血清miRNAs差異性表達(dá)與圍術(shù)期應(yīng)激性心肌病的關(guān)系

摘要目的：分析血清微小核糖核酸（miRNAs）差異性表達(dá)與圍術(shù)期應(yīng)激性心肌?。≒SC）發(fā)生的關(guān)系。方法：選取2019年3月—2022年3月非心臟手術(shù)心肌損傷病人48例，包括24例出現(xiàn)心肌損傷病人（PSC組）與24例匹配病人（非PSC組）。分別在5個時間點（術(shù)前、切皮后2、6 h及術(shù)后1、2 d）收集血液樣本，采用實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)分析miR-122-5p、miR-150-5、miR-126-3p、miR-21-5p、miR-208-3p表達(dá)。結(jié)果：術(shù)前、切皮后2、6 h及術(shù)后1 d，PSC組miR-122-5p表達(dá)低于非PSC組；術(shù)前、切皮后2 h及術(shù)后1 d，PSC組miR-21-5p高于非PSC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。受試者工作特征（ROC）曲線顯示，miR-122-5p、miR-21-5p可預(yù)測PSC發(fā)生。單變量分析顯示，高miR-122-5p水平病人圍術(shù)期PSC風(fēng)險降低，高miR-21-5p水平病人圍術(shù)期PSC風(fēng)險增加。多變量分析顯示，miR-122-5p、miR-21-5p是病人圍術(shù)期PSC的獨立影響因素。結(jié)論：術(shù)前miR-21-5p、miR-122-5p水平可獨立預(yù)測圍術(shù)期PSC發(fā)生；術(shù)前miR-21-5p、miR-122-5p可能基于心臟生物標(biāo)志物進(jìn)行術(shù)前風(fēng)險評估。

關(guān)鍵詞應(yīng)激性心肌??；微小核糖核酸；圍術(shù)期；非心臟手術(shù)

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.027

根據(jù)非心臟手術(shù)后血漿肌鈣蛋白升高的定義，約25%的圍術(shù)期病人發(fā)生應(yīng)激性心肌病（perioperative stress cardiomyopathy，PSC），且先于非心臟疾病發(fā)生［1］。有研究顯示，PSC可能與冠狀動脈疾病的嚴(yán)重程度無關(guān)［2］。圍術(shù)期風(fēng)險評估的臨床實踐指南提倡使用臨床風(fēng)險指數(shù)進(jìn)行評估，如修訂的心臟風(fēng)險指數(shù)［3］。心臟風(fēng)險指數(shù)在高風(fēng)險和血管手術(shù)病人中表現(xiàn)出較低的鑒別能力［4］。相關(guān)圍術(shù)期指南提示，高風(fēng)險病人測定術(shù)前相關(guān)生物標(biāo)志物，可識別心血管疾病嚴(yán)重程度被低估的病人。急性冠脈綜合征與心肌組織釋放微小核糖核酸（miRNAs）有關(guān)，通常在血漿肌鈣蛋白增加前可檢測到［5］。miRNAs是小的非編碼RNA分子（約23個核苷酸），通過信使RNA的降解和/或抑制信使RNA翻譯進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)［5］。miRNAs可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞分化和存活、鈣調(diào)節(jié)、凋亡、傳導(dǎo)、炎癥和壞死［6］，其與急性心肌梗死和急性冠脈綜合征相關(guān)［5］。miRNAs變化可能參與PSC的病理生理。本研究對PSC病人非心臟手術(shù)前后血清樣本miRNAs表達(dá)進(jìn)行定量分析，并與對照組比較，旨在確定差異性表達(dá)的miRNAs與PSC的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2019年3月—2022年3月非心臟手術(shù)心肌損傷病人620例。納入標(biāo)準(zhǔn)：PSC定義為肌鈣蛋白I（TnI）＞99th百分位數(shù)（＞0.04 ng/mL）［7］。術(shù)后TnI＞99th百分位數(shù)的病人與術(shù)后TnI≤99th百分位數(shù)的病人匹配；按照年齡、性別、修訂的心臟風(fēng)險指數(shù)（RCRI）評分和術(shù)后時間進(jìn)行匹配。排除標(biāo)準(zhǔn)：心肌梗死和/或肺栓塞病人；接受腎臟替代治療的病人及術(shù)前TnI升高＞99%的病人。最終納入48例病人，包括24例出現(xiàn)心肌損傷病人（PSC組），24例匹配病人（非PSC組）。所有病人均簽署知情同意書。

1.2血清樣品制備

分別在5個時間點（術(shù)前、切皮后2、6 h及術(shù)后1、2 d）采集血液樣本。收集全血（10 mL）于普通試管中，室溫下凝結(jié)后離心，3 500×重力加速度（g）離心10 min，之后將血清等分到2 mL無RNA試管中，將樣品在－70 ℃下冷凍，分別用于TnI定量和miRNA分析。

1.3miRNA分離

使用miReasy血清/血漿高級試劑盒（丹麥Q(jìng)iagen公司）從200 μL血清樣本分離miRNA。為了進(jìn)行質(zhì)量控制，將1 μL含有UniSp2、UniSp4和UniSp5合成的miRNA摻入混合物（RNA Spike-in kit，丹麥Q(jìng)iagen公司）加入到每個樣品中，使用RNeasy UCP MiniElute色譜柱分離20 μL RNA，儲存在－20 ℃下用于批量分析。

1.4循環(huán)miRNAs

參照相關(guān)文獻(xiàn)［8］，選擇多數(shù)研究中檢測的5種miRNA（miR-122-5p、miR-150-5、miR-126-3p、miR-21-5p、miR-208-3p）。

1.5定量實時聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

使用miRcury LNA RT試劑盒（丹麥Q(jìng)iagen公司）將2 μL RNA逆轉(zhuǎn)錄成10 μL的最終反應(yīng)體積。采用Primus 96 plus熱循環(huán)儀（德國MWG生物技術(shù)公司），在42 ℃條件下反應(yīng)60 min，之后在95 ℃下孵育（反應(yīng)失活）5 min，最后在4 ℃下冷卻。將cDNA儲存在－20 ℃條件下。將cDNA稀釋（1∶40）并添加到主混合物中，之后平鋪在miRNA PCR定制板上，該定制板中含有預(yù)先設(shè)計的miRCURY LNA miRNA PCR測定，一式3份。使用應(yīng)用生物系統(tǒng)stepone plus RT-PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystem公司）進(jìn)行擴增。使用Applied Biosystem StepOneplus軟件中的二階導(dǎo)數(shù)方法確定循環(huán)量化值。miR-122-5p：正向引物5′-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3′，反向引物5′-AACAUCACCUGUGUGAGU-3′；miR-150-5：正向引物5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′，反向引物5′-UCACCGACAGGUUGAUGUU-3′；miR-126-3p：正向引物5′-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3′，反向引物5′-CGTGCCAGACATGGACCTAT-3′；miR-21-5p：正向引物5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′，反向引物5′-CGGGGTAGGTGAGACGAAG-3′；miR-208-3p：正向引物5′-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3′，反向引物5′-TCAGTTTGCTGCTGTTCTGGGTG-3′；U6：正向引物5′-GGGTTGGCTGGAAAGGA-3′，反向引物5′-AACUAGUAUGUGCACCUG-3′。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，不符合正態(tài)分布的定量資料以中位數(shù)、四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，采用t檢驗或非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗。定性資料以例數(shù)、百分比（%）表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。不同時間量化的miRNA表達(dá)比較采用重復(fù)測量方差分析。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估術(shù)前miR-122-5p、miR-21-5p水平預(yù)測PSC的臨床價值，計算ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）及95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）。應(yīng)用基線特征的單變量邏輯回歸模型，計算相應(yīng)的比值比（odds ratio，OR）。單變量分析中顯示P＜0.1的因素包括在多變量邏輯回歸模型。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組臨床資料比較（見表1）

2.2兩組不同時間循環(huán)miRNA表達(dá)比較

術(shù)前、切皮后2、6 h及術(shù)后1 d，PSC組miR-122-5p表達(dá)低于非PSC組；術(shù)前、切皮后2 h及術(shù)后1 d，PSC組miR-21-5p高于非PSC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1。

2.3術(shù)前miR-122-5p、miR-21-5p水平預(yù)測PSC的臨床價值

ROC曲線分析顯示，miR-122-5p、miR-21-5p預(yù)測PSC有較高的區(qū)分度（P＜0.001），詳見圖2。單變量分析顯示，高miR-122-5p水平病人圍術(shù)期PSC風(fēng)險降低，高miR-21-5p水平病人圍術(shù)期PSC風(fēng)險增加；多變量分析顯示，miR-122-5p、miR-21-5p是圍術(shù)期PSC的獨立影響因素。詳見表2。

3討論

PSC約占圍術(shù)期死亡的33.3%，導(dǎo)致住院時間延長，增加醫(yī)療費用［9］。手術(shù)、麻醉與高凝狀態(tài)、交感神經(jīng)系統(tǒng)和炎癥的激活有關(guān)，這些可能觸發(fā)PSC［10］。準(zhǔn)確的術(shù)前PSC風(fēng)險評估可告知病人手術(shù)的益處和風(fēng)險，指導(dǎo)手術(shù)或麻醉類型，決定術(shù)后護(hù)理的強度［11］。本研究評估了5種循環(huán)miRNAs，確定了miR-122-5p、miR-21-5p預(yù)測PSC具有較高的區(qū)分度。本研究數(shù)據(jù)受到樣本量的限制，但定量密切匹配的接受非心臟手術(shù)病人樣本中連續(xù)獲得的循環(huán)miRNA，確保了分析數(shù)據(jù)的可靠性，接受非心臟手術(shù)的病人血清較易檢測到miRNA。使用技術(shù)方面質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化的可重復(fù)取樣方案，分析心臟特異性miRNA的循環(huán)在非心臟手術(shù)后發(fā)生了變化［3］。miRNA表達(dá)水平不依賴于肌鈣蛋白的濃度，表明急性冠脈綜合征病人miRNA水平反映了普遍的應(yīng)激/損傷反應(yīng)。

由于miRNAs與病理生理學(xué)密切相關(guān)，具有高度的特異性，miRNAs已成為有研究價值的生物標(biāo)志物［5］。miRNAs對冠心病、急性冠脈綜合征或急性心肌梗死病人有預(yù)后價值［12］。本研究結(jié)果顯示，miR-21-5p、miR-122-5p是圍術(shù)期PSC的獨立影響因素，可預(yù)測PSC發(fā)生。有研究顯示，miR-21-5p與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)［13］。Hnninen等［14］研究顯示，miR-21-5p水平升高的病人90 d后死亡風(fēng)險增加1.8倍。本研究結(jié)果顯示，PSC組術(shù)前miR-21-5p表達(dá)高于非PSC組，且高miR-21-5p水平病人圍術(shù)期PSC風(fēng)險增加5.23倍。因此，miR-21-5p表達(dá)變化可能參與多數(shù)PSC病人的病理生理過程。雖然miR-21-5p的預(yù)后價值在今后的研究中得到證實，與其他miRNAs相比，miR-21-5p幾乎在每個組織中均有表達(dá)，是一種非特異性生物標(biāo)志物［15］。

miR-122通過靶基因調(diào)節(jié)心血管炎癥、自噬、凋亡、氧化應(yīng)激、纖維化和功能障礙，對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生多種影響，是診斷心血管疾病的生物標(biāo)志物［16］。有研究表明，miR-122可預(yù)測心房顫動發(fā)生風(fēng)險［17］。心房顫動小鼠miR-122水平顯著降低，且高表達(dá)miR-122通過調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白（如Bcl-2和Caspase-3）表達(dá)參與心肌細(xì)胞的增殖和凋亡，表明miR-122水平變化可能預(yù)測并涉及PSC的發(fā)展［18］。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前，PSC組術(shù)前miR-122-5p表達(dá)低于非PSC組，且高miR-122-5p水平病人圍術(shù)期PSC風(fēng)險降低。Cortez-Dias等［19］報道了ST段抬高型心肌梗死病人的死亡率和再發(fā)急性心肌梗死率較高，取決于miR-122-5p/miR-122-133b比值。miR-122-5p靶基因富集分析表明，miR-122-5p主要調(diào)節(jié)Toll樣受體信號通路；先天免疫因子在多數(shù)心臟疾病中發(fā)揮著重要作用，尤其是Toll樣受體，其參與了冠狀動脈疾病的病理生理進(jìn)展［20］。由于炎癥與PSC的發(fā)展密切相關(guān)，術(shù)前miR-122-5p表達(dá)減少可能不利于術(shù)后炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致心肌損傷。

綜上所述，術(shù)前miR-21-5p、miR-122-5p水平可獨立預(yù)測圍術(shù)期PSC發(fā)生；術(shù)前miR-21-5p、miR-122-5p可能基于心臟生物標(biāo)志物進(jìn)行術(shù)前風(fēng)險評估。

參考文獻(xiàn)：

［1］陳俊，呂玲春，沈珈誼，等.基于數(shù)據(jù)挖掘探討應(yīng)激性心肌病臨床特點及住院死亡危險因素［J］.臨床心血管病雜志，2021，37（6）：553-556.

［2］KOSHY A N，HA F J，GOW P J，et al.Computed tomographic coronary angiography in risk stratification prior to non-cardiac surgery：a systematic review and meta-analysis［J］.Heart，2019，105（17）：1335-1342.

［3］BIENER M，GIANNITSIS E，THUM T，et al.Prognostic value of circulating microRNAs compared to high-sensitivity troponin T in patients presenting with suspected acute coronary syndrome to the emergency department［J］.Clinical Biochemistry，2022，99：9-16.

［4］MAY S M，REYES A，MARTIR G，et al.Acquired loss of cardiac vagal activity is associated with myocardial injury in patients undergoing noncardiac surgery：prospective observational mechanistic cohort study［J］.British Journal of Anaesthesia，2019，123（6）：758-767.

［5］NTELIOS D，GEORGIOU E，ALEXOUDA S，et al.A critical approach for successful use of circulating microRNAs as biomarkers in cardiovascular diseases：the case of hypertrophic cardiomyopathy［J］.Heart Failure Reviews，2022，27（1）：281-294.

［6］ABDALLAH H Y，HASSAN R，F(xiàn)AREED A，et al.Identification of a circulating microRNAs biomarker panel for non-invasive diagnosis of coronary artery disease：case-control study［J］.BMC Cardiovascular Disorders，2022，22（1）：286.

［7］劉春燕，鄧朝暉，宋穎博，等.心肌肌鈣蛋白I檢測方法的性能評價［J］.臨床檢驗雜志，2022，40（7）：490-494.

［8］NESTELBERGER T，BOEDDINGHAUS J，GIMNEZ M R，et al.Direct comparison of high-sensitivi cardiac troponin T and I in the early differentiation of type 1 vs type 2 myocardial infarction［J］.European Heart Journal Acute Cardiovascular Care，2022，11（1）：62-74.

［9］SZCZEKLIK W，F(xiàn)RONCZEK J.Myocardial injury after noncardiac surgery-an update［J］.Current Opinion in Anaesthesiology，2021，34（3）：381-386.

［10］GABRIEL R A，CLARK A I，NGUYEN A P，et al.The association of preoperative hematocrit and transfusion with mortality in patients undergoing elective non-cardiac surgery［J］.World Journal of Surgery，2018，42（7）：1939-1948.

［11］MODHA K，WHINNEY C.Preoperative evaluation for noncardiac surgery［J］.Annals of Internal Medicine，2022，175（11）：ITC161-ITC176.

［12］VERYASKINA Y A，TITOV S E，IVANOV M K，et al.Selection of reference genes for quantitative analysis of microRNA expression in three different types of cancer［J］.PLoS One，2022，17（2）：e0254304.

［13］KUMAR D，NARANG R，SREENIVAS V，et al.Circulatory miR-133b and miR-21 as novel biomarkers in early prediction and diagnosis of coronary artery disease［J］.Genes，2020，11（2）：164.

［14］HNNINEN M，JNTTI T，TOLPPANEN H，et al.Association of miR-21-5p，miR-122-5p，and miR-320a-3p with 90-day mortality in cardiogenic shock［J］.International Journal of Molecular Sciences，2020，21（21）：7925.

［15］JENIKE A E，HALUSHKA M K.MiR-21：a non-specific biomarker of all maladies［J］.Biomarker Research，2021，9（1）：18.

［16］ZHAO Z B，ZHONG L，LI P Z，et al.Cholesterol impairs hepatocyte lysosomal function causing M1 polarization of macrophages via exosomal miR-122-5p［J］.Experimental Cell Research，2020，387（1）：111738.

［17］BIASUCCI L M，MAINO A，GRIMALDI M C，et al.Novel biomarkers in heart failure：new insight in pathophysiology and clinical perspective［J］.Journal of Clinical Medicine，2021，10（13）：2771.

［18］ZHANG Z W，LI H，CUI Z Y，et al.Long non-coding RNA UCA1 relieves cardiomyocytes H9c2 injury aroused by oxygen-glucose deprivation via declining miR-122［J］.Artificial Cells，Nanomedicine，and Biotechnology，2019，47（1）：3492-3499.

［19］CORTEZ-DIAS N，COSTA M C，CARRILHO-FERREIRA P，et al.Circulating miR-122-5p/miR-133b ratio is a specific early prognostic biomarker in acute myocardial infarction［J］.Circulation Journal，2016，80（10）：2183-2191.

［20］ZHANG P， SHAO L，MA J.Toll-like receptors 2 and 4 predict new-onset atrial fibrillation in acute myocardial infarction patients［J］.International Heart Journal，2018，59（1）：64-70.

（收稿日期：2023-03-17）

（本文編輯薛妮）