含水量對(duì)柱花草青貯品質(zhì)和微生物群落動(dòng)態(tài)的影響

摘要：本試驗(yàn)旨在探究含水量對(duì)‘熱研2號(hào)’柱花草（Stylosanthes guaianensis SW. ‘Reyan No. 2’）青貯品質(zhì)及微生物群落動(dòng)態(tài)影響。試驗(yàn)設(shè)鮮貯組（F組）和萎蔫組（S組），測(cè)定柱花草青貯飼料的動(dòng)態(tài)發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分，并在青貯14 d和60 d測(cè)定細(xì)菌群落。結(jié)果表明：S組粗蛋白和乙酸含量顯著高于F組，丁酸含量顯著低于F組（Plt;0.05）。青貯14 d和60 d后，S組青貯飼料梭菌屬（Clostridium）豐度顯著低于F組（Plt;0.05）。微生物群落（屬水平）與發(fā)酵指標(biāo)關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)柱花草青貯發(fā)酵14 d，F(xiàn)組腸桿菌屬（Enterobacter）與水溶性碳水化合物含量呈顯著負(fù)相關(guān)，S組腸桿菌屬與氨態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)，與CP含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；發(fā)酵60 d后，S組腸桿菌屬與WSC含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）。綜合來(lái)看，降低青貯前柱花草的含水量更有利于柱花草青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分的保存和提高柱花草青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：干物質(zhì)；柱花草；營(yíng)養(yǎng)成分；微生物多樣性；青貯品質(zhì)

中圖分類號(hào)：S816.5""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）08-2648-11

Effects of Moisture Content on the Fermentation Quality and Microbial

Community Diversity of Stylo Silage

HUANG Nai-xin， LI Xue-feng， ZHAN Xiao-xia， CUI Zhi-hai， MAO Kai， CHAI Huan，

WANG Mu-sen， WANG Jian*

（College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan Province 570228， China）

Abstract：This experiment aimed to investigate the influence of moisture content on the dynamics of quality of ‘Reyan No. 2’ stylo silage and the bacterial communities. Experimental treatments of fresh stylo （F group） and wilting （S group） were established to investigate the dynamic of fermentation quality and nutritional components. Additionally，the bacterial communities of stylo silages were analyzed on days 14 and 60. The findings revealed that both crude protein and acetic acid content of stylo silage were significantly higher in the S treatment than in the F treatment，while the butyric acid content was significantly lower in the S treatment （Plt;0.05）. At the genus level，the relative abundance of Clostridium in the S treatment silage was significantly lower than that in the F treatment silage on days 14 and 60 （Plt;0.05）. The correlation analysis of both microbial communities （at the genus level） and fermentation indicators showed that Enterobacter was negatively correlated with the water-soluble carbohydrates content in the F treatment silage after 14 days of ensiling of stylo forage. In addition，the Enterobacter of treatment silage showed a significant （Plt;0.05） positive correlation with ammonia nitrogen content and a significant negative correlation with crude protein content. The Enterobacter of the S treatment silage was negatively correlated with WSC content （Plt;0.05） after 60 days of ensiling. In conclusion，it would be a good approach for preserving nutritional components and enhancing the fermentation quality of stylo silage when reduced the moisture content of the fresh stylo material forage before ensiling.

Key words：Dry matter;Stylo silage; Nutrition composition;Microbial diversity;Silage quality

柱花草（Stylosanthes guaianensis SW. ‘Reyan No.2’）是原產(chǎn)于拉丁美洲的熱帶豆科牧草，其蛋白質(zhì)含量高，適口性好，具有耐高溫，抗旱適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛種植于熱帶亞熱帶地區(qū)用作動(dòng)物的飼草［1］。然而柱花草生產(chǎn)存在季節(jié)性，夏秋季節(jié)產(chǎn)量大，在冬春季節(jié)卻幾乎生長(zhǎng)停滯，這種季節(jié)生產(chǎn)的不平衡導(dǎo)致柱花草未能夠全年被充分利用，無(wú)法發(fā)揮出優(yōu)質(zhì)豆科牧草用于飼養(yǎng)反芻動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)。因此，在柱花草生物量高峰期將其刈割制作成青貯飼料既可保證柱花草能全年利用，也能使當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)可持續(xù)發(fā)展。青貯是一種用于青綠飼料長(zhǎng)期保存的方法，是基于厭氧條件下產(chǎn)生的乳酸菌發(fā)酵，在這個(gè)過(guò)程中，乳酸菌將牧草中的水溶性碳水化合物轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，主要是乳酸，從而降低青貯體系pH值抑制有害微生物的繁殖［2］。在青貯發(fā)酵過(guò)程中，青貯原料本身的含水量會(huì)在很大程度上影響青貯發(fā)酵進(jìn)程和青貯品質(zhì)。Su等［3］ 研究表明降低苜蓿（Medicago sativa）原料的含水量顯著影響了苜蓿青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和微生物群落組成，干物質(zhì)含量高的苜蓿原料在青貯60 d后青貯飼料與干物質(zhì)含量低的相比具有更低的pH值和更高的乳酸含量。閆興全等［4］研究發(fā)現(xiàn)苜蓿含水量在55%時(shí)青貯，發(fā)酵品質(zhì)整體優(yōu)于70%含水量，55%含水量苜蓿青貯飼料的丁酸含量顯著低于70%含水量苜蓿青貯飼料。鐘書(shū)等［5］對(duì)含水量分別為70%和60%的紫花苜蓿進(jìn)行青貯，發(fā)現(xiàn)通過(guò)降低青貯原料含水量，能有效抑制酵母菌等有害微生物活性和植物呼吸作用，含水量為60%的紫花苜蓿青貯飼料青貯效果優(yōu)于含水量為70%的紫花苜蓿青貯飼料。但亦有研究報(bào)道新鮮刈割的牧草制備的青貯飼料具有更好的發(fā)酵品質(zhì)，如Ke等［6］研究表明含水量為70%的紫花苜蓿青貯發(fā)酵60 d后，pH值，氨態(tài)氮含量和干物質(zhì)損失率顯著低于含水量為62%的紫花苜蓿青貯飼料；Bao等［7］研究報(bào)道在相同添加劑處理下，原料水分較高的柱花草調(diào)制的青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)于水分含量較低的柱花草，具體表現(xiàn)為低pH值，低氨態(tài)氮和高乳酸含量。

目前，關(guān)于柱花草的青貯研究多集中于不同添加劑對(duì)其青貯發(fā)酵品質(zhì)及其營(yíng)養(yǎng)成分的影響［8-10］，對(duì)不同含水量柱花草青貯過(guò)程中發(fā)酵品質(zhì)及微生物多樣性變化報(bào)道還較少。因此，本試驗(yàn)對(duì)不同含水量的柱花草進(jìn)行青貯，分析其動(dòng)態(tài)青貯發(fā)酵品質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)成分以及微生物群落的變化，為柱花草調(diào)制青貯飼料生產(chǎn)提供理論參考和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料為‘熱研2號(hào)’柱花草（Stylosanthes guaianensis ‘Renyan No.2’）種植于海南大學(xué)農(nóng)科試驗(yàn)地（20°06′N，110°32′E），原料采集時(shí)間為 2021 年7月12 日，此時(shí)柱花草為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，使用清潔消毒后的鐮刀刈割材料，采樣時(shí)盡量避免植株葉片的脫落，保持莖葉完整。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用消毒后的手動(dòng)鍘刀將柱花草鮮草切短至2～3 cm，混勻后，隨機(jī)分為2組，一組為鮮草直接青貯（鮮貯組，簡(jiǎn)稱F組，含水量80% 左右），另一組萎蔫4小時(shí)后青貯（萎蔫組，簡(jiǎn)稱S組，含水量69% 左右）。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)每袋稱取250 g柱花草原料分裝至聚乙烯塑料袋（22×33 cm）中，每處理3重復(fù)，共42袋，使用真空封口機(jī)抽真空并密封室溫保存，分別在青貯1，3，5，7，14，30 和60 d后進(jìn)行開(kāi)袋，取樣測(cè)定分析其青貯指標(biāo)及化學(xué)成分。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及分析方法

1.3.1 柱花草青貯發(fā)酵品質(zhì)測(cè)定方法 分別稱取不同發(fā)酵天數(shù)的青貯飼料20 g，放入清潔滅菌后的250 mL廣口三角瓶中，加入70 g去離子水，在4℃冰箱浸提24 h后，經(jīng)4層紗布和定性濾紙過(guò)濾后得到的浸提液用于測(cè)定pH值，有機(jī)酸［乳酸（Lactic acid，LA）；乙酸（Acetic acid，AA）；丙酸（Propionic acid，PA）；丁酸（Butyric acid，BA）和氨態(tài)氮（Ammonia nitrogen，NH3-N）］含量。pH值通過(guò)CT-6021A型pH計(jì)對(duì)青貯飼料浸提液直接測(cè)定；有機(jī)酸采用高效液相色譜儀（日本島津SHIMADZU-LC 20A） 測(cè)定，測(cè)定條件：色譜柱為Carbomix H-NP；檢測(cè)器為SPD-M10AVP；流動(dòng)相為0.2 mmol·L-1硫酸溶液，流速0.8 mL·min-1，柱溫60℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm，進(jìn)樣量10 μL；苯酚-次氯酸鈉比色法［11］測(cè)定氨態(tài)氮含量。

1.3.2 柱花草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)測(cè)定方法 取適量柱花草鮮草和柱花草青貯飼料用信封裝好后置于65℃烘箱干燥 72 h測(cè)定干物質(zhì)（Dry matter，DM）；水溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrate，WSC）采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定［12］；粗蛋白質(zhì)（Crude protein，CP）含量采用全自動(dòng)凱氏定氮儀（K9860，山東海能科學(xué)儀器有限公司）進(jìn)行測(cè)定；中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）含量按照范氏纖維分析法［13］測(cè)定樣品中的中性和酸性洗滌纖維含量。

1.3.3 微生物計(jì)數(shù) 采用平板計(jì)數(shù)法［14］測(cè)定乳酸菌，腸桿菌，酵母菌和梭菌的數(shù)量。每個(gè)樣品取10 g與100 mL無(wú)菌生理鹽水（8.5 g·L-1）充分混合均勻后，將其放入37℃，140 r·min-1的搖床里均質(zhì)15 min，進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋（10-2 至10-8），進(jìn)行涂布后計(jì)算微生物菌落數(shù)目。乳酸菌在MRS瓊脂上 37℃厭氧培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)；酵母菌在玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上 28℃有氧培養(yǎng) 48 h后計(jì)數(shù)；腸桿菌在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂上 37℃有氧培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)；丁酸梭菌在RCM培養(yǎng)基上37℃厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)；以上培養(yǎng)基均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.3.4 微生物總DNA提取和細(xì)菌菌落分析 參考Long等［15］方法提取青貯14 d和60 d的柱花草青貯飼料樣品的DNA，將提取的DNA送至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，PCR擴(kuò)增選用細(xì)菌 16S rRNA V3-V4區(qū)特異性引物338F（5′-+ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′），806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。使用Illumina NovaSeq機(jī)器上利用NovaSeq 6000 SP Reagent Kit （500 cycles）進(jìn)行 2×250 bp雙端測(cè)序，再用QIIME2 2019.4 版本進(jìn)行修改和完善的流程對(duì)微生物組生物學(xué)信息進(jìn)行分析原始序列數(shù)據(jù)。使用demux插件進(jìn)行解碼處理，cutadapt插件進(jìn)行引物切除，然后使用DADA2插件對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，去噪，拼接和嵌合體去除等數(shù)據(jù)處理。對(duì)上述獲得的序列按100% 的序列相似度進(jìn)行歸并，生成特征性序列ASVs以及豐度數(shù)據(jù)表格。使用QIIME2軟件計(jì)算分析alpha多樣性指數(shù)（Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)等），并繪制箱線圖，比較不同樣品之間ASV的豐富度和均勻度。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) 在Excel 2010 中做數(shù)據(jù)的基本處理，使用SPSS 26.0 軟件對(duì)各處理的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)和發(fā)酵指標(biāo)進(jìn)行方差分析，Duncan’s法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較和顯著性分析（Plt;0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱花草青貯前的特性

柱花草鮮草化學(xué)成分及微生物組成見(jiàn)表1。S組的DM含量為314.12 g·kg-1 FM，CP，ADF，NDF和WSC含量均高于F組。S組的乳酸菌數(shù)量為7.33 lg cfu·g-1，高于F組的5.83 lg cfu·g-1，萎蔫后酵母菌，霉菌和腸桿菌數(shù)量均低于F組，F(xiàn)組和S組柱花草中均未檢測(cè)到梭菌。

2.2 柱花草青貯過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分動(dòng)態(tài)變化

由表2可知，含水量對(duì)柱花草青貯飼料的NDF，WSC含量有顯著影響（Plt;0.05），隨著柱花草含水量的下降，NDF，WSC含量顯著上升（Plt;0.05）。青貯時(shí)間對(duì)青貯飼料的DM，CP，WSC含量亦有顯著影響（Plt;0.05），隨著青貯天數(shù)的增加F組和S組青貯飼料的DM含量呈下降趨勢(shì)，與青貯第1 d相比，青貯60 d后F組青貯飼料的DM含量顯著下降了28.74 g·kg-1 FM（Plt;0.05），S組青貯飼料的DM含量顯著下降了21.04 g·kg-1 FM（Plt;0.05）；F組青貯飼料的CP含量顯著下降了51.00 g·kg-1DM（Plt;0.05），S組青貯飼料的CP含量顯著下降了40.41 g·kg-1DM（Plt;0.05）；S組青貯飼料的WSC含量顯著下降了13.65 g·kg-1DM（Plt;0.05）。含水量×青貯時(shí)間對(duì)青貯飼料的CP，NDF和WSC含量存在交互作用。

2.3 柱花草青貯過(guò)程中發(fā)酵品質(zhì)動(dòng)態(tài)變化

不同含水量柱花草青貯發(fā)酵品質(zhì)變化見(jiàn)表3，含水量對(duì)青貯飼料的pH值、氨態(tài)氮、乳酸、丙酸和丁酸含量均有顯著影響（Plt;0.05）。隨著含水量的降低，青貯第30 d F組青貯飼料的pH值顯著低于S組青貯飼料（5.06vs 5.38，Plt;0.05）；S組青貯飼料的氨態(tài)氮在所有的青貯時(shí)間點(diǎn)均極顯著低于F組青貯飼料（Plt;0.01）；青貯第60 d F組青貯飼料乳酸和丁酸含量顯著高于S組，F(xiàn)組的乳酸和丁酸的含量分別為6.57 g·kg-1 DM和7.67 g·kg-1 DM，S組的乳酸和丁酸的含量分別為2.47 g·kg-1 DM和3.03 g·kg-1 DM（Plt;0.05）。青貯天數(shù)對(duì)柱花草青貯飼料pH值，氨態(tài)氮，乳酸，乙酸，丙酸和丁酸含量均有顯著影響（Plt;0.05）。隨著青貯天數(shù)的增加，F(xiàn)組青貯飼料的pH值在青貯第30 d后顯著下降至5.06（Plt;0.05），S組青貯飼料的pH值在青貯第60 d后顯著下降至5.27（Plt;0.05）。F組青貯飼料和S組青貯飼料的NH3-N含量隨著青貯時(shí)間的增加都呈極顯著上升（Plt;0.01），但S組青貯飼料的NH3-N極顯著低于F組（Plt;0.01）。在整個(gè)青貯發(fā)酵期間，F(xiàn)組青貯發(fā)酵至第60 d乳酸的含量最高為6.47 g·kg-1 DM；F組和S組青貯飼料的乙酸，丙酸和丁酸含量均隨著青貯天數(shù)的增多顯著增加（Plt;0.05），S組青貯發(fā)酵至第60 d乙酸含量最高為7.05 g·kg-1 DM，S組青貯飼料的丙酸含量在青貯14 d達(dá)到最大值2.14 g·kg-1 DM，F(xiàn)組青貯發(fā)酵至第60 d丁酸含量最高為7.67 g·kg-1 DM。青貯天數(shù)×含水量對(duì)青貯柱花草的pH值、氨態(tài)氮、乳酸、丙酸和丁酸含量存在交互作用（Plt;0.05）。

2.4 不同含水量柱花草青貯14 d和60 d微生物群落變化

2.4.1 alpha多樣性 由圖1可知，青貯14 d后，F(xiàn)組青貯飼料的Chao 1指數(shù)與S組青貯飼料的相比變化顯著（Plt;0.05），但青貯60 d后F組青貯飼料的Chao 1指數(shù)與S組青貯飼料的相比無(wú)顯著變化。此外，青貯14 d和60 d的F組青貯飼料和S組青貯飼料的Simpson指數(shù)描述微生物群落多樣性的指標(biāo)并無(wú)顯著差異。

2.4.2 屬水平上的微生物多樣性分析 不同含水量柱花草在青貯14 d和60 d后在微生物在屬水平上的相對(duì)豐度差異見(jiàn)圖2。隨著青貯天數(shù)的增加，F(xiàn)組青貯飼料中（D14_F，D60_F）乳球菌屬（Lactococcus）相對(duì)豐度顯著下降（D14_F，16.81%；D60_F，7.70%；Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_12（Clostridium_sensu_stricto_12）相對(duì)豐度顯著增多（D14_F，5.64%；D60_F，11.51%；Plt;0.05）；芽孢乳酸桿菌屬（Sporolactobacillus）相對(duì)豐度顯著增多（D14_F，0.00%；D60_F，10.55%；Plt;0.05）。S組青貯飼料中（D14_S，D60_S），乳球菌屬相對(duì)豐度顯著減少（D14_S，21.96%；D60_S，7.89%；Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_12相對(duì)豐度顯著增多（D14_S，0.18%；D60_S，6.49%；Plt;0.05）；乳桿菌屬（Lactobacillus）相對(duì)豐度顯著增多（D14_S，4.17%；D60_S，12.64%；Plt;0.05）；魏斯氏菌屬（Weissella）對(duì)豐度顯著增多（D14_S，1.67%；D60_S，7.99%；Plt;0.05）。

F組青貯飼料和S組青貯飼料中主要微生物屬為腸桿菌屬（Enterobacter），乳球菌屬，乳桿菌屬和梭狀芽孢桿菌_12 等。F組青貯飼料與S組青貯飼料相比并未抑制青貯發(fā)酵14 d和60 d腸桿菌屬的相對(duì)豐度（D14_F，19.15%；D14_S，22.37%；D60_F，16.33%；D60_S，18.96%；Plt;0.05），但顯著抑制了梭狀芽孢桿菌_12 的相對(duì)豐度（D14_F，5.46%；D14_S，0.18%；D60_F，11.51%；D60_S，6.49%；Plt;0.05），并且在青貯發(fā)酵60 d，降低柱花草含水量顯著提升了乳桿菌屬和魏斯氏菌屬相對(duì)豐度（Plt;0.05）。在整個(gè)青貯過(guò)程中，降低含水量并未對(duì)青貯飼料中乳球菌屬，克雷伯氏菌屬（Klebsiella），腸球菌屬（Enterrococcus），克盧維拉菌屬（Kluyvera）和勞特拉菌屬（Raoultella）的相對(duì)豐度有明顯影響。

2.4.3 不同含水量柱花草青貯14 d和60 d微生物群落（屬水平）與發(fā)酵指標(biāo)關(guān)聯(lián)性分析 通過(guò)對(duì)不同含水量柱花草青貯14 d和60 d微生物群落（屬水平）與發(fā)酵指標(biāo)Pearson關(guān)聯(lián)性分析（圖3），發(fā)現(xiàn)F組青貯第14 d后（圖3A）腸桿菌屬與WSC含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；乳球菌屬與DM含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05），與NDF含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01）；克雷伯氏菌屬與AA含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_12 與AA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；科薩科尼亞腸桿菌屬（Caproiciproducens）與BA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；魏斯氏菌屬與pH值和CP含量呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01）；梭狀芽孢桿菌_1（Clostridium_sensu_stricto_1）與LA，NH3-N含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；己酸菌屬（Caproiciproducens）與LA，NH3-N含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）。

F組青貯第60 d后（圖3C）乳桿菌屬與PA含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_12 與NH3-N含量呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01），與DM含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01）；克雷伯氏菌屬與pH值呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）；科薩科尼亞腸桿菌屬與BA，ADF含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與WSC，CP含量呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01）；克盧維拉菌屬與LA含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）；泛菌屬（Pantoea）與PA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；明串珠菌屬（leuconostoc）與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；大腸桿菌屬（Escherichia-shigella）與LA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）。

S組青貯第14 d后（圖3B）腸桿菌屬與NH3-N含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05），與CP含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；乳球菌屬與PA含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）；乳桿菌屬與AA含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）；科薩科尼亞腸桿菌屬與BA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；魏斯氏菌屬與PA含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）；布丘氏菌屬（Buttiauxella）與LA含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_12 與PA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_1與AA含量呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01）。

S組青貯第60 d后（圖3D）腸桿菌與WSC含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01），與ADF含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_12 與LA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；克雷伯氏菌屬與NH3-N含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）；明串珠菌屬與NH3-N，NDF含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）;梭狀芽孢桿菌_1與BA，WSC含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05），與ADF含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_11 與WSC含量呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01），與ADF含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01）；己酸菌屬與AA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01），與BA含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）；乳梭菌屬（Lachnoclostridium_5）與AA，DM含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）。

2.4.4 不同含水量柱花草青貯14 d和60 d微生物群落（屬水平）的LEfSe差異物種分析 通過(guò)對(duì)不同含水量柱花草青貯14 d和60 d微生物群落進(jìn)行LEfSe（LDA閾值為2）分析，由圖4可知，有1個(gè)門，3個(gè)綱，6個(gè)目，11 個(gè)科，16 個(gè)屬在組間豐度存在差異顯著（Plt;0.05）。由圖4可知，降低柱花草含水量明顯會(huì)減少富集的青貯微生物種類，D14_F組在綱水平顯著富集的物種為陰性菌綱（Negativicutes），在目水平上顯著富集的物種為單胞菌目（Selenomonadales），在科水平上顯著富集的物種為拜葉林克氏菌科（Beijerinckiaceae），毛螺旋菌科（Lachnospiraceae），韋榮球菌科（Veillonellaceae），在屬水平上顯著富集的物種為梭狀芽孢桿菌屬_11（Clostridium_sensu_stricto_11），甲基桿菌屬（Methylobacterium），假結(jié)核桿菌屬 （Pseudocitrobacter），梳狀菌屬（Pectinatus），乳梭菌屬_5（Lachnoclostridium_5）。D14_S組在目水平上顯著富集的物種為乳酸桿菌目（Lactobacillales）。在科水平上顯著富集的物種為鏈球菌科（Streptococcaceae），莫拉菌科（Moraxellaceae），在屬水平上顯著富集的物種為乳球菌屬，克雷伯氏菌，不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）。D60_F組在門水平上顯著富集的物種為（Actinobacteria）在綱水平上顯著富集的物種為梭菌綱（Clostridia），放線菌綱（Actinobacteria），在目水平上顯著富集的物種為梭菌目（Clostridiales），疣微菌目（Verrucomicrobiales），雙歧桿菌目（Bifidobacteriales），在科水平上顯著富集的物種為梭菌科_1（Clostridiaceae_1），瘤胃菌科（Ruminococcaceae），克曼菌科（Akkermansiaceae），雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae），在屬水平上顯著富集的物種為梭狀芽孢桿菌屬_12，己酸菌屬，梭狀芽孢桿菌屬_1，阿克曼氏菌屬（Akkermansia），雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）。D60_S組在目水平上顯著富集的物種為丙酸桿菌目（Propionibacteriales）；在科水平上顯著富集的物種為乳桿菌科（Lactobacillaceae），丙酸桿菌科（Propionibacteriaceae）；在屬水平上顯著富集的物種為乳桿菌屬，嗜酸丙酸桿菌屬（Acidipropionibacterium），明串珠菌屬。

3 討論

3.1 柱花草原料特點(diǎn)

在本試驗(yàn)中F組與S組柱花草原料的干物質(zhì)含量分別為194.55 g·kg-1 FM和314.12 g·kg-1 FM，S組干物質(zhì)含量與Bao等［7］報(bào)道的適宜柱花草青貯的DM含量接近。本試驗(yàn)柱花草CP含量高于Liu等［16］報(bào)道的104.1 g·kg-1 DM，NDF和ADF含量均低于鄒璇等［17］的報(bào)道，相同原料中的營(yíng)養(yǎng)成分含量有差別，可能是因?yàn)槠贩N，生長(zhǎng)地域，氣候等不同所造成的［18］。本試驗(yàn)柱花草附著乳酸菌的數(shù)量已達(dá)到良好青貯飼料標(biāo)準(zhǔn)（＞5.0 lg cfu·g-1 FW），但因水溶性碳水化合物含量低，緩沖能高等原因，酵母菌和霉菌以及其他有害微生物的附著等原因可能會(huì)降低柱花草的青貯品質(zhì)［19］。

3.2 含水量對(duì)柱花草青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和發(fā)酵特性的影響

青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分含量會(huì)隨著青貯時(shí)間變化而變化［20］，而原料特性會(huì)直接影響青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)［21］。本試驗(yàn)結(jié)果表明含水量對(duì)青貯飼料的DM，NDF，ADF，WSC，pH值，氨態(tài)氮，乳酸和丁酸含量均有顯著影響，青貯時(shí)間對(duì)柱花草青貯飼料的DM，CP，NDF，WSC，pH值，氨態(tài)氮，乳酸，乙酸，丙酸和丁酸含量有顯著影響。在本試驗(yàn)中，兩組柱花草青貯飼料的DM，CP和WSC含量都隨著青貯時(shí)間的增加而下降，在青貯過(guò)程中蛋白降解是不可避免的，主要是原料中的梭菌，腸桿菌等有害微生物活動(dòng)以及植物所含的蛋白水解酶所引起［22］。蛋白質(zhì)被分解后，會(huì)使青貯飼料品質(zhì)下降，影響反芻動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的吸收和利用［23］。隨著青貯時(shí)間的增加，本試驗(yàn)中兩組青貯柱花草的蛋白質(zhì)含量都極顯著下降，氨態(tài)氮含量極顯著上升，可能是因?yàn)樵现蠾SC含量遠(yuǎn)低于良好青貯所需的水溶性碳水化合物含量，乳酸菌等沒(méi)有充足的發(fā)酵底物，無(wú)法使青貯飼料快速酸化降低pH值抑制梭菌，腸桿菌等有害微生物對(duì)粗蛋白的分解。但通過(guò)降低青貯前柱花草含水量有效的抑制了柱花草青貯飼料的粗蛋白的分解，提高柱花草青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分的保存率。S組柱花草青貯飼料的氨態(tài)氮含量顯著低于F組柱花草青貯飼料的氨態(tài)氮含量，可能是低含水量抑制了如梭菌等微生物活性，而梭菌被認(rèn)為是引起蛋白分解產(chǎn)生氨態(tài)氮的主要微生物［24］，本試驗(yàn)中16s rRNA測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果S組梭菌屬相對(duì)豐度顯著低于F組也印證了該推測(cè)。本試驗(yàn)S組的NDF和ADF含量顯著高于F組，其原因可能是隨著植物的含水量下降，其他溶解性化合物的濃度可能會(huì)增加，包括礦物質(zhì)和一些有機(jī)物，這些物質(zhì)不會(huì)被纖維測(cè)定過(guò)程所提取，因此在相對(duì)濃縮的狀態(tài)下，NDF和ADF含量可能會(huì)升高，這與郭香等［25］的研究結(jié)果相一致。青貯飼料NDF和ADF含量隨青貯天數(shù)的增加呈下降趨勢(shì)，與郝俊峰等［26-27］研究結(jié)果一致，這可能是因?yàn)榍噘A發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌等微生物分泌特殊的胞外酶會(huì)使植物細(xì)胞壁中的纖維素，半纖維素等物質(zhì)降解［28］。

青貯飼料的pH值低于4.2 以下是高品質(zhì)青貯飼料的標(biāo)準(zhǔn)之一［24］，但豆科類作物具有高緩沖能力，自然青貯后的豆科牧草pH值達(dá)到4.2 以下并不是作為判斷豆科牧草青貯飼料是否為優(yōu)質(zhì)飼料的唯一標(biāo)準(zhǔn)［29］。S組青貯飼料pH值高于F組青貯飼料，可能是低水分含量會(huì)影響微生物活性和代謝速率，使產(chǎn)酸菌處于生理干旱狀態(tài)，青貯體系中的無(wú)機(jī)離子的積累受到抑制，pH值難以下降［5］。青貯發(fā)酵60 d，S組青貯飼料乙酸含量高于F組青貯飼料，原因可能是S組青貯飼料中Lactobacillus相對(duì)豐度顯著高于F組，Lactobacillus會(huì)因?yàn)榘l(fā)酵糖含量不足而利用乳酸產(chǎn)生更多乙酸［30］；S組青貯飼料丁酸含量低于F組青貯飼料，可能是因?yàn)樗缶幕钚砸资芮噘A體系中水分活度的影響，在低含水量條件下會(huì)抑制梭菌的活性，從而降低柱花草青貯飼料中的丁酸的產(chǎn)生［31］，亦有研究報(bào)道當(dāng)青貯原料中的干物質(zhì)含量大于30% 時(shí)，可以使青貯發(fā)酵過(guò)程中的梭菌發(fā)酵的風(fēng)險(xiǎn)降低［32］。在柱花草青貯發(fā)酵過(guò)程中，丁酸含量隨著青貯天數(shù)的呈上升趨勢(shì)，這與Silva等［33］的研究一致，這表明本試驗(yàn)柱花草青貯飼料中存在較高的丁酸含量這也可能是造成柱花草青貯飼料整體pH值＞ 5.0 的原因之一。結(jié)合屬水平上微生物群落分析結(jié)果，在青貯發(fā)酵14 d和60 d時(shí)都可以檢測(cè)到梭菌屬的存在，這與較高的pH值和丁酸的存在一致。

3.3 含水量對(duì)柱花草青貯微生物多樣性的影響

青貯是由多種微生物共同參與的群落演替過(guò)程，涉及許多復(fù)雜微生物的相互作用，因此研究青貯飼料的微生物群落結(jié)構(gòu)具有十分重要的意義［34］。本試驗(yàn)分析了不同含水量柱花草青貯14 d和60 d青貯發(fā)酵微生物多樣性。在不同處理組之間，隨含水量的降低，青貯14 d微生物群落豐富度顯著下降，青貯60 d后對(duì)微生物群落豐富度無(wú)顯著影響，這與Chen等［35］的青貯發(fā)酵天數(shù)對(duì)大蒜皮混合高水分皇竹草（Pennisetum hydridum）青貯發(fā)酵品質(zhì)和微生物群落影響研究結(jié)果相似，因此可以推測(cè)青貯微生物群落豐富度的變化不僅與青貯原料含水量有關(guān)聯(lián)，還與青貯時(shí)間有關(guān)聯(lián)。

屬水平的微生物豐度分析表明，柱花草青貯發(fā)酵60 d后，腸桿菌屬，乳球菌屬，乳桿菌屬和梭菌屬等是最主要的微生物屬，這與He等［36］ 的研究結(jié)果不一致，其研究發(fā)現(xiàn)柱花草青貯60 d后優(yōu)勢(shì)微生物屬種類為乳桿菌屬，梭菌屬，腸球菌屬和魏斯氏菌屬等，相同材料青貯發(fā)酵后優(yōu)勢(shì)微生物不同可能是受生長(zhǎng)地域氣候，原料特性或栽培管理?xiàng)l件的不同所導(dǎo)致［37］。

F組與S組相比，通過(guò)降低青貯原料含水量顯著降低了青貯發(fā)酵體系中梭菌屬的相對(duì)豐度。發(fā)酵60 d后，相較于F組，S組青貯飼料的乳桿菌屬的相對(duì)豐度顯著提升，這與Fang等［24］的研究結(jié)果一致，表明降低柱花草含水量可以顯著降低有害菌梭菌屬相對(duì)豐度，提高有益菌乳桿菌屬相對(duì)豐度。隨著青貯時(shí)間的增加，F(xiàn)組和S組乳球菌屬相對(duì)豐度均顯著下降，這與McDonald等［38］的研究結(jié)果一致，這可能是因?yàn)槿榍蚓鷮僦饕谇噘A前期參與青貯發(fā)酵進(jìn)程，產(chǎn)生乳酸，降低青貯飼料pH值［39］；F組和S組梭菌屬相對(duì)豐度顯著上升，可能是梭菌屬于嚴(yán)格厭氧芽孢菌，在青貯前期植物纖維空隙中殘留的氧氣對(duì)梭菌活性具有抑制作用，隨著青貯時(shí)間的增加，青貯體系內(nèi)的氧氣被好氧微生物消耗殆盡，梭菌芽孢恢復(fù)活性［40］。

通過(guò)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，D14_F組腸桿菌屬與WSC含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05），D14_S組腸桿菌屬與氨態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05），與CP含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05），D60_S組腸桿菌屬與WSC含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01），研究發(fā)現(xiàn)［35］腸桿菌會(huì)利用青貯飼料中的WSC和CP，產(chǎn)生丁酸、氨態(tài)氮和生物胺等不良發(fā)酵產(chǎn)物，抑制乳酸菌繁殖和生長(zhǎng)，影響青貯飼料的品質(zhì)，Pearson相關(guān)性分析表明腸桿菌屬可能抑制了柱花草的青貯發(fā)酵進(jìn)程，與乳酸菌等有益微生物爭(zhēng)奪青貯原料中的發(fā)酵底物，代謝產(chǎn)生不良產(chǎn)物。乳酸菌被認(rèn)為是決定青貯飼料品質(zhì)的最關(guān)鍵的微生物，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)D60_F組乳桿菌屬與柱花草青貯飼料丙酸含量呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05），這與Zeng等［41］ 的研究結(jié)果不一致，其作用還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

降低青貯前柱花草含水量提高了柱花草青貯飼料的粗蛋白含量，降低氨態(tài)氮和丁酸含量。此外，降低含水量顯著影響柱花草青貯屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，萎蔫后柱花草青貯飼料中的不良微生物梭菌屬相對(duì)豐度顯著低于高含水量柱花草青貯飼料，有益微生物魏斯氏菌屬和乳桿菌屬相對(duì)豐度顯著高于高含水量柱花草青貯飼料。綜上所述，降低青貯前柱花草的含水量更有利于改善柱花草青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分的保存。

參考文獻(xiàn)

［1］ 韓建成，吳群，藺紅玲，等. ‘熱研2號(hào)’柱花草和‘熱研4號(hào)’王草混合青貯對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分及發(fā)酵品質(zhì)的影響［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2023，44（4）：809-815

［2］ KUNG JR L，SHAVER R，GRANT R，et al. Silage review：Interpretation of chemical，microbial，and organoleptic components of silages［J］. Journal of Dairy Science，2018，101（5）：4020-4033

［3］ SU R，KE W，USMAN S，et al. Dry matter content and inoculant alter the metabolome and bacterial community of alfalfa ensiled at high temperature［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2023，107（11）：3443-3457

［4］ 閆星全，賈玉山，格根圖，等. 原料含水量及添加劑種類對(duì)青貯苜蓿品質(zhì)的影響［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（6）：1861-1866

［5］ 鐘書(shū)，張曉娜，楊云貴，等. 乳酸菌和纖維素酶對(duì)不同含水量紫花苜蓿青貯品質(zhì)的影響［J］. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2017，29（5）：1821-1830

［6］ KE W，DING Z，LI F，et al. Effects of malic or citric acid on the fermentation quality，proteolysis and lipolysis of alfalfa silage ensiled at two dry matter contents［J］. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，2022，106（5）：988-994

［7］ BAO J，WANG L，YU Z，et al. Effects of different moisture levels and additives on the ensiling characteristics and in vitro digestibility of stylosanthes silage［J］. Animals，2022，12（12）：1555

［8］ HE L，LI S，WANG C，et al. Effects of vanillic acid on dynamic fermentation parameter，nitrogen distribution，bacterial community，and enzymatic hydrolysis of stylo silage［J］. Frontier in Microbiology，2021（12）：690801

［9］ 黃佩珊，張超，陳丹丹，等. 辣木葉提取物對(duì)柱花草和象草青貯品質(zhì)的影響［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（7）：2194-2202

［10］王堅(jiān)，李雪楓，王學(xué)梅，等. 添加劑對(duì)柱花草青貯過(guò)程中蛋白降解及營(yíng)養(yǎng)成分影響［J］. 飼料研究，2020，43（10）：84-89

［11］WEATHERBURN M W. Phenol-hypochlorite reaction for determinations of ammonia［J］. Annual of Chemistry，1967，39 （8）：971-974

［12］OWENS V N，ALBRECHT K A，MUCK R E，et al. Protein degradation and fermentation characteristics of clover and alfalfa silage harvested with varying levels of total nonstructural carbohydrate［J］. Crop Science，1999，9 （6）：1873-1880

［13］VAN SOEST P J，ROBERTSON J B，LEWIS B A. Methods for dietary fiber，neutral detergent fiber，and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition［J］. Journal of Dairy Science，1991，74 （10）：3583-3597

［14］FU Z，SUN L，HOU M，et al. Effects of different harvest frequencies on microbial community and metabolomic properties of annual ryegrass silage［J］. Frontiers in Microbiology，2022（13）：971449

［15］LONG S，LI X，YUAN X，et al. The effect of early and delayed harvest on dynamics of fermentation profile，chemical composition，and bacterial community of king grass silage［J］. Frontiers in Microbiology，2022（13）：864649

［16］LIU Q，ZHANG J，SHI S，et al. The effects of wilting and storage temperatures on the fermentation quality and aerobic stability of stylo silage［J］. Animal Science Journal，2011，82（4）：549-553

［17］鄒璇，王成，陳曉陽(yáng)，等. 桉葉油和迷迭香油對(duì)柱花草青貯品質(zhì)的影響［J］. 中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2022，44（2）：89-97

［18］付東青. 南北疆兩個(gè)區(qū)域青貯玉米農(nóng)藝性狀與青貯品質(zhì)研究［D］. 石河子：石河子大學(xué)，2021：3-6

［19］ZANG Y C，LI D X，WANG X K，et al. Fermentation dynamics and diversity of bacterial community in four typical woody forages［J］. Annals of Microbiology，2019，69 （3）：233-240

［20］MCENIRY J，O’KIELY P，CLIPSON N J W，et al. Assessing the impact of various ensilage factors on the fermentation of grass silage using conventional culture and bacterial community analysis techniques［J］. Journal of Applied Microbiology，2010，108（5）：1584-1593

［21］GUAN H，YAN Y，LI X，et al. Microbial communities and natural fermentation of corn silages prepared with farm bunker-silo in Southwest China［J］. Bioresource Technology，2018（265）：282-290

［22］BORREANI，GTABACCOE，SCHMIDT R J，et al. Silage review：factors affecting dry matter and quality losses in silages［J］. Journal of Dairy Science，2018，101（5）：3952-3979

［23］CHEN R，LI M，YANG J，et al. Exploring the effect of wilting on fermentation profiles and microbial community structure during ensiling and air exposure of king grass silage［J］. Frontiers in Microbiology，2022（13）：971426

［24］FANG D，DONG Z，WANG D，et al. Evaluating the fermentation quality and bacterial community of high-moisture whole-plant quinoa silage ensiled with different additives［J］. Journal of Applied Microbiology，2022，132（5）：3578-3589

［25］郭香，陳德奎，陳娜，等. 含水量和添加劑對(duì)黃梁木葉青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2021，30（8）：199-205

［26］郝俊峰，于浩然，賈玉山，等. 青貯密度和青貯時(shí)間對(duì)紫花苜蓿發(fā)酵品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分的影響［J］. 草地學(xué)報(bào)，2022，30（9）：2492-2496

［27］胡煒東，曹曉娟，武俊英，等. 發(fā)酵時(shí)間對(duì)燕麥青貯發(fā)酵品質(zhì)和微生物群落的影響［J］. 飼料研究，2022，45（17）：106-110

［28］ZHANG J，LIU Y，WANG Z，et al. Effects of different types of LAB on dynamic fermentation quality and microbial community of native grass silage during anaerobic fermentation and aerobic exposure［J］. Microorganisms，2023，11（2）：513

［29］JOBIM C C，NUSSIO L G，REIS R A，et al. Methodological advances in evaluation of preserved forage quality ［J］. Revista Brasileira de Zootecnia，2007（36）：101-119

［30］NISHINO N，LI Y，WANG C，et al. Effects of wilting and molasses addition on fermentation and bacterial community in guinea grass silage［J］. Letters in Applied Microbiology，2012，54（3）：175-181

［31］ZHENG M L，NIU D Z，JIANG D，et al. Dynamics of microbial community during ensiling direct-cut alfalfa with and without LAB inoculant and sugar［J］. Journal of Applied Microbiology，2017，122（6）：1456-1470

［32］KUNG L，STOUGH E C，MCDO NELL E E，et al. The effect of wide swathing on wilting times and nutritive value of alfalfa haylage ［J］. Journal of Dairy Science，2010，93（4）：1770-1773

［33］DA SILVA J S，RIBEIRO K G，PEREIRA O G，et al. Nutritive value and fermentation quality of palisade grass and stylo mixed silages［J］. Animal Science Journal，2018，89（1）：72-78

［34］鄭明利. 苜蓿青貯中梭菌多樣性及其誘發(fā)梭菌發(fā)酵的機(jī)理研究［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017：11-15

［35］CHEN J，HUANG G，XIONG H，et al. Effects of mixing garlic skin on fermentation quality，microbial community of high moisture Pennisetum hydridum Silage［J］. Frontiers in Microbiology，2021（12）：770591

［36］HE L，WANG C，XING Y，et al. Ensiling characteristics，proteolysis and bacterial community of high-moisture corn stalk and stylo silage prepared with Bauhinia variegate flower［J］. Bioresource Technology，2020（296）：122336

［37］HUANG Y，QIU C，WANG Y，et al. Effect of tea polyphenols on the fermentation quality，protein preservation，antioxidant capacity and bacterial community of stylo silage［J］. Frontiers in Microbiology，2022（13）：993750

［38］MCDONALD P，HENDERSON A R，HERON S J. The biochemistry of silage （2nd Editon） ［M］. Aberystwyth：Mambrian Printers Ltd，1991：15-238

［39］GUO X，ZHENG P，ZOU X，et al. Influence of pyroligneous acid on fermentation parameters，co2 production and bacterial communities of rice straw and stylo silage［J］. Frontiers in Microbiology，2021（12）：1434

［40］徐瑩. 丁酸梭菌清液發(fā)酵工藝的研究［D］. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009：6-9

［41］ZENG T，LI X，GUAN H，et al. Dynamic microbial diversity and fermentation quality of the mixed silage of corn and soybean grown in strip intercropping system［J］. Bioresource Technology，2020（313）：123655

（責(zé)任編輯 劉婷婷）