芒果乙烯信號轉導關鍵基因MiCTR1的克隆與序列分析

關鍵詞：芒果；乙烯響應轉錄因子；CTR；克??；表達分析

中圖分類號：S667 文獻標志碼：A

芒果（Mangnifera indica L.）是著名的熱帶水果，營養(yǎng)豐富、風味獨特，中國的芒果產量居世界第二[1-3]，其中，臺農1 號芒果（Tainung No.1）在我國海南、廣東、廣西等地均有大面積種植，它不僅品質優(yōu)良，還豐產性好、適應性強。芒果屬于典型的呼吸躍變型果實，采后代謝旺盛且對乙烯非常敏感，容易后熟而變黃、變軟，繼而腐爛，致使其品質大幅降低，貨架期短，影響芒果產業(yè)的發(fā)展[4]。CTR1是乙烯信號轉導途徑中重要的負調控因子，乙烯受體接收到乙烯信號后，能夠與CTR1 反應，共同完成乙烯反應的負調控模式[5]。CTR1 由多基因家族編碼，它們在結構和基因時空表達上各有特點[6]。目前已經分離擬南芥[7]中的AcTR1 基因，在模式植物的基礎上，CTR 基因在其他果實中的研究也取得了進展。番茄[8]和番木瓜[6]中分別分離出4 個CTR 基因，分別為LeCTR1～4 和CpCTR1～4，蘋果中分離了5 個MdCTR基因[9]，獼猴桃中分離了2 個AdCTR 基因[10]，而在大多數(shù)植物或果實中只分離到1 個CTR1 基因，如小麥[11]、大豆[12]、梨[13]、甘蔗[14]、甜瓜[15]等。隨著研究的深入，每一種果實中可能將會有更多的CTR 基因不斷被克隆。CTR1 直接影響果實成熟、衰老、軟化進程，在植物的生長、果實成熟過程中發(fā)揮重要的負調控作用，且在不同植物中表達模式可能不同。在番茄果實成熟過程中，4個CTR1-like 基因中只有LeCTR1 轉錄本含量隨著果實后熟進程而明顯增強，且能被外源乙烯所誘導[8]。木瓜的4 個CTR1-like 基因中，CpCTR2 和CpCTR4 與果實硬度呈顯著負相關，表明CpCTR可能在果實軟化中起重要作用[6]。桃子PpCTR1基因的表達量在乙烯釋放量達到最大量時相應減少，表明PpCTR1 基因與果實成熟軟化有密切關系[16]。

課題組前期已經分離并克隆了乙烯受體基因[17]，但芒果的CTR1 基因的分離和鑒定還未見報道。本研究以臺農1 號芒果為材料，結合芒果全基因組和轉錄組數(shù)據(jù)，對MiCTR1 基因進行克隆和序列分析，并通過實時熒光定量PCR 檢測其在芒果采后不同時期的相對表達量，揭示乙烯抑制劑1-MCP 處理對采后芒果CTR1 基因表達的調控機制，為研究CTR1 在果實成熟、衰老中的作用提供科學依據(jù)，進而為延長果實的貯藏壽命奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

臺農1號芒果采摘于廣西百色市，挑選大小均勻、成熟度8～9 成的果實為材料。1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）購于龍杏生技制藥股份有限公司；植物總RNA 提取試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司；RNAprep Pure 植物總RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；HiScript?ⅡQ RT SuperMix for qPCR 試劑盒和ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 芒果采摘之后參照YUAN 等[18]的方法進行處理，分為對照組（CK）和處理組（0.1 mg/L 1-MCP），處理之后的芒果分別用厚度為0.007 mm 的聚乙烯薄膜袋子分裝，置于25 ℃，相對濕度為85%～90%的條件下貯藏10 d，每2 d 取樣測定乙烯釋放速率和實時熒光定量分析。果肉樣品用液氮冷凍后，于–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乙烯釋放速率檢測 參照MIKU?A 等[19]的方法，采用乙烯分析測定儀檢測果實的乙烯釋放速率，結果以μL/（kg·min）計。

1.2.3 總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成按照HiPure HP Plant RNA Mini Kit 提植物總RNA小提試劑盒說明書，提取芒果組織總RNA。取總RNA 1 μg 使用HiScript?ⅡQ RT SuperMix forqPCR 試劑盒反轉錄合成cDNA 第一鏈，用于后續(xù)基因克隆和實時熒光定量分析。

1.2.4 基因克隆 根據(jù)前期芒果轉錄組測序數(shù)據(jù)結果，使用Premier 5.0 軟件設計基因特異性引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。以采后芒果果皮cDNA 為模板擴增目的片段全長。擴增反應體系（50 uL）：2×Es TaqMaster Mix （Dye） 25.0 μL， 10 μmol/L 引物各2.0 μL，cDNA 模板2 μL，ddH₂O 補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35 個循環(huán)。PCR 產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收，連接至pMD19-T 載體上，轉化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，在含有氨芐霉素的LB 固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.5 生物信息學分析 使用ExPASy-ProtParam、TMPRED、SignalP 5.0 Serve 和NetPhos 3.1 軟件預測MiCTR1 蛋白的理化特性、跨膜結構、信號肽和磷酸化位點；使用NCBI 的CD-Search 軟件分析蛋白的保守結構域；使用SOPMA 和Phyre2軟件分析蛋白質二、三級結構；使用DNAMAN 5.0軟件進行不同物種間同源基因的多序列比對分析；使用MEGA 6.0 軟件的Neighbor-Joining 法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并進行1000 次Bootstrap 檢驗。

1.2.6 實時熒光定量分析 通過qRT-PCR 檢測MiCTR 基因的表達情況，以芒果Actin1 為內參基因[20]，熒光定量PCR 引物見表1。參照TransstartTip Green qPCR Super Mix 試劑盒說明書配制反應體系（20.0 μL）：2×Trans Taq HiFiPCR SuperMix 10.0 μL，cDNA 模板1.0 μL，10 μmol/L 引物各0.5 μL，ddH₂O 補足至20.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性30 s；94 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，共進行40個循環(huán)。每個反應設3 次重復，采用2^–ΔΔCT 法計算MiCTR 基因的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，使用Duncan 法比較平均值之間的差異顯著性，使用Origin 軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 MiCTR1基因克隆和序列分析

利用RACE 技術克隆獲得MiCTR1 基因的3'末端和5'末端序列，將其與中間片段進行拼接，獲得MiCTR1 基因。MiCTR1 基因的cDNA 開放閱讀框長度為1551 bp，編碼516 個氨基酸。將MiCTR1 蛋白的氨基酸序列與其他物種的同源蛋白經過BLAST 比對分析發(fā)現(xiàn)（圖1），其與阿月渾子（Pistacia vera，XP_031265951.1）、全緣黃連木（Pistacia integerrima，KAJ0042545.1）、苦楝樹（Melia azedarach，KAJ4705780.1）、甜橙（Citrussinensis，XP_031265951.1）、巴西橡膠樹（Heveabrasiliensis，XP_021639805.2）的相似度分別為85.16%、85.35%、70.02%、68.64%、62.06%，表明MiCTR1 與其他物種的同源性蛋白相似度較高。

2.2 MiCTR1 蛋白的理化性質預測

通過ExPASy 軟件中的Protparam 預測MiCTR1 蛋白的理化性質，該蛋白的分子式為C₂₅₀₃H₃₉₃₂ N₇₁₂O₇₉₇S₂₆，總原子數(shù)為7970，分子量為57.58 kDa，理論等電點（pI）為5.72，負電荷和正電荷的氨基酸殘基總數(shù)分別為64（Asp+Glu）和50（Arg+Lys）個，脂肪系數(shù)為70.78。

MiCTR1 蛋白在氨基酸序列的第253 和第137處有疏水峰和親水峰（圖2），分別為1.689 和–2.878。親水值在–2.000 以下的親水峰有20 個，而疏水值在+2.000 以上的疏水峰為0 個。其親水性氨基酸明顯多于疏水性氨基酸，且親水性總平均值為–0.596，故推測MiCTR1 蛋白為親水性蛋白。

2.3 MiCTR1蛋白磷酸化位點預測

利用NetPhos3.1軟件預測MiCTR1 蛋白磷酸化位點（磷酸化位點閾值為0.5），如圖3 所示，MiCTR1 蛋白含有111 個磷酸化位點，其中含絲氨酸（Ser）82 個，蘇氨酸（Thr）15 個，酪氨酸（Tyr）14 個。由此可預測，MiCTR1蛋白調控乙烯信號轉導是以絲氨酸（Ser）的磷酸化修飾為主，蘇氨酸（Thr）為輔。

2.4 MiCTR1蛋白跨膜結構、信號肽、亞細胞定位預測

利用TMHMM Server v5.0 軟件對MiCTR1蛋白跨膜結構預測，結果如圖4 所示，MiCTR1 蛋白無跨膜結構。利用SignalP 4.1 Server 軟件預測MiCTR1 蛋白的信號肽，結果如圖5 所示，MiCTR1蛋白無信號肽序列（Likelihood 為0.0018），推測其為非分泌蛋白。使用PSORT II 軟件進行亞細胞定位預測，結果顯示MiCTR1 蛋白定位于細胞核。

2.5 MiCTR1蛋白的結構域預測

利用NCBI 的CD-Search 分析MiCTR1 蛋白的結構域，結果如圖6 所示，MiCTR1 蛋白在氨基酸序列189～285 處含有1 個保守的PB1 結構域，介導蛋白質之間的相互作用，是形成大分子信號轉導復合物以確保細胞信號轉導過程中特異性所必需的模塊化結構域。

2.6 MiCTR1 蛋白的二、三級結構預測

通過ExPASy 軟件中的SOPMA 對MiCTR1蛋白進行二級結構預測，結果如圖7 所示，該蛋白由α-螺旋（16.09%）、延伸鏈（12.79%）、β-轉角（1.74%）和無規(guī)則卷曲（69.38%）4種結構組成，其中以無規(guī)則卷曲為主。利用SWISSMODEL軟件預測MiCTR1 蛋白的三級結構，結果如圖8 所示，該蛋白有7 個β-折疊，4 個α-螺旋。

2.7 系統(tǒng)發(fā)育進化分析

使用MEGA 6.0 軟件的Neighbor-Joining 法構建MiCTR1 與其他物種CTR1 氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果表明（圖9），MiCTR1 與扁桃（Prunus dulcis）、桃（Prunus" persica）的CTR1親緣關系最近，其次是甜櫻桃（Prunus avium）、杏（Prunus armeniaca）、梅（Prunus mume）。

2.8 MiCTR1 基因在芒果貯藏期的表達分析

CTR1能與乙烯受體家族成員結合而被激活，阻礙乙烯的傳遞使植物表現(xiàn)出乙烯響應不敏感。由圖10A 所示，對照組的MiCTR1 基因在貯藏0～6 d 內的表達量快速上調，而后緩慢下調。處理組的MiCTR1 基因的表達量在2～4 d 內上調，4～6 d出現(xiàn)短暫下調之后，在貯藏后期上調。相比對照，乙烯抑制劑1-MCP 處理下調了MiCTR1 基因的表達，但在貯藏第10 天的表達量高于對照。前期研究顯示，在貯藏的0～6 d，1-MCP 處理的芒果軟化程度更低[18]，這可能與MiCTR1 基因的表達特性有關，表明MiCTR1 基因在芒果的后熟軟化中起作用。

由圖10B所示，處理組芒果在采后貯藏的前6d內乙烯釋放速率比較慢，在第6天開始快速上升，第7天達到最高峰后快速下降。對照組芒果的乙烯釋放速率從第5天開始快速上升，到第7天達到最高峰，而后快速下降。結果表明，經1-MCP處理后的芒果未推遲乙烯釋放速率高峰的出現(xiàn)，但是極顯著降低了峰值（Plt;0.01）。

3討論

本研究克隆了臺農1 號芒果MiCTR1 基因，通過生物學信息分析發(fā)現(xiàn)，MiCTR1 基因編碼的蛋白為親水蛋白，無跨膜結構和信號肽，MiCTR1蛋白含有一個PBI 結構域，亞細胞定位在細胞核，這與番木瓜[6]中CpCTRs 的定位結果一致。同源分析發(fā)現(xiàn)，MiCTR1 與扁桃、桃的CTR1 親緣關系最近。

芒果采后后熟軟化受到乙烯轉導的影響，CTR1 在乙烯信號通路中發(fā)揮著核心作用[21]。本研究中MiCTR1 基因的相對表達量在芒果采后貯藏的前6 d 快速上升。前期的研究顯示芒果硬度在相同時期快速下降[18]，二者剛好呈現(xiàn)相反的趨勢，這與番木瓜[6]的結論一致。MiCTR1 基因在芒果后熟期間表達上調，推測其可能在芒果的軟化中起作用。此外，榴蓮[22]、蘋果[23]中CTR1 基因的表達也分別在果實成熟期間上調。CTR 基因的表達還受到乙烯和乙烯抑制劑的影響，1-MCP 處理顯著抑制番木瓜CpCTRs[6]、桑葚MaCTR1[21]、榴蓮DzCTR1[22]、晚熟品種李子PsCTR1[24]的表達，這與本研究結果一致。經1-MCP 處理的蘋果果實中MdCTR1 基因的相對表達量高于對照果實[25]，說明乙烯抑制劑對CTR1 基因的表達調控在不同物種中存在差異。乙烯對CTR 基因的表達調控也存在物種差異，在番茄中，LeCTR1 的表達在其花衰老和果實成熟期間上調，并且被乙烯高度上調[26]，乙烯還使榴蓮[22]、梨子[13]和李子[24]的CTR1 的表達上調，而桑葚MaCTR1[21]的表達受到乙烯的抑制，而最早從擬南芥中分離出來的AtCTR1，其表達則不受包括乙烯在內的外部刺激的影響[27]。

在本研究中，對照組的乙烯釋放量在貯藏的6～8d最高，而MiCTR1 基因的相對表達量在第6天和第8 天也相對較高，說明乙烯能使MiCTR1基因表達上調。而1-MCP 處理組芒果MiCTR1 基因的表達則未出現(xiàn)這樣的規(guī)律。由于CTR1 是乙烯信號轉導的負調節(jié)因子，因此還有報道指出特定組織中CTR1 的水平與該組織的乙烯敏感性呈負相關[28]。西葫蘆CpCTR1 和CpCTR2 在雄花花瓣中的表達高于雌花，可能是雄花對乙烯的敏感性較低導致的[29]。芒果果實在成熟過程中對乙烯的敏感性可能也會發(fā)生變化，因此，MiCTR1 基因的表達隨著果實的后熟軟化上調，同時也受到乙烯抑制劑的調控。