified using an MS wild-type strain PCR detection kit. Finally， the minimum inhibitory concentrations （MICs） of various antibiotics against the isolated strain were determined， and a clinical evaluation of the drugs was conducted. The results showed that a strain of MS， named MS-17103， was successfully isolated and identified from sick chickens with lameness and paralysis symptoms collected from a meat breeder chicken farm in Shandong Province. This strain exhibited typical mycoplasma colony morphology and was confirmed as MS wild-type strain-positive by PCR. The drug sensitivity test revealed that MS-17103 was sensitive to valnemulin hydrochloride （MIC of 0.00076 mg/L） and tylosin tartrate （MIC of 0.00153 mg/L）. The application of these two drugs in breeder chicken farms previously infected with MS showed a significant reduction in the positive rate of MS infection in the chicken population. This study provides an important reference for the subsequent development of treatment plans for this disease.

Keywords： Broiler breeder; Mycoplasma Synoviae;Isolation ;Identification;Minimal inhibit concentration

收稿日期：2024-07-16

第一作者：許明清（1989—），女，碩士研究生，獸醫(yī)學(xué)專業(yè)，E-mail：237756683@qq.com

通信作者：李玉峰（1973—），男，研究員，研究方向?yàn)榧仪莶≡瓕W(xué)與免疫學(xué)，E-mail：dicpd @163.com