五味子甲素調節(jié)miR-429/Notch1信號軸對冠心病大鼠心肌組織損傷的影響

摘要目的：探究五味子甲素（Sch A）調節(jié)miR-429/Notch1信號軸對冠心病大鼠心肌組織損傷的影響。方法：利用鹽酸異丙腎上腺素（ISO）誘導建立冠心病大鼠模型，隨機分為對照（Control）組、模型（ISO）組、低劑量Sch A組（L-Sch A組）、中劑量Sch A組（M-Sch A組）、高劑量Sch A組（H-Sch A組）、普萘洛爾（Pro）組、miR-429 mimics陰性對照＋H-Sch A組、miR-429 mimics＋H-Sch A組。于ISO誘導30 min后，觀察心功能指標［心率、平均動脈壓（MAP）、左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）］；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測心肌損傷血清標志物［肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、B型鈉尿肽（BNP）］；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心肌組織病理損傷；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測心肌組織miR-429 mRNA；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌組織Notch1信號相關因子［Notch受體胞內(nèi)結構域（NICD）、Hes1］蛋白。結果：與Control組比較，ISO組心率、MAP、LVSP降低（P＜0.05），LVEDP、CK-MB、cTnI、BNP升高（P＜0.05），同時可見明顯病理學損傷，心肌細胞結構異常、肌原纖維排列紊亂、炎性細胞浸潤；而經(jīng)L-Sch A組、M-Sch A組、H-Sch A組及Pro組心率、MAP、LVSP升高（P＜0.05），LVEDP、CK-MB、cTnI、BNP降低（P＜0.05），同時病理學損傷明顯減輕，且H-Sch A效果更佳，與Pro效果相當。與Control組比較，ISO組miR-429 mRNA升高（P＜0.05），NICD/甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、Hes1/GAPDH蛋白比值降低（P＜0.05）；而經(jīng)H-Sch A預處理，miR-429 mRNA降低，NICD/GAPDH、Hes1/GAPDH蛋白比值升高（P＜0.05）；而使miR-429過表達后，NICD/GAPDH、Hes1/GAPDH蛋白比值降低（P＜0.05）；同時LVEDP、CK-MB、cTnI、BNP升高，心率、MAP、LVSP降低（P＜0.05），以及心肌組織病理損傷程度有所加重。結論：Sch A可減輕冠心病大鼠心肌組織損傷，可能通過下調miR-429表達，進而激活Notch1信號通路而實現(xiàn)。

關鍵詞冠心??；五味子甲素；miR-429/Notch1信號軸；心肌損傷；大鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.010

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，簡稱冠心病，為常見的心血管疾病，發(fā)病率逐年上升，且具有高致殘率和高致死率［1］。對于冠心病，臨床以藥物治療為主，多采用β受體阻滯劑及硝酸酯類、他汀類、抗血小板類藥物，雖療效值得肯定，但同時存在較大的毒副作用，且易產(chǎn)生抗藥性。故而，研究者逐漸把目光投向我國的傳統(tǒng)中藥［2］。五味子甲素（schisandrin A，Sch A）是五味子的主要活性成分，大量臨床研究表明，其具有降低血壓、血脂，舒張血管及減弱心肌收縮力等作用，對心腦血管疾病有一定的療效，但關于其具體作用機制尚不清楚［3-4］。Notch1信號通路是一種高度保守的信號通路，參與調控細胞分化、增殖、凋亡及血管新生等過程，可發(fā)揮心血管保護作用［5］。miRNA是一類非編碼小分子RNA，通過降解靶基因mRNA使其表達水平下降，進而發(fā)揮對機體的保護性或病理性調控作用。miR-429為miRNA家族一員，諸多研究證實，miR-429可病理性調控心血管疾病的發(fā)生發(fā)展［6-7］，且有研究指出，Notch1信號通路可能為其作用靶點［8-9］。然而Sch A對心血管疾病的保護作用是否通過調控miR-429/Notch1信號軸而實現(xiàn)，尚未可知。本研究采用鹽酸異丙腎上腺素（isoprenaline hydroehloride，ISO）誘導建立冠心病大鼠模型，觀察Sch A對大鼠心肌損傷的影響，并探究miR-429/Notch1信號軸作為Sch A藥理機制的可能性。

1材料與方法

1.1實驗動物

6～7周齡無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠，體質量200～220 g，購自北京維通利華公司。

1.2實驗試劑與儀器

Sch A（貨號FZ2520）、普萘洛爾（propranolol，Pro）均購自北京康瑞納生物公司；ISO購自上海禾豐制藥公司（國藥準字H31021344）；蘇木精-伊紅（HE）染色液購自北京雷根生物公司（貨號DH0006）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、B型腦鈉肽（B-type natriuretic peptide，BNP）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自上海酶研生物公司（貨號分別為EK-R37496、EK-R38375、EK-R37835）；反轉錄試劑盒（貨號FSQ-301）、熒光定量試劑盒（貨號QPK-201）購自上海研卉生物公司；miR-429、U6引物由南京金斯瑞生物公司合成；miR-429 mimics及其陰性對照由上海吉瑪生物公司提供；放射免疫沉淀試驗（RIPA）蛋白裂解液購自貝博-Bestbio公司（貨號BB-3201）；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（貨號PC0020）購自上海吉至生化公司；兔抗鼠一抗anti-Notch受體胞內(nèi)結構域（Notch intracellular domain，NICD）、anti-Hes1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體（anti-GAPDH）及羊抗兔二抗購自Abcam公司（貨號分別為ab52301、ab108937、ab181602、ab205718）；MultiskanTMFC酶標儀購自賽默飛世爾科技公司；ABI StepOnePlus實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）儀購自北京希凱恩生物公司；TL-400血流動力學監(jiān)測儀購自上海聚慕醫(yī)療器械公司；Axygen凝膠成像系統(tǒng)購自廣州科適特科學儀器公司；NIKON TS100倒置顯微鏡購自上海輔澤商貿(mào)公司。

1.3方法

1.3.1實驗動物分組與造模

第1次分組：隨機把大鼠分為對照（Control）組、模型（ISO）組、低劑量Sch A（L-Sch A組，20 mg/kg）、中劑量Sch A組（M-Sch A組，40 mg/kg）、高劑量Sch A組（H-Sch A組，80 mg/kg）組［10］及Pro組（Pro 30 mg/kg），每組5只。第2次分組：隨機把大鼠分為Control組、ISO組、H-Sch A組，每組各10只。第3次分組：隨機把大鼠分為H-Sch A組、miR-429 mimics陰性對照＋H-Sch A組（12 mg/kg miR-429 mimics陰性對照＋80 mg/kg Sch A）、miR-429 mimics＋H-Sch A組（12 mg/kg miR-429 mimics＋80 mg/kg Sch A），每組10只。

L-Sch A、M-Sch A、H-Sch A組、Pro組、miR-429 mimics陰性對照＋H-Sch A組、miR-429 mimics＋H-Sch A 組均于造模前按分組連續(xù)14 d灌胃給藥（miR-429 mimics陰性對照、miR-429 mimics通過尾靜脈注入），Control組、ISO組灌胃等體積的生理鹽水（或灌胃等體積的生理鹽水＋尾靜脈注射等體積的DEPC水）；除Control組外，其余組第13天、第14天于灌胃給藥后30 min腹腔注射ISO 10 mg/kg，Control組腹腔注射等體積的生理鹽水。各組大鼠干預后，第2次分組和第3次分組大鼠中隨機從各組大鼠取5只分離心臟組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，其余5只大鼠心臟組織保存于－80 ℃冰箱中進一步實驗。

1.3.2心功能指標檢測

于注射ISO 30 min后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，待麻醉成功后將導管經(jīng)右頸總動脈插入左心室，檢測心率、平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）、左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）。

1.3.3ELISA檢測心肌損傷血清標志物

血流動力學檢測結束后，取腹主動脈血5 mL，經(jīng)靜置、離心處理后取血清，采用ELISA試劑盒檢測CK-MB、cTnI、BNP水平，嚴格按照說明書操作。借助酶標儀檢測獲得標準曲線方程，計算CK-MB、cTnI、BNP含量。

1.3.4HE染色觀察心肌組織病理損傷

腹主動脈血后，行心臟灌流、取出心臟，經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋后取心尖部橫切片，脫蠟至水，依次加入蘇木精、伊紅染色，經(jīng)脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.5RT-qPCR檢測心肌組織miR-429 mRNA

取出心臟后，加入Trizol提取總RNA，經(jīng)反轉錄合成cDNA，利用熒光定量試劑盒檢測miR-429 mRNA表達水平，采用2－△△CT法分析結果。miR-429引物序列：正向引物5′-GGGGGGTAATACTGTCTGGT-3′；反向引物5′-TGCGTGTCGTGGAGCT-3′；內(nèi)參U6引物序列：正向引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；反向引物5′-AGCATGTAGACTGCTGGGGCAA-3′。

1.3.6蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌組織Notch1信號通路相關蛋白

取出心臟后，采用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，經(jīng)凝膠電泳分離蛋白、轉印、封閉后，分別加入兔抗鼠一抗anti-NICD、anti-Hes1、anti-GAPDH，4 ℃過夜，加入羊抗兔二抗室溫孵育1.5 h，凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，借助Image J軟件對條帶進行灰度分析。

1.4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1Sch A對心功能指標的影響

與Control組比較，ISO組心率、MAP、LVSP降低，LVEDP升高（P＜0.05）；與ISO組比較，L-Sch A組、M-Sch A組、H-Sch A組及Pro組心率、MAP、LVSP升高，LVEDP降低（P＜0.05），且H-Sch A效果更佳，與Pro效果相當。詳見表1。

2.2Sch A對心肌損傷血清標志物的影響

與Control組比較，ISO組CK-MB、cTnI、BNP升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與ISO組比較，L-Sch A組、M-Sch A組、H-Sch A組及Pro組CK-MB、cTnI、BNP降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且H-Sch A效果更佳，與Pro效果相當。詳見表2。

2.3Sch A對心肌組織病理損傷的影響

Control組心肌細胞形態(tài)完整、細胞質著色均勻，肌原纖維排列整齊緊密；ISO組可見明顯病理學改變，心肌細胞結構異常、細胞質著色不均勻，肌原纖維排列紊亂、斷裂，炎性細胞浸潤，給予L-Sch A、M-Sch A、H-Sch A及Pro預處理，心肌組織病理損傷程度減輕。詳見圖1。

2.4Sch A對心肌組織miR-429 mRNA、Notch1信號通路相關蛋白的影響

與Control組比較，ISO組miR-429 mRNA升高（P＜0.05），NICD/GAPDH、Hes1/GAPDH蛋白比值降低（P＜0.05）；與ISO組比較，H-Sch A組miR-429 mRNA降低（P＜0.05），NICD/GAPDH、Hes1/GAPDH蛋白比值升高（P＜0.05）。詳見圖2、表3。

相關蛋白表達條帶圖表3各組心肌組織miR-429 mRNA、Notch1信號通路相關蛋白比較（x±s）組別" 只數(shù)miR-429 mRNANICD/GAPDHHes1/GAPDHControl組51.00±0.000.85±0.070.74±0.05ISO組51.69±0.08①0.23±0.06①0.15±0.06①H-Sch A組51.08±0.06②0.76±0.06②0.65±0.06②注：與Control組比較，①P＜0.05；與ISO組比較，②P＜0.05。

2.5Sch A對miR-429過表達后心肌組織Notch1信號通路相關蛋白的影響

與H-Sch A組比較，miR-429 mimics＋H-Sch A組miR-429 mRNA升高，NICD/GAPDH、Hes1/GAPDH蛋白比值降低（P＜0.05）。詳見圖3、表4。

2.6Sch A對miR-429過表達后心功能指標的影響

與H-Sch A組比較，miR-429 mimics＋H-Sch A組心率、MAP、LVSP降低（P＜0.05），LVEDP升高（P＜0.05）。詳見表5。

2.7Sch A對miR-429過表達后心肌損傷血清標志物的影響

與H-Sch A組比較，miR-429 mimics＋H-Sch A組CK-MB、cTnI、BNP水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表6。

2.8Sch A對miR-429過表達后心肌組織病理損傷的影響

與H-Sch A組比較，miR-429 mimics＋H-Sch A組心肌組織病理損傷程度有所加重。詳見圖4。 圖4Sch A對miR-429過表達后心肌組織病理損傷的影響（×400）

3討論

冠心病系指因冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化而引起管腔狹窄、閉塞，進展為心肌缺血、缺氧性壞死的一種心臟病，臨床表現(xiàn)為心功能（以左心室為主）不全，同時可伴隨CK-MB、cTnI、BNP等心肌損傷標志物高水平表達［11-12］。臨床主要采用藥物治療冠心病，尤以β受體阻滯劑及硝酸酯類、他汀類、抗血小板類藥物較為常用，雖可有效緩解病情，但毒副作用較大，而相比于西藥，中藥材因具有毒副作用小的優(yōu)勢而日益受到青睞。五味子是系指華中五味子或木蘭科植物五味子的成熟果實，而Sch A為其主要活性成分。已有多項臨床研究證實，Sch A可通過抗氧化、抗炎、減輕氧自由基損傷、抑制細胞凋亡等多種藥理作用發(fā)揮對心腦血管疾病的保護作用，如Gao等［13］發(fā)現(xiàn)，Sch A可通過提高射血分數(shù)，縮小左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑，使左心室后壁厚度變薄等方面而逆轉或改善ISO誘導的心力衰竭；Zhou等［14］發(fā)現(xiàn)，Sch A可通過抑制炎癥和氧化應激反應以減輕腦缺血-再灌注損傷。本研究結果顯示，Control組無病理學改變，ISO組可見明顯病理學改變，心肌細胞結構異常、肌原纖維排列紊亂、炎性細胞浸潤，同時心率、MAP、LVSP降低，LVEDP、CK-MB、cTnI、BNP升高，表明造模成功；給予L-Sch A、M-Sch A、H-Sch A及Pro預處理，心肌組織病理損傷程度減輕，同時心率、MAP、LVSP升高，LVEDP、CK-MB、cTnI、BNP降低，且H-Sch A與Pro效果相當，表明Sch A可減輕冠心病大鼠心肌損傷，且高劑量效果更佳，故選取高劑量Sch A探究其藥理機制。

Notch1信號通路是經(jīng)證實的可對心血管疾病發(fā)揮保護作用的一種信號通路，作用機制為，通過Notch1受體與其配體（Delta-like 1、3、4、Jagged1和Jagged2）相互結合，繼而釋放NICD入細胞核，并與轉錄因子Lag1抑制因子（CSL）結合形成NICD/CSL轉錄激活復合體，激活下游靶基因Hes1，進而促進血管新生，保護缺血心?。?5-16］。miR-429為miRNA家族一員，通過降解靶基因的mRNA而發(fā)揮調控作用，且已被諸多研究證實miR-429可病理性調控心血管疾病，即表達上調［17-18］，且有研究指出，這一過程可能通過抑制Notch1信號通路而被實現(xiàn)［19-20］。本研究結果顯示，經(jīng)高劑量Sch A給藥預處理后，大鼠miR-429 mRNA降低，NICD/GAPDH、Hes1/GAPDH蛋白比值升高，提示Sch A可下調冠心病大鼠心肌組織中miR-429表達，進而激活Notch1信號通路。然而，Sch A是否通過下調miR-429進而激活Notch1信號通路以減輕冠心病大鼠心肌損傷尚未可知。在高劑量Sch A給藥預處理的基礎上，同時給予尾靜脈注射miR-429 mimics使大鼠miR-429過表達，結果發(fā)現(xiàn)，NICD/GAPDH、Hes1/GAPDH蛋白比值降低，同時心肌組織損傷程度有所加重，心率、MAP、LVSP降低，LVEDP、CK-MB、cTnI、BNP升高，證實Sch A通過下調miR-429表達，進而激活Notch1信號通路而減輕冠心病大鼠心肌組織損傷。

綜上所述，Sch A可減輕冠心病大鼠心肌組織損傷，可能通過下調miR-429表達，進而激活Notch1信號通路而實現(xiàn)，希望本研究能夠為中藥治療冠心病提供一定的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2023-02-23）

（本文編輯郭懷?。?/p>