基于抗寒系數(shù)對“WL”系列苜蓿品種抗寒性的綜合評價

摘要：為了闡明科爾沁沙地不同秋眠級苜蓿（Medicago sativa）品種抗寒性與抗寒生理特性的關系，選取12個不同秋眠級的“WL”系列苜蓿品種作為供試材料，采用單因素隨機區(qū)組試驗設計，于科爾沁沙地種植，封凍前取苜蓿越冬器官（苜蓿根系），模擬4℃（CK）和-20℃低溫脅迫處理，測定苜蓿根頸的抗氧化特性和抗寒保護物質(zhì)含量，利用抗寒系數(shù)結合相關性分析、主成分分析、聚類分析和隸屬函數(shù)分析，對其抗寒能力進行了評價。結果表明：（1）秋眠級與過氧化物酶的抗寒系數(shù)呈極顯著負相關（Plt;0.01），與丙二醛和淀粉的抗寒系數(shù)呈極顯著正相關（Plt;0.01）。（2）聚類分析可將12個苜蓿品種分為3組，第1組‘WL168HQ’秋眠型品種；第2組為‘WL329HQ’‘WL319HQ’‘WL298HQ’秋眠型和‘WL349HQ’半秋眠型品種，第3組則是其他半秋眠型品種。（3）通過主成分分析將8個單一指標轉(zhuǎn)化為3個綜合指標，累計貢獻率達80.20%。（4）隸屬函數(shù)綜合評價表明‘WL168HQ’苜蓿品種最適宜科爾沁沙地種植。

關鍵詞：紫花苜蓿；品種；秋眠級；抗寒系數(shù)；綜合評價

中圖分類號：S541""" 文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）08-2592-07

Comprehensive Evaluation of Cold Resistance of Alfalfa Varieties of the “WL”

Series Based on Cold Resistance Coefficients

LIU Ze-yu1， YUAN Zi-tong1， SUI Ke1， ZHANG Yu-xia1， LIU Ting-yu1，

SHAN Xin-he2， ZHANG Zhi-yong3， WANG Xian-guo2*

（1.Key Laboratory of Ecological Agriculture in Horqin Sandy Land， College of Prataculture， Inner Mongolia Minzu University/

State Ethnic Affairs Commission， Tongliao，Inner Mongolia 028000， China; 2. College of Pratacultural Science and Technology，

China Agricultural University， Beijing 100193; 3. Tongliao Institute of Agriculture and Animal Husbandry Science， Tongliao，

Inner Mongolia 028000， China）

Abstract：In order to clarify the relationship between cold resistance and cold resistance physiological characteristics of alfalfa（Medicago sativa） varieties with different fall dormancy levels in Horqin Sandy Land，12 “WL” series alfalfa varieties with different fall dormancy levels were selected as test materials. Single factor randomized block experiment design was used to plant alfalfa in Horqin Sandy Land. Before freezing，take the overwintering organs （alfalfa roots） of alfalfa，simulate low temperature stress treatment at 4℃ （CK） and -20℃，and measure the antioxidant properties and content of cold resistant protective substances in the alfalfa root neck. The cold resistance ability of alfalfa was evaluated by utilizing the cold resistance coefficient and combining correlation analysis，principal component analysis，cluster analysis，and membership function analysis. The results showed that：（1） The autumn dormancy level is significantly negatively correlated with the cold resistance coefficient of peroxidase （P＜0.01），and significantly positively correlated with the cold resistance coefficient of malondialdehyde and starch （P＜0.01）. （2） Cluster analysis of cold resistance coefficients of 12 alfalfa varieties can be divided into 3 groups. The 1 st group includes ‘WL168HQ’ fall dormancy varieties，the 2nd group includes ‘WL329HQ’、‘WL319HQ’and ‘WL298HQ’ fall dormancy varieties，as well as ‘WL349HQ’ semi-dormant varieties. The 3rd group consists of other semi-dormant varieties. （3） Through principal component analysis，8 single indicators were transformed into 3 comprehensive indicators， the cumulative contribition rate was 80.20%. （4） The comprehensive evaluation of membership function showed that ‘WL168HQ’ alfalfa variety was the most suitable one for alfalfa planting in Horqin Sandy Land.

Key words：Alfalfa;Varieties;Fall dormancy;Cold resistance coefficient;Comprehensive evaluation

作為我國北方栽培面積最大的豆科牧草，苜蓿（Medicago sativa）因其適應能力強，營養(yǎng)價值高而享有“牧草之王”之美譽［1］。內(nèi)蒙古科爾沁地區(qū)是我國北方優(yōu)質(zhì)的苜蓿生產(chǎn)種植基地，但該地區(qū)冬季低溫寒冷降水較少，春季氣溫不穩(wěn)定經(jīng)常發(fā)生“倒春寒”等極端天氣，苜蓿極易受到凍害的威脅，故在該地區(qū)種植苜蓿時，抗寒性是品種選擇的關鍵因素［2］。秋眠級（Fall dormancy，F(xiàn)D）是苜蓿對晚秋環(huán)境（日照時數(shù)減少）變化適應性反應，植株表現(xiàn)為由向上生長轉(zhuǎn)向匍匐生長，致使總產(chǎn)量減少的一種生長特性，它與產(chǎn)量和抗寒性密切相關，已成為北美評定苜蓿品種生產(chǎn)性能的重要參考指標［3-4］。大量研究表明［5-9］，秋眠級與抗寒性存在著負相關的關系?？购栽綇姷钠贩N其秋眠級越低，可以更好適應寒冷的環(huán)境。盧欣石等［10］對國內(nèi)23個審定苜蓿品種及92個地方品種的秋眠級進行了測定，發(fā)現(xiàn)苜蓿秋眠級與其耐寒能力有直接關系，秋眠性強的苜蓿品種，其抗寒能力較強。

當前針對苜?？购缘膯栴}已有大量學者進行了研究，其中王曉龍等［11］和馬亞珺等［12］采用人工模擬低溫的方法，對不同苜蓿品種幼苗進行抗寒鍛煉，研究其抗寒性；王曉龍等［13-15］通過研究苜蓿的根系形態(tài)來確定根系性狀與抗寒性之間的關系。趙金梅等［16-18］通過研究苜蓿根頸細胞的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及抗氧化酶的活性來判斷苜蓿的抗寒性，對“WL”系列苜蓿的研究前人主要集中生產(chǎn)性能［19-20］，對抗寒性的研究鮮有，劉澤宇等［21］對“WL”系列苜蓿的抗寒性研究主要集中在抗氧化特性對抗寒性的影響?；诳购禂?shù)評價植物抗寒性的研究，甘藍［22］、蕎麥［23］和月季［24］等植物研究較多，關于苜蓿［25］的研究較少，基于此，本研究于越冬前挖取“WL”系列不同秋眠級苜蓿品種的越冬器官，在程序式低溫處理箱模擬低溫冷凍處理，以低溫冷藏處理為對照，測定不同溫度下抗氧化特性和抗寒保護物質(zhì)含量的變化，利用抗寒系數(shù)進行相關性分析、主成分分析、聚類分析以及隸屬函數(shù)分析，對各個品種的耐寒性進行分類排序，篩選高抗寒的品種，以期為科爾沁沙地苜蓿抗寒影響機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為美國“WL”系列紫花苜蓿品種，均由北京正道種業(yè)公司提供。具體品種信息見表1。

1.2 試驗設計

本試驗于2023年4—11月在內(nèi)蒙古通遼市科爾沁區(qū)錢家店鎮(zhèn)（通遼市農(nóng)牧科學研究所試驗基地）進行。海拔203 m，122°37′E，43°43′N。屬溫帶大陸性氣候。春季干旱多風；夏季短溫熱，降水集中；秋季涼爽；冬季干冷。無霜期為90～150 d。年降雨量350～450 mm。土質(zhì)為白壤土，地勢平坦，肥力中上等，土壤基本理化性質(zhì)為有機質(zhì)26.0 g·kg-1，速效磷17.0 mg·kg-1，速效鉀76.6 mg·kg-1，堿解氮47.5 mg·kg-1，全氮0.8 g·kg-1。

采用單因素隨機區(qū)組試驗設計，2023年4月播種，播種量為22.5 kg·hm-2，行距為15 cm，小區(qū)面積為20 m2（長4 m×寬5 m），每個處理3次重復，共36個小區(qū)。試驗田按照當?shù)剀俎８弋a(chǎn)田進行田間管理。分別于6月26日、8月1日、8月31日進行3茬苜蓿的刈割利用。本試驗于封凍前期，挖取長勢均勻一致的越冬器官（苜蓿根系）若干帶回室內(nèi)，模擬低溫冷藏和低溫冷凍脅迫處理。即將用蒸餾水洗凈吸干浮水后的苜蓿越冬器官分成均勻的兩份，每份40株，并排整齊擺放在厚度為3 mm，長為30 cm、寬為20 cm的純棉布上，包裹好，均勻噴灑30 mL蒸餾水，使棉布保持潮濕狀態(tài)，最后用長×寬為30 cm×30 cm錫箔紙包好。其中一份存放于4℃的冰箱冷藏，另一份放入可程式恒溫恒濕試驗箱中進行-20℃的低溫處理?？沙淌胶銣卦囼炏涞脑O置［14］：以4℃為起點，先以4℃·h-1的速率升溫，到達設定溫度后保持8 h，后以4℃·h-1的速率降溫，取出后置于4℃下保持12 h，然后進行指標測定，指標測定時采用隨機取樣。低溫冷凍處理完成后與低溫冷藏材料一同切取根頸下方1 cm長度的薄片，用于測定抗氧化特性和抗寒保護物質(zhì)含量等生理指標。

1.3 測定的指標與方法

生理指標的測定參照鄒琦［26］植物生理學實驗指導方法：丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性、過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性、過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性分別采用硫代巴比妥酸法、氮藍四唑法紫外吸收法、愈創(chuàng)木酚比色法測定。可溶性蛋白（Soluble protein，SP）、游離氨基酸（free amino acid，AA）含量分別采用考馬斯亮藍比色法、水合茚三酮法測定，可溶性糖（Soluble sugar，SS）和淀粉（Starch，ST）含量的測定采用蒽酮比色法。每項生理指標測定設3次重復。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 單項指標的抗寒系數(shù)

抗寒系數(shù)（ω）=低溫冷凍數(shù)值/低溫冷藏數(shù)值（1）［25］

1.4.2 各生理指標抗寒系數(shù)的隸屬函數(shù)值 采用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法對苜蓿的耐寒性進行綜合評價。首先，通過相關性分析確定最終用于評價的指標，并計算出各指標的隸屬函數(shù)值［23］，如果某一指標和抗寒性呈正相關，則采用公式（1）進行計算，如果某一指標和抗寒性呈負相關，則采用公式（2）進行計算：

Fij=Xij-Ximin/Ximax-Ximin （2）

Fij=1-Xij-Ximin/Ximax-Ximin（3）

式中：Fij為i品種j指標隸屬函數(shù)值；Xij為i品種j指標值；Ximax為i品種j指標最大值；Ximin為i品種j指標最小值。將i品種各項指標函數(shù)值累加后求平均值，均值越大則苜蓿品種耐寒性越強。

1.4.3 各綜合指標的權重

ωj=pj/∑nj=1pjj=1，2，…，n（4）

式中，ωj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度即權重；pj代表經(jīng)主成分分析所得各苜蓿越冬材料第j個綜合指標的貢獻率。

1.4.4 各苜蓿越冬材料的綜合抗寒能力大小

D=∑nj=1［μ（Xj）×ωj］j=1，2，…，n（5）

式中，D值為各苜蓿根頸在低溫冷凍脅迫處理下由綜合指標評價所得的抗寒性綜合評價值。

1.5 統(tǒng)計分析

用Microsoft Excel 2021進行數(shù)據(jù)的錄入及整理。采用SPSS 26.0（IBM，美國）統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析（One-way ANOVA），并進行相關性分析、主成分分析、聚類分析和隸屬函數(shù)綜合評價。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下苜蓿各生理指標變異統(tǒng)計

低溫脅迫下苜蓿的8個生理指標的測定結果變異統(tǒng)計顯示（表2），不同材料的同一生理指標的抗寒系數(shù)存在較大差異。此外，不同指標的變異系數(shù)變化較大，變異系數(shù)為0.050～0.326，表明所測定指標對于低溫脅迫響應程度各不相同。在8個指標中以SOD，AA，SS的變異系數(shù)較大，分別為0.326，0.245和0.206，MDA的變異系數(shù)較小為0.050。

2.2 各單項指標的抗寒系數(shù)

由表3可知，不同苜蓿品種在同一指標下的抗寒系數(shù)不同，不同指標下同一苜蓿品種的抗寒系數(shù)也有差異，‘WL319HQ’的POD抗寒系數(shù)最大為1.879，‘WL298HQ’次之，為1.747?！甒L168HQ’的SOD和SS的抗寒系數(shù)最高為2.037和3.521?！甒L349HQ’的CAT抗寒系數(shù)最高為1.809?！甒L168HQ’的MDA抗寒系數(shù)最低為1.916?！甒L319HQ’的ST抗寒系數(shù)最低為0.105?！甒L363HQ’的游離氨基酸抗寒系數(shù)最高為1.859?！甒L329HQ’的可溶性蛋白抗寒系數(shù)最高為2.180。不同品種的苜蓿在低溫脅迫下，對根頸細胞起到保護作用的抗氧化酶以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的抗寒系數(shù)不同。

2.3 不同單項生理指標抗寒系數(shù)與秋眠級相關性分析

對不同單項指標的抗寒系數(shù)與秋眠級進行相關性分析可知（表4），秋眠級與POD抗寒系數(shù)呈極顯著負相關（Plt;0.01），相關系數(shù)為-0.798，與MDA和ST抗寒系數(shù)呈極顯著正相關（Plt;0.01），相關系數(shù)分別為0.866和0.709。各單項生理指標間，MDA抗寒系數(shù)與CAT和POD的抗寒系數(shù)呈極顯著負相關（Plt;0.01），與ST呈極顯著正相關（Plt;0.01）。ST的抗寒系數(shù)與POD抗寒系數(shù)呈極顯著負相關。

2.4 主成分分析

對8個生理指標進行主成分分析（表5），前3個主成分（F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3）的貢獻率分別為41.72%，20.22%，17.27%，其中F1對應的特征向量中貢獻較大的指標為ST（0.880）和SP（0.805）；F2對應的特征向量中貢獻較大的指標為SS（0.658）和CAT（0.656）；F3對應的特征向量中貢獻較大的指標為SS（0.882）和CAT（0.382）；F4對應的特征向量中貢獻較大的指標為CAT（0.607）和SS（0.604）。因此將8個單一指標轉(zhuǎn)化為3個綜合指標，累計貢獻率達80.20%。

2.5 隸屬函數(shù)分析

為避免單一生理指標評價苜蓿抗寒性的片面性，基于主成分分析對12個苜蓿品種進行隸屬函數(shù)綜合評價表明（表6），其抗寒性強弱順序依次為：‘WL168HQ’（0.76）gt;‘WL329HQ’（0.65）gt;‘WL319HQ’（0.64）gt;‘WL349HQ’（0.51）gt;‘WL298HQ’（0.47）gt;‘WL354HQ’（0.46）gt;‘WL343HQ’（0.41）gt;‘WL377HQ’（0.38）gt;‘WL358HQ’（0.36）gt;‘WL366HQ’（0.34）gt;‘WL363HQ’（0.30）gt;‘WL440HQ’（0.25）。

2.6 聚類分析

根據(jù)隸屬函數(shù)值對12個苜蓿品種進行聚類分析，將其分為3組（圖1），第1組‘WL168HQ’秋眠型品種：第2組為‘WL319HQ’‘WL298HQ’‘WL329HQ’秋眠型和‘WL349HQ’半秋眠型品種；第3組包括‘WL354HQ’‘WL343HQ’‘WL358HQ’‘WL440HQ’‘WL366HQ’‘WL363HQ’和‘WL377HQ’半秋眠型品種。

2.7 苜?？购耘c秋眠級的相關性

利用線性回歸法，對不同品種苜蓿抗寒性的隸屬函數(shù)綜合評價值與秋眠級進行回歸分析，建立抗寒性與秋眠級的一元線性回歸方程（圖2），苜?？购耘c秋眠級呈負相關（R2=0.78），秋眠級越低的品種，苜蓿抗寒性越強。

3 討論

苜蓿的抗寒性由環(huán)境脅迫和自身的遺傳特性所決定，低溫脅迫下苜蓿的生理反應直接或者間接影響著其抗寒性［26］。研究不同品種苜蓿的抗寒性，篩選耐寒品種對于促進牧草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。對于苜?？购缘脑u價，前人的研究主要集中在苜蓿的萌芽期和苗期［12，18］，這些研究通常采用光照培養(yǎng)箱模擬低溫處理進行抗寒鑒定，此方法操作簡單，不易受到外界環(huán)境的影響。本試驗采取在霜凍前期挖取苜蓿根系進行模擬低溫脅迫的研究，采用可程式恒溫恒濕箱可以更接近真實的越冬情況。另外，本研究在內(nèi)蒙古通遼市進行試驗，更能準確的評價苜蓿在科爾沁沙地的實際抗寒性。

苜蓿抗寒性評價主要是從植物生理學角度來研究苜蓿本身生理生化特性及其對低溫脅迫的響應［27-30］，鑒定植物抗寒性的指標有很多，本研究運用人工模擬低溫處理，基于苜蓿的抗氧化特性、抗寒保護物質(zhì)的8個生理指標，計算12個苜蓿品種的抗寒系數(shù)，運用相關分析發(fā)現(xiàn)，秋眠級與POD的抗寒系數(shù)呈極顯著負相關（Plt;0.01），與MDA和淀粉抗寒系數(shù)呈極顯著正相關（Plt;0.01），這與孫昊等［25］的研究相一致；主成分分析發(fā)現(xiàn)，SP和SS是影響苜?？购缘闹饕碇笜?，這與陳衛(wèi)東［31］的研究結果相一致，與張玉霞等［32］研究結果不一致，其原因可能與供試的苜蓿品種不同有關。利用線性回歸法，對不同品種苜蓿抗寒性的隸屬函數(shù)綜合評價值與秋眠級進行回歸分析發(fā)現(xiàn)，苜?？购耘c秋眠級呈負相關（R2=0.78），秋眠級越低的品種，苜蓿抗寒性越強。

4 結論

對苜?？购院颓锩呒夁M行相關性分析表明，苜抗寒性與秋眠級呈顯著負相關，秋眠級指數(shù)越低，抗寒性越強。12個苜蓿品種中，‘WL168HQ’‘WL319HQ’‘WL298HQ’和‘WL349HQ’具有較強的抗寒性和較低的秋眠級，主成分分析將8個單一指標轉(zhuǎn)化為3個綜合指標，累計貢獻率達80.20%。運用隸屬函數(shù)進行綜合評價得出，品種抗寒性順序為：‘WL168HQ’（0.76）gt;‘WL329HQ’（0.65）gt;‘WL319HQ’（0.64）gt;‘WL349HQ’（0.51）gt;‘WL298HQ’（0.47）gt;‘WL354HQ’（0.46）gt;‘WL343HQ’（0.41）gt;‘WL377HQ’（0.38）gt;‘WL358HQ’（0.36）gt;‘WL366HQ’（0.34）gt;‘WL363HQ’（0.30）gt;‘WL440HQ’（0.25）。

綜上，建議在科爾沁沙地種植“WL”系列紫花苜蓿品種為‘WL168HQ’。

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（責任編輯 劉婷婷）