滑液囊支原體二氫硫辛酰胺脫氫酶的誘導(dǎo)表達(dá)及生物學(xué)特性

摘要：為了獲得滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）二氫硫辛酰胺脫氫酶（PdhD）的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，分析蛋白的免疫原性，采用DNAStar Protean軟件分析PdhD的二級(jí)結(jié)構(gòu)和主要抗原域。將PdhD基因的第593、731、1 712、1 833 nt處的A突變?yōu)镚，使改造成功的基因能夠在大腸桿菌BL21中正確表達(dá)；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得約70 ku的蛋白。對(duì)PdhD蛋白的622個(gè)氨基酸進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，Garnier-Robson法預(yù)測(cè)出18個(gè)α螺旋中心、12個(gè)β折疊區(qū)段和17個(gè)T轉(zhuǎn)角區(qū)段，Chou-Fasman法預(yù)測(cè)出24個(gè)α螺旋中心、23個(gè)β折疊區(qū)段和37個(gè)T轉(zhuǎn)角區(qū)段，Karplus-Schulz法預(yù)測(cè)出42個(gè)柔性區(qū)域。PdhD的主要抗原域?yàn)镚ln27-Phe36、Vla38-Val51、Ala89-Ala99、Pro137-Asp159、Gly307-Ile336、Gly369-Gly386、Gly397-Gln416、Ala433-Val447、Ieu486-Tyr504、Ala541-Asn549。免疫原性分析發(fā)現(xiàn)，PdhD重組蛋白能與兔源Anti-MS血清發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，與兔源Anti-MG血清和兔源血清Blank均不發(fā)生反應(yīng)。PdhD具有免疫原性，可作為候選抗原用于亞單位疫苗的研發(fā)。

關(guān)鍵詞：滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）；二氫硫辛酰胺脫氫酶；誘導(dǎo)表達(dá)；免疫原性分析；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)：S858.31" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）12-0205-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.036 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Induced expression and biological characteristics of dihydrolipoamide dehydrogenase in Mycoplasma synoviae

CAO Xiao-yi1，2， HU Qiao2， ZHANG Wen-ting2， DENG Lan-lan1，2， GUO Yun-qing2，

LU Qin2， ZHANG Rong-rong2， ZHANG He-ping1， LUO Qing-ping2， 3

（1. School of Life Sciences and Food Engineering， Hebei University of Engineering， Handan" 056038，Hebei，China；2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan" 430064，China；3. Hubei Hongshan Laboratory， Wuhan" 430070， China）

Abstract： In order to obtain the protein expression product of Mycoplasma synoviae （MS） dihydrolipoamide dehydrogenase （PdhD） and analyze its immunogenicity， DNAStar Protean software was used to analyze the secondary structure and main antigen domain of PdhD. A at positions 593， 731， 1 712， and 1 833 nt of the PdhD gene was mutated to G， so that the successfully modified gene could be expressed correctly in Escherichia coli BL21；after induction with IPTG， a protein of approximately 70 ku was obtained. The secondary structure of PdhD protein was predicted for 622 amino acids. The Garnier Robson method predicted 18 alpha helix centers， 12 beta folding segments， and 17 T-corner segments. The Chou Fasman method predicted 24 alpha helix centers， 23 beta folding segments， and 37 T-corner segments. The Karplus Schulz method predicted 42 flexible regions. The main antigenic domain of PdhD was Gln27-Phe36，Vla38-Val51， Ala89-Ala99， Pro137-Asp159， Gly307-Ile336， Gly369-Gly386， Gly397-Gln416， Ala433-Val447， Ieu486-Tyr504， and Ala541-Asn549. Immunogenicity analysis revealed that PdhD recombinant protein could strongly react with rabbit-derived Anti-MS serum， but did not react with rabbit-derived Anti-MG serum or rabbit-derived serum Blank. PdhD had immunogenicity and could be used as a candidate antigen for the development of subunit vaccines.

Key words： Mycoplasma synoviae （MS）； dihydrolipoamide dehydrogenase； induced expression； immunogenicity analysis； biological characteristics

收稿日期：2024-06-23

基金項(xiàng)目：河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目鄉(xiāng)村振興技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)（22327311D）；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科學(xué)基金項(xiàng)目（2024NKYJJ19）；國(guó)家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-41）；湖北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022BBA0055）；湖北省科技重大專項(xiàng)（2020ABA016）；湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)類項(xiàng)目（2021CFA019）

作者簡(jiǎn)介：曹曉怡（2000-），女，湖北武漢人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病防控與檢疫，（電話）18071547480（電子信箱）18071547480@163.com；通信作者，張鶴平（1968-），女，河北邯鄲人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物疫病診治研究，（電子信箱）13832092680@163.com；共同通信作者，羅青平（1971-），女，湖北武漢人，研究員，主要從事禽病防控研究，（電子信箱）qingping0523@163.com。

滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）是支原體科支原體屬成員，不含細(xì)胞壁，在顯微鏡下觀察呈多種形態(tài)［1］。MS主要感染禽類，尤其是雞和火雞，感染后可出現(xiàn)滑膜炎、產(chǎn)蛋量下降、蛋殼尖端異常等。同時(shí)MS可以與其他病原微生物發(fā)生混合感染，導(dǎo)致更嚴(yán)重的呼吸道或全身癥狀，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失［2，3］。MS在中國(guó)中部及南部地區(qū)的發(fā)病率高達(dá)10%［4］，抗生素可以防控支原體病，但抗生素過(guò)度使用容易導(dǎo)致藥物殘留及耐藥性的產(chǎn)生，隨著減抗限抗令的頒布，疫苗接種成為防控滑液囊支原體病的發(fā)展方向［5］。鑒于MS對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)的嚴(yán)重危害，亞單位疫苗的研發(fā)迫在眉睫。

免疫原性蛋白的選擇對(duì)亞單位疫苗的效果至關(guān)重要。MS代謝相關(guān)酶類除具有酶活功能外，還能發(fā)揮黏附功能且具有免疫原性，如烯醇化酶［6］、NADH氧化酶［7］。丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（PDC）的核心酶包括丙酮酸脫氫酶（E1，PdhA和PdhB）、二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙?；福‥2）和二氫硫辛酰胺脫氫酶［（Dihydrolipoamide dehydrogenase（E3），PdhD］［8］。包世?。?］證實(shí)了PdhA和PdhB是MS免疫相關(guān)蛋白，其兔多克隆抗體能夠有效介導(dǎo)補(bǔ)體殺滅MS，抑制MS對(duì)DF-1細(xì)胞的黏附，推測(cè)PdhA和PdhB可能與滑液囊支原體的致病性有關(guān)。在一些生物體中，PdhD作為多酶復(fù)合物發(fā)揮作用，如丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、二氧戊二酸脫氫酶等［10］。關(guān)于MS中PdhD蛋白的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性的研究尚不清楚。因此，本研究對(duì)MS PdhD的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并以MS臨床分離株為模板，通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增基因片段，利用大腸桿菌（DE3）表達(dá)系統(tǒng)和Ni-NTA樹脂層析來(lái)表達(dá)和純化重組蛋白MS PdhD，分析其生物學(xué)特性和免疫原性，為進(jìn)一步研發(fā)亞單位疫苗提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體 MS臨床分離菌株、原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28c由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存；Escherichia coli BL21和DH5α購(gòu)于南京諾唯贊有限公司。

1.1.2 主要試劑 HRP-Goat Anti-Rabbit IgG、His tag polyclonal antibody購(gòu)自三鷹生物技術(shù)有限公司，考馬斯亮藍(lán)染液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色試劑、Ni-NTA His·Bind?樹脂購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega生物技術(shù)公司，核酸內(nèi)切酶、PrimerStar DNA酶購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Buffer A、Buffer B1、Buffer B2為自制。

1.1.3 主要儀器 電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱（恒豐醫(yī)療器械有限公司）；超低溫冰箱（海爾集團(tuán)公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠）；PCR儀（賽默飛世爾科技有限公司）；凝膠成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；ECL檢測(cè)儀（英國(guó)Syngene公司）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó) Eppendorf 公司）；細(xì)胞破碎儀（廣州聚能納米生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 引入20 bp的同源臂，上游引物為5′-CTTTAAGAAGGAGATATACCATGTATACATTT

AAATTTGCTGATATAGGAGA-3′，下游引物為5′-AGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTTTCATTGCA GCAAGTGTCA-3′。

1.2.2 PdhD基因密碼子的優(yōu)化 MS基因組中的TGA在大腸桿菌中編碼的是終止密碼子，在PdhD基因中有4處TGA，針對(duì)這4處TGA設(shè)計(jì)4對(duì)引物（表1），通過(guò)點(diǎn)突變方式將TGA變?yōu)門GG。

1.2.3 PdhD功能預(yù)測(cè)分析 將測(cè)序所得的PdhD序列用SignalP 6.0 Server對(duì)蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用TMHMM Server 2.0預(yù)測(cè)跨膜區(qū)。在NCBI中將蛋白序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中其他的MS分離株、不同種支原體序列進(jìn)行同源性分析。采用DNAStar Protean對(duì)PdhD蛋白的主要抗原域和二級(jí)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 以MS臨床分離株的基因組為模板，用Primer Star DNA聚合酶對(duì)PdhD蛋白的基因片段進(jìn)行重疊PCR。連接體系（25 μL）：Primer Star DNA聚合酶12.5 μL，需要連接的2個(gè)基因片段各1 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s、54 ℃退火15 s、72 ℃延伸10 s，5個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，16 ℃結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增體系（25 μL）：Primer Star DNA聚合酶 12.5 μL，上下游引物各1 μL，其他試劑按照說(shuō)明書添加，ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s、54 ℃退火15 s、72 ℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，16 ℃結(jié)束反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物。

將拼接成功的序列與載體pET-28c進(jìn)行同源重組，在50 ℃的水浴鍋內(nèi)孵育5 min，置于冰上冷卻；將克隆用的感受態(tài)細(xì)胞（DH5α、BL21）置于冰上解凍，取10 μL重組產(chǎn)物加入到100 μL的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42 ℃水浴熱激45 s，立即置于冰上冷卻2 min；加入900 μL SOC液體培養(yǎng)基，37 ℃搖菌1 h；5 000 r/min 離心5 min，棄掉部分上清液，用剩下的培養(yǎng)液將菌體重懸，用無(wú)菌涂布棒在含有卡那霉素的平板上輕輕涂勻，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。挑取單菌落搖菌并提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與原始序列對(duì)比無(wú)誤后將其命名為pET-28c-PdhD。

1.2.5 pET-28c-PdhD的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化 Escherichia coli BL21（pET-28c-PdhD）接種到10 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，將10 mL的菌液接種到800 mL的LB液體培養(yǎng)基，1 mol/L IPTG按照1∶1 000的比例加入，16 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)。pET-28c-PdhD經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，8 000 r/min離心10 min，用PBS清洗2次后用25 mL的Buffer A重懸菌體，菌液經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎儀數(shù)次低溫高壓處理后逐漸澄清。破碎液在4 ℃ 12 000 r/min條件下離心30 min，使上清液和沉淀分離。收集上清液后用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，除去菌體，4 ℃保存?zhèn)溆?。將收集到的上清液和沉淀分別制樣，SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)位置。

分別用20%乙醇、ddH2O過(guò)鎳柱，Buffer A平衡后，加入過(guò)濾后的上清液，4 ℃下與Ni+進(jìn)行雜交。分別通過(guò)30、50、80、500 mmol/L的咪唑洗脫鎳柱，收集洗脫液，SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。

按照1∶2 000稀釋比分別加入一抗His tag Polyclonal antibody、兔源Anti-MS、兔源Anti-MG和兔源血清Blank，孵育1.5 h。

1.2.6 Western blot驗(yàn)證及免疫原性分析 PdhD蛋白通過(guò)SDS-PAGE分離后，通過(guò)轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉，4 ℃過(guò)夜。棄去封閉液后，用1×PBST清洗3次，每次5 min，將膜分成4份，分別加入His tag Polyclonal antibody一抗（1∶2 000）、兔源Anti-MS、兔源Anti-MG和兔源血清Blank，孵育1.5 h。棄去一抗，1×PBST清洗4次，每次10 min，分別加入HRP-Goat Anti-Rabbit IgG二抗（1∶5 000），孵育1 h。1×PBST清洗3次后，去除未結(jié)合的抗體，并使用底物化學(xué)發(fā)光ECL顯色和圖像獲取。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氫硫辛酰胺脫氫酶生物信息學(xué)分析

采用TMHMM Server 2.0分析PdhD蛋白的跨膜區(qū)，結(jié)果顯示PdhD蛋白無(wú)跨膜區(qū)；采用SignalP分析PdhD蛋白的信號(hào)肽，結(jié)果顯示PdhD蛋白無(wú)信號(hào)肽（圖1）。通過(guò)BLASTp將PdhD蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PdhD蛋白在MS中高度保守，在不同MS分離株中相似度高達(dá)99%，與其他種屬支原體的相似度差異較大，與雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum）的相似度為66%，與牛支原體（Mycoplasma bovis）的相似度為57%，與豬鼻支原體（Mesomycoplasma hyorhinis）的相似度為53%。

采用Jameson-Wolf法對(duì)PdhD的622個(gè)氨基酸進(jìn)行抗原域的預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，PdhD的主要抗原域?yàn)镚ln27-Phe36、Vla38-Val51、Ala89-Ala99、Pro137-Asp159、Gly307-Ile336、Gly369-Gly386、Gly397-Gln416、Ala433-Val447、Ieu486-Tyr504、Ala541-Asn549。

采用SOPMA對(duì)PdhD蛋白的622個(gè)氨基酸進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，Garnier-Robson法共預(yù)測(cè)出18個(gè)α螺旋中心，12個(gè)β折疊區(qū)段和17個(gè)T轉(zhuǎn)角區(qū)段；Chou-Fasman法共預(yù)測(cè)出24個(gè)α螺旋中心，23個(gè)β折疊區(qū)段和37個(gè)T轉(zhuǎn)角區(qū)段；用Karplus-Schulz法預(yù)測(cè)出PdhD蛋白共有42個(gè)柔性區(qū)域（圖2）。

2.2 pET-28c-PdhD重組載體的構(gòu)建及密碼子優(yōu)化

以MS臨床分離菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PdhD基因中4處密碼子通過(guò)點(diǎn)突變將TGA突變?yōu)門GG，密碼子優(yōu)化后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，在593、731、1 712、1 833 nt處A成功突變?yōu)镚，運(yùn)用重疊PCR技術(shù)將PdhD基因拼接（圖3、圖4、圖5）。通過(guò)同源重組方法將PdhD基因連接到pET-28c載體上，質(zhì)粒測(cè)序正確表明重組質(zhì)粒pET-28c-PdhD構(gòu)建成功（圖6）。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

pET-28c-PdhD經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)（16 ℃誘導(dǎo)16 h）后，SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果（圖7）表明，在70 ku處有清晰可見的條帶，與PdhD蛋白理論值一致，表明密碼子優(yōu)化后，pET-28c-PdhD在BL21細(xì)胞中成功表達(dá)。

pET-28c-PdhD經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，采用Ni-NTA柱純化，不同濃度咪唑的洗脫產(chǎn)物用SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。Buffer B2置換蛋白中的咪唑，超濾管濃縮蛋白至200 μL，分裝后液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)的研究（圖8）。

2.4 Western blot驗(yàn)證及免疫原性分析

由圖9可知，在約70 ku處有一條蛋白條帶，蛋白大小與預(yù)期一致，純化的蛋白確定為PdhD蛋白。由免疫原性分析可知，PdhD蛋白不與兔源Anti-MG發(fā)生反應(yīng)（圖10a），PdhD蛋白不與兔源血清Blank發(fā)生反應(yīng)（圖10b），PdhD蛋白與兔源Anti-MS發(fā)生反應(yīng)（圖10c），在70 ku處可見明顯條帶，與目的蛋白大小一致。

3 討論

滑液囊支原體的防控主要依賴抗生素，但抗生素過(guò)度使用容易導(dǎo)致藥物殘留及耐藥性的產(chǎn)生，疫苗免疫是防控MS感染的重要手段。亞單位疫苗具有抗原單一、精準(zhǔn)激活機(jī)體免疫力、毒副反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，是MS疫苗研發(fā)的重要方向。免疫原性蛋白的選擇對(duì)亞單位疫苗的效果至關(guān)重要。因此，對(duì)MS分離株代謝相關(guān)蛋白PdhD的結(jié)構(gòu)、功能以及免疫原性進(jìn)行研究，為疫苗候選抗原提供參考。

PdhD氨基酸序列的生物信息學(xué)分析表明，該蛋白的理論等電點(diǎn)lt;7，推測(cè)該蛋白為酸性蛋白。PdhD蛋白含有的Ser磷酸化位點(diǎn)最多，Tyr磷酸化位點(diǎn)最少；平均親水值為負(fù)值，表明該蛋白為親水蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)lt;40，說(shuō)明蛋白穩(wěn)定性較好；在線軟件NetNGlyc 1.0預(yù)測(cè)有潛在的糖基化位點(diǎn)，因此在體內(nèi)該蛋白可能不會(huì)被糖基化；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)主要位于細(xì)胞內(nèi)，但也有少量定位于細(xì)胞膜上；在線軟件ABCpred對(duì)PdhD蛋白進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)，默認(rèn)閾值0.50，多肽的得分均超過(guò)0.60，甚至超過(guò)0.96，預(yù)測(cè)結(jié)果與PdhD蛋白具有免疫原性的特性相吻合［5］。

與細(xì)菌或病毒相比，支原體基因的研究相對(duì)滯后，其密碼子使用與常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)存在差異，給支原體基因功能的研究造成了阻礙［11］。本研究首先通過(guò)蛋白質(zhì)翻譯軟件對(duì)MS PdhD基因序列進(jìn)行分析（https：//www.novopro.cn/tools/translate.html），該基因的開放閱讀框中具有4處編碼色氨酸的密碼子TGA，而在大腸桿菌中TGA對(duì)應(yīng)的是終止密碼子，在大腸桿菌中蛋白表達(dá)會(huì)提前終止［12］。因此采用重疊PCR將色氨酸密碼子TGA同義突變?yōu)門GG，并成功構(gòu)建PdhD原核表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)PdhD可溶性表達(dá)并純化，SDS-PAGE和Western blot均顯示70 ku處可見一條清晰的條帶，與目標(biāo)蛋白大小一致。免疫原性分析發(fā)現(xiàn)，PdhD重組蛋白能與兔源Anti-MS發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，與兔源Anti-MG和兔源血清Blank均不發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明PdhD具有免疫原性，與牛支原體上的結(jié)果一致［13］。本研究對(duì)MS重要外膜蛋白PdhD的蛋白特性及抗原相關(guān)功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，為MS亞單位疫苗的制備提供參考。

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