施用生物菌肥對地黃重茬土壤的影響

摘要：以地黃（Rehmannia glutinosa）的重茬土壤為研究對象，分析生物菌肥對地黃重茬土壤的微生物群落構(gòu)成及土壤內(nèi)根系殘留化合物的影響。通過施用不同濃度的生物菌肥，結(jié)合土壤微生物計數(shù)法和超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-QTOF/MS）對施有生物菌肥的重茬土壤分別進(jìn)行微生物種群計數(shù)和根系殘留化合物分析。結(jié)果表明，不同處理下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，其中，0.05%生物菌肥施用60 d后的地黃重茬土壤中細(xì)菌、放線菌之和最高，而真菌數(shù)量相對較少。篩選出9種地黃重茬土壤中特有的根系殘留化合物，其中，在生物菌肥濃度為0.05%時，化合物2的含量最低；化合物5和化合物6含量在生物菌肥濃度為0.10%、施用60 d的條件下最低?？梢姡馐┥锞士捎行Ц淖兊攸S重茬土壤微生物數(shù)量和降解重茬土壤中根系殘留的某些化合物，有效緩解地黃的連作障礙。

關(guān)鍵詞：生物菌肥； 地黃（Rehmannia glutinosa）； 重茬土壤； UPLC-QTOF/MS

中圖分類號：S567.234；S154" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）12-0099-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.018 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effect of applying bacterial manure on the continuous cropping soil of Rehmannia glutinosa

YU Yan-ge， DAI Dan-dan， LA Gui-xiao， LI Xiang-yang， GUO Xiao-yang， WANG Yan-hong， YANG Tie-gang

（Institute of Traditional Chinese Medicine， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou" 450002， China）

Abstract： Taking the continuous cropping soil of Rehmannia glutinosa as the research object， the effect of applying bacterial manure on microbial community composition and root residual compounds in the soil of Rehmannia glutinosa was analyzed. The soil microbial count method was used to detect the number of microorganisms. Ultra high-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry （UPLC-QTOF/MS） was used to profile the root residual compounds in the soil of Rehmannia glutinosa. The results showed that soil microbial community structure had significant differences under different treatments. The total number of bacteria and actinomycetes in Rehmannia glutinosa soil after 60 d of applying 0.05% bacterial manure was the highest， while the number of fungi was less. Nine unique residue compounds were screened out in the soil of Rehmannia glutinosa. The content of Compound 2 was the lowest when the concentration of bacterial manure was 0.05%. At the same time， the contents of Compound 5 and Compound 6 were the lowest when the concentration of bacterial manure was 0.10% and applied for 60 days. It was found that the application of bacterial manure could effectively change the soil microbial populations and reduce some residual compounds of continuous cropping soil. It was also beneficial to alleviate the continuous cropping obstacle of Rehmannia glutinosa.

Key words： bacterial manure； Rehmannia glutinosa； continuous cropping soil； UPLC-QTOF/MS

收稿日期：2024-03-27

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項目（CARS-21）；河南省中藥材體系項目（HARS-22-11-G2）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院新興學(xué)科發(fā)展專項（2024XK04）

作者簡介：余彥鴿（1990-），女，河南洛陽人，助理研究員，碩士，主要從事中藥材栽培生理研究，（電話）15890116124（電子信箱）yyg604208@163.com；通信作者，楊鐵鋼（1967-），男，河南長垣人，研究員，博士，主要從事中藥材栽培生理研究，（電子信箱）tiegangyang@126.com。

地黃（Rehmannia glutinosa）是玄參科地黃屬多年生草本植物，是中國常用藥材［1］。然而，地黃在栽培過程中存在明顯的連作障礙，需間隔8～10年才可再次種植，嚴(yán)重影響地黃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［2，3］。地黃產(chǎn)生連作障礙的原因比較復(fù)雜［4］。地黃土壤微生物種群平衡的失調(diào)是造成地黃連作障礙的主要原因［5］。土壤微生物群落的數(shù)量和活性影響著土壤的肥力，通過添加生物菌肥，可改良和優(yōu)化土壤微生物區(qū)系，減緩連作障礙的發(fā)生［6，7］。因此，探尋有效的生物菌肥來緩解地黃土壤連作障礙，是科研人員關(guān)注的焦點。作物連作障礙的形成及加重的原因是多重的。長期連作時，作物對土壤微生物的選擇壓力增大，土壤中細(xì)菌數(shù)目減少、真菌數(shù)目上升，導(dǎo)致土壤微生物區(qū)系紊亂，進(jìn)而影響植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，最終導(dǎo)致減產(chǎn)、降質(zhì)［8，9］。同時，重茬土壤的微生物群落構(gòu)成、功能的改變也是連作作物病害加劇的重要誘因［10-12］。連作的地黃長勢較差與其根際土壤總微生物量下降、細(xì)菌與真菌的比例降低有相關(guān)性［13］。生物菌肥通過特定有益的微生物菌群改善土壤質(zhì)量［14-16］。有效的抗重茬生物菌肥可通過調(diào)節(jié)根部土壤微生物種類、結(jié)構(gòu)修復(fù)失衡的土壤微生態(tài)，減少重茬障礙的發(fā)生［17］。盧明忠等［18］通過外施專用生物菌肥栽培重茬太子參，太子參的產(chǎn)量與太子參多糖含量均有明顯提升，這說明生物菌肥對提高土壤微生物多樣性及改善土壤生態(tài)結(jié)構(gòu)均具有一定影響。杜真輝等［19］的研究表明，施用菌肥可提高地黃產(chǎn)量與品質(zhì)，降低成本。目前生物菌肥的研究主要是對宿主植物的增產(chǎn)和品質(zhì)的改善［20，21］，而有關(guān)運(yùn)用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-QTOF/MS）研究其對土壤中根系殘留化合物影響的報道較少。本研究采用微生物計數(shù)法和UPLC-QTOF/MS法，分析施用不同濃度生物菌肥的地黃重茬土壤，考察該生物菌肥對地黃重茬土壤的微生物群落及土壤內(nèi)根系殘留化合物的影響，以期為緩解地黃連作障礙探索有效的解決途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2019年10月在河南省焦作市溫縣鑫合農(nóng)莊試驗地取樣，分別對地黃重茬土和非重茬土多點取樣。樣地按S形選取5個樣點，每個樣點按隨機(jī)多點混合取樣法將土樣混合均勻。混勻的土樣一部分于4 ℃保存鮮樣，測定微生物數(shù)量；一部分風(fēng)干保存，測定土壤中的化學(xué)成分［22］。供施生物菌肥為山東神圣生物肥料有限公司研制生產(chǎn)的固體顆粒菌肥，其有效活菌數(shù)≥10億CFU/g，有機(jī)質(zhì)含量≥20%。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)計5個不同濃度的生物菌肥，菌肥用量分別為土壤鮮重的0%（B0）、0.01%（B1）、0.05%（B2）、0.10%（B3）、0.20%（B4）。將拌有不同濃度生物菌肥的土壤置于相對濕度55%～60%的盒子中，每個處理3次重復(fù)，隨機(jī)排列。每3 d噴水1次，噴水量要求一致，室內(nèi)放置。每30 d取樣1次，連續(xù)取樣3個月，即取樣時間分別為30 d（C1）、60 d（C2）、90 d（C3）。取樣后及時置于4 ℃冰箱避光冷藏。

1.3 方法

1.3.1 土壤微生物數(shù)量分析法 土壤細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量分析采用稀釋平板計數(shù)法。細(xì)菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，選擇10-3、10-4、10-5稀釋度的菌懸液涂平板，在25 ℃條件下培養(yǎng)3 d后計數(shù)；真菌培養(yǎng)采用馬丁氏培養(yǎng)基，在使用前加入1%的鏈霉素0.5 mL，選擇10-2、 10-3、10-4稀釋度的菌懸液涂平板，于30 ℃條件下培養(yǎng)5 d后計數(shù)；放線菌培養(yǎng)采用高氏Ⅰ號培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基滅菌后加入150 mg/mL重鉻酸鉀溶液0.5 mL，選擇10-2、10-3、10-4 稀釋度的菌懸液涂平板，于30 ℃條件下培養(yǎng)7 d后計數(shù)。細(xì)菌、真菌、放線菌培養(yǎng)時，每個稀釋度均3次重復(fù)［23］。

1.3.2 土壤根系殘留化合物的測定 運(yùn)用UPLC-QTOF/MS法測定土壤樣品中的根系殘留化合物。

1）溶液提取。稱取土樣2.0 g于具塞量筒中，加入20 mL乙腈，超聲振蕩30 min，靜置過夜。在10 ℃、5 000 r/min條件下離心20 min。取離心管上清液1.0 mL，加入1.0 mL甲醇-水混合液（V/V，1∶1），過濾，上機(jī)待測。

2）色譜分離條件。色譜柱：BEH C18柱；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈溶液（C）。洗脫梯度：0～1 min，5%～15% C；1～8 min，15%～85% C；8～10 min，85%～100% C；10～12 min，100% C；12.0～12.1 min，100%～5% C；12.1～15.0 min，5% C。流速為0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

3）質(zhì)譜檢測條件。離子源：電噴霧（ESI）；離子源溫度為120 ℃；毛細(xì)管溫度為350 ℃；毛細(xì)管電壓為2 000 V；錐孔電壓為17 V；電噴霧電壓為1 600 V；掃描時間為0.1 s；掃描間隔0.02 s；脫溶劑流速為450 L/h；霧化氣、吹脫氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮?dú)?；離子監(jiān)測質(zhì)荷比（m/z）為100～1 000。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)運(yùn)用UNIFY軟件進(jìn)行未知化合物成分鑒定，同時運(yùn)用QI分析軟件分析不同處理下土壤代謝物，并找尋特異性Maker。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物菌肥對地黃重茬土壤微生物群落構(gòu)成的影響

2.1.1 地黃非重茬土壤、重茬土壤和生物菌肥土壤中微生物數(shù)量比較 從表1可以看出，在重茬土壤、非重茬土壤和生物菌肥土壤中細(xì)菌數(shù)量最多，放線菌次之，真菌最少。生物菌肥土壤中的細(xì)菌、放線菌、真菌數(shù)量均高于重茬和非重茬土壤。與非重茬土壤相比，重茬土壤中真菌數(shù)量較高，而細(xì)菌、放線菌數(shù)量較低。

2.1.2 不同取樣時間施不同濃度生物菌肥的地黃重茬土壤中微生物數(shù)量分析 不同處理條件下的地黃重茬土壤中微生物數(shù)量不同，差別較大（圖1）。細(xì)菌的數(shù)量最多，放線菌次之，真菌最少。

在不同培養(yǎng)時間施不同濃度生物菌肥的地黃重茬土壤中細(xì)菌數(shù)量如圖1A所示。從生物菌肥濃度來看，細(xì)菌的數(shù)量隨生物菌肥濃度的升高呈先增高后降低的趨勢。細(xì)菌數(shù)量在生物菌肥濃度B2條件下最高，B3次之，B0最低。從不同取樣時間來看，取樣時間C2的土壤中細(xì)菌數(shù)量較取樣時間C1、C3的土壤中細(xì)菌數(shù)量多。因此，施0.05%生物菌肥培養(yǎng)60 d取樣的地黃重茬土壤中細(xì)菌數(shù)量最多，而不施生物菌肥培養(yǎng)30 d的地黃土壤中細(xì)菌數(shù)量最少。

在不同培養(yǎng)時間施不同濃度生物菌肥的地黃重茬土壤中放線菌數(shù)量如圖1B所示。不同處理條件下的重茬土壤放線菌數(shù)量的變化趨勢與細(xì)菌相似。在不同取樣時間下，放線菌的數(shù)量隨生物菌肥濃度的升高呈先增高后降低的趨勢。放線菌數(shù)量在生物菌肥濃度B2條件下最高，B3、B4次之，B0最低。因此，在生物菌肥濃度0.05%的地黃重茬土壤中放線菌數(shù)量最多。

在不同培養(yǎng)時間施不同濃度生物菌肥的地黃重茬土壤中的真菌數(shù)量如圖1C所示。從生物菌肥濃度來看，重茬土壤中的真菌數(shù)量先降低再稍微升高最后基本不變，濃度B2土壤中的真菌數(shù)量達(dá)到最低，B3次之，B0最高，其中生物菌肥濃度為0.05%、施用60 d后的土壤中真菌數(shù)量最少。

通過比較不同培養(yǎng)時間和施不同濃度生物菌肥的重茬土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量，地黃重茬土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量在生物菌肥濃度0.05%時達(dá)到最高，在生物菌肥濃度0.10%時次之，而不施生物菌肥最低。地黃重茬土壤中的真菌數(shù)量則與之相反。在生物菌肥濃度為0.05%、施用60 d后，地黃重茬土壤中細(xì)菌、放線菌數(shù)量最高，真菌數(shù)量最少。

2.2 基于UPLC-QTOF/MS的生物菌肥施用后對地黃重茬土壤根系殘留化合物的影響

2.2.1 地黃重茬土壤中特有的根系殘留化合物篩選 UPLC-QTOF/MS數(shù)據(jù)預(yù)處理包括濾噪、峰識別、重疊峰分析、峰對齊、峰補(bǔ)齊、標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化等。通過對不同處理條件下地黃重茬土壤的UPLC-QTOF/MS數(shù)據(jù)處理，獲得2 745種化合物。根據(jù)某一化合物在地黃重茬土壤不施生物菌肥（培養(yǎng)30、60、90 d）的響應(yīng)度大于地黃非重茬土壤不施生物菌肥（培養(yǎng)30、60、90 d） 的響應(yīng)度篩選出9種化合物。在地黃非重茬土壤不施生物菌肥（培養(yǎng)30、60、90 d）的土壤中，化合物1至化合物9幾乎不存在，其含量幾乎為0。相反，在地黃重茬土壤不施生物菌肥（培養(yǎng)30、60、90 d）的土壤中，化合物1至化合物9的含量較高（表2）。因此，這9種化合物是地黃重茬土壤內(nèi)特有的根系殘留化合物。

2.2.2 生物菌肥施用后地黃重茬土壤中特有的根系殘留化合物含量變化 通過比較化合物1至化合物9在施用不同生物菌肥濃度和不同取樣時間的地黃重茬土壤中的含量，發(fā)現(xiàn)化合物2、化合物5、化合物6、化合物8的含量變化明顯（圖2）。

化合物2的含量隨取樣時間的增加整體呈降低趨勢，在施菌劑后90 d含量最低。從生物菌肥濃度來看，化合物2的含量在生物菌肥濃度為B2條件下最低。化合物5、化合物6的含量變化趨勢基本一致，在施生物菌肥后60 d最低。從生物菌肥濃度來看，化合物5和化合物6的含量在B3時最低，低于B0。從取樣時間來看，化合物5、化合物6的含量在施生物菌肥后60 d最低。不施生物菌肥時，化合物8的含量最高，且不同的取樣時間差別不大。隨著生物菌肥濃度的增加，化合物8的含量急劇降低。在生物菌肥濃度0.05%時，化合物8含量幾乎為0。

由此表明，施生物菌肥后，可有效降解地黃重茬土壤內(nèi)特定的根系殘留化合物2、化合物5、化合物6、化合物8。在生物菌肥濃度0.05%條件下，化合物2的含量最低，降解最多。化合物5和化合物6含量在生物菌肥濃度0.10%、施用60 d時最低。

2.2.3 未知化合物的初步鑒定 根據(jù)“2.2.1”和“2.2.2”的結(jié)果，初步得出施用生物菌肥后對地黃重茬土壤根系殘留化合物影響比較大的是化合物2、化合物5、化合物6、化合物8。結(jié)合QI、UNIFI軟件，綜合考慮相對分子質(zhì)量、分子不飽和度以及同位素豐度等因素推算未知物的分子元素組成。通過各峰的一級質(zhì)譜信息、二級質(zhì)譜結(jié)果，在這4種影響重茬土壤根系殘留化合物的差異未知物中，僅初步鑒定出化合物5為Ureidoisobutyric acid，其分子式為C5H10N2O3，相對分子質(zhì)量為147.074 9（表3），但該化合物的相關(guān)功能還需進(jìn)一步探討。

3 小結(jié)與討論

同一作物或近緣作物在同一塊土壤上連續(xù)種植，出現(xiàn)發(fā)育不良、嚴(yán)重減產(chǎn)的現(xiàn)象稱為連作障礙［24］。引起連作障礙的原因較為復(fù)雜，是作物和土壤兩個系統(tǒng)綜合作用結(jié)果的外觀表現(xiàn)［25，26］。作物通過根系分泌某些化合物來吸引土壤中某些特定微生物類群，也能選擇性抑制某些微生物類群［27］。土壤微生物區(qū)系對土壤質(zhì)量有很大的影響，一般認(rèn)為細(xì)菌型土壤是土壤肥力提高的生物學(xué)標(biāo)志之一，真菌型土壤是地力衰退的標(biāo)志之一［28］。隨著地黃連續(xù)種植年限的增加，地黃土壤中微生物的多樣性降低，優(yōu)勢種群數(shù)量發(fā)生改變，土壤微生物類型由細(xì)菌型向真菌型過渡，導(dǎo)致地力衰竭［29］。在本研究中，與地黃的非重茬土壤相比，重茬土壤中真菌的數(shù)量高于非重茬土壤，而細(xì)菌、放線菌的數(shù)量恰好相反，這與吳林坤等［13］的研究結(jié)果相似。同時，對地黃重茬土壤施用不同濃度的生物菌肥、不同時間取樣分析發(fā)現(xiàn)，在生物菌肥濃度0.05%、取樣時間60 d時，土壤中細(xì)菌、放線菌數(shù)量之和最高，而真菌數(shù)量相對較少?？梢姡馐┥锞士捎行Ц淖兊攸S重茬土壤微生物數(shù)量和微生物群落構(gòu)成，該結(jié)果與盧明忠等 ［18］的研究一致。

本研究篩選出9種地黃重茬土壤中特有的根系殘留化合物。施用生物菌肥后，化合物2、化合物5、化合物6、化合物8是變化較大的土壤根系殘留化合物。根據(jù)吳宗偉等［30］的研究，推測這4種化合物抑制機(jī)理可能與酚酸作用機(jī)理類似，主要通過對根的抑制阻礙地黃生長。雖然外施生物菌肥能夠在一定程度上降解重茬土壤中根系殘留的某些化合物，但這是多種微生物和土壤因素共同作用的結(jié)果，單一因素有一定的局限性。因此，重茬土壤中根系殘留化合物的降解機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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