響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助酶解法制備金針菇ACE抑制肽

摘要：以金針菇（Flammulina velutipes）為原料，采用超聲波輔助酶解法制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽，為金針菇的深加工提供依據(jù)。篩選制備金針菇ACE抑制肽的酶，優(yōu)化等電點(diǎn)沉淀法分離活性肽的最適pH。以ACE抑制率為響應(yīng)值，開展液料比、超聲時(shí)間、酶添加量等5個(gè)因素的單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。結(jié)果表明，制備金針菇ACE抑制肽的最佳蛋白酶為胰蛋白酶，沉淀活性肽的最佳pH為6.5。ACE抑制肽最佳制備條件為超聲功率250 W，酶解溫度37 ℃，酶解pH 8，液料比40∶1（mL/g），超聲時(shí)間5 min，酶添加量為金針菇樣品量的1.2%（g/g），酶解時(shí)間90 min。通過超濾分離法對(duì)ACE抑制肽進(jìn)行了分級(jí)，并分析其活性。在此條件下，金針菇肽的ACE抑制率為（65.36±1.53）%；截留分子質(zhì)量lt;3 kDa的肽ACE抑制率最高。

關(guān)鍵詞：金針菇（Flammulina velutipes）；ACE抑制肽；超聲波輔助酶法；響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TS201.2" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）11-0153-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.11.026 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis for preparation of ACE inhibitory peptides from Flammulina velutipes by response surface methodology

YANG Zhi-yu， WANG Guang-hui， MENG Juan-juan， ZHENG Xiao-yu， XU Li-jing， HAN Hao-lin

（College of Food and Pharmaceutical Engineering， Suihua University， Suihua" 152061， Heilongjiang，China）

Abstract： Angiotensin converting enzyme （ACE） inhibitory peptide was prepared from Flammulina velutipes by ultrasonic-assisted enzymolysis， providing the basis for further processing of Flammulina velutipes. The enzyme for preparing ACE inhibitory peptide of Flammulina velutipes was screened， and the optimal pH for separating active peptide by isoelectric point precipitation was optimized. With ACE inhibition rate as the response value， a single factor test was carried out with five factors， including liquid to material ratio， ultrasonic time， and enzyme dosage， and a response surface test with four factors and three levels was designed. The results showed that the best protease for preparing ACE inhibitory peptide of Flammulina velutipes was trypsin， and the best pH for precipitating active peptide was 6.5. The optimal preparation condition of ACE inhibitory peptide was as follows： ultrasonic power of 250 W， enzymolysis temperature of 37 ℃， enzymolysis pH of 8， liquid to material ratio of 40∶1 （mL/g）， and ultrasonic time of 5 min. Enzyme addition was 1.2% （g/g） of Flammulina velutipes sample， and enzymolysis time was 90 min. ACE inhibitory peptides were classified and their activity was analyzed using ultrafiltration separation method. Under this condition， the ACE inhibitory rate of Flammulina velutipes peptide was （65.36 ± 1.53） %； peptides with a molecular weight of lt;3 kDa had the highest ACE inhibition rate.

Key words： Flammulina velutipes； ACE inhibitory peptide； ultrasonic-assisted enzymatic method； response surface optimization

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin convening enzyme，ACE），是從人體組織和體液中發(fā)現(xiàn)的一種羧肽酶。ACE通過將血管緊張素I轉(zhuǎn)化成升壓物質(zhì)血管緊張素Ⅱ同時(shí)使降壓物質(zhì)緩激肽失活而升高血壓。ACE抑制肽是指對(duì)ACE具有抑制作用的肽類物質(zhì)，也稱降壓肽。同目前臨床上治療高血壓普遍采用的依那普利或卡托普利等抑制ACE活性的藥物相比， ACE抑制肽不僅可控制患者血壓，而且具有更安全、更易被患者從情感上接受等優(yōu)點(diǎn)［1-3］。目前制備ACE抑制肽的方法主要有酶解法［4-6］、微生物發(fā)酵法［7］、化學(xué)合成法［8］和基因重組法［9］等。其中酶解法由于工藝簡(jiǎn)單、制備周期短、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為制備ACE抑制肽最常用的方法［10］。

金針菇（Flammulina velutipes）是一種食用菌，富含蛋白質(zhì)，是制備活性肽的理想材料［11］。但目前學(xué)術(shù)界關(guān)于金針菇活性肽的研究?jī)H見于李桂峰等 ［12］關(guān)于抑菌肽、朱晶等［13］關(guān)于抗氧肽以及王廣慧等［14，15］采用發(fā)酵法制備金針菇ACE抑制肽和抗氧肽的報(bào)道。在發(fā)酵法制備金針菇ACE抑制肽的研究中，ACE抑制率僅為（51.25±1.02）%［14］，且發(fā)酵法制備活性肽存在技術(shù)水平要求高、制備周期長(zhǎng)的缺陷。有關(guān)研究表明，適度功率的超聲波作用產(chǎn)生的熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)及空化效應(yīng)不但有利于金針菇的破壁，還有利于底物蛋白質(zhì)構(gòu)象改變后酶切位點(diǎn)的暴露，從而增強(qiáng)酶解效果［16，17］。本研究采用超聲波預(yù)處理輔助酶解法制備金針菇ACE抑制肽，以期獲得活性更高的金針菇ACE抑制肽，為金針菇活性肽領(lǐng)域的研發(fā)作出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

金針菇，購(gòu)于綏化市億佳超市；硼酸、硼砂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和乙酸乙酯等為分析純，天津市濱?？频匣瘜W(xué)試劑有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）和馬尿酰組氨酰亮氨酸（Hippuryl-Histidyl-Leucine，HHL）為優(yōu)級(jí)純，美國(guó)Sigma公司；中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶生化試劑，比活均為40萬(wàn)U/g，南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

JR150型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，浙江金華永康市云達(dá)機(jī)械設(shè)備廠；DS-1000Y型超聲波細(xì)胞粉碎儀，江蘇天翎儀器有限公司；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；752型紫外可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；超濾離心管（截留分子質(zhì)量分別為3 kDa和10 kDa），美國(guó)Millipore公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超聲波輔助酶解法制備ACE抑制肽 金針菇子實(shí)體洗凈后，50 ℃烘干至恒重，粉碎后過80目篩備用。

取2 g金針菇粉，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求的液料比加入緩沖液，先超聲波處理，再添加蛋白酶，恒溫水浴酶解。隨后加熱至沸騰并持續(xù)10 min以滅酶活，" " " " 3 500 r/min下離心10 min，棄沉淀。上清液用等電點(diǎn)沉淀法獲取金針菇ACE抑制肽［18，19］。

1.3.2 ACE抑制率的測(cè)定 通過測(cè)定馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）作用下分解成馬尿酸的量來(lái)計(jì)算 ACE 抑制率，具體操作方法詳見參考文獻(xiàn)［14］。

1.3.3 蛋白酶的篩選及沉淀法分離ACE抑制肽最佳pH的確定 取4份金針菇粉，每份2 g，按50∶1（mL/g）的液料比依次加入pH為6、7、8的磷酸鹽緩沖液和pH為9的硼酸-硼砂緩沖液，先超聲波250 W處理5 min，然后再分別加入金針菇粉量1.2%（g/g）的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶，分別在50、50、37、50 ℃水浴中酶解90 min，然后在沸水浴中滅酶10 min，以3 500 r/min離心10 min后棄沉淀［20］。利用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)每種酶解上清液pH為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，將所獲得的金針菇ACE抑制肽沉淀用去離子水復(fù)溶并定容至10 mL，測(cè)ACE 抑制率，篩選出最適合制備金針菇ACE抑制肽的蛋白酶及沉淀法分離ACE抑制肽的最佳pH［14］。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 分別考察液料比、超聲功率、超聲時(shí)間、酶添加量以及酶解時(shí)間5個(gè)單因素對(duì)金針菇ACE抑制肽的ACE抑制率的影響，指出5個(gè)因素的水平。

1）液料比的影響。將5份質(zhì)量分別為2 g的金針菇粉按照液料比30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）加入pH為8的磷酸鹽緩沖液， 300 W功率下超聲5 min后加入金針菇樣品量1.0%（g/g）的最佳蛋白酶，在37 ℃下反應(yīng)90 min。后面的處理方法同“1.3.1”，測(cè)定ACE抑制肽的ACE 抑制率。

2）超聲功率的影響。在5份質(zhì)量分別為2 g的金針菇粉中加入pH為8的磷酸鹽緩沖液，液料比為50∶1（mL/g），按前面所述方法制備ACE抑制肽。超聲功率分別設(shè)置為200、250、300、350、400 W，超聲處理時(shí)間為5 min，最佳蛋白酶添加量為1.0%（g/g），酶解時(shí)間選擇90 min。

3）超聲時(shí)間的影響。在5份質(zhì)量分別為2 g的金針菇粉中按照液料比為50∶1（mL/g）加入pH為8的磷酸鹽緩沖液，按前面所述方法制備ACE抑制肽。其中超聲功率選擇250 W，超聲時(shí)間分別設(shè)置為1、3、5、7、9 min，最佳蛋白酶添加量選擇1.0%（g/g），酶解時(shí)間為90 min。

4）酶添加量的影響。在5份質(zhì)量分別為2 g的金針菇粉中按照液料比為50∶1 （mL/g）加入pH為8的磷酸鹽緩沖液，按前面所述方法制備ACE抑制肽。超聲功率選擇250 W，超聲時(shí)間選擇5 min，最佳蛋白酶添加量分別設(shè)置為0.5%、0.7%、1.0%、1.2%、1.4%（g/g），酶解90 min。

5）酶解時(shí)間的影響。在5份質(zhì)量分別為2 g的金針菇粉中按照液料比為50∶1 （mL/g）加入pH為8的磷酸鹽緩沖液，按前面所述方法制備ACE抑制肽。超聲功率選擇250 W，超聲時(shí)間選擇5 min，最佳蛋白酶添加量選擇1.2%（g/g），分別酶解45、60、75、90、105 min。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，利用Design-expert 8.0.6軟件的Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，確定出最佳制備條件［21，22］。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表1所示。

1.3.6 ACE抑制肽的分級(jí) 在最佳工藝條件下獲得的金針菇ACE抑制肽，用pH沉淀法分離。所得沉淀用去離子水復(fù)溶，經(jīng)一次性針筒過濾器（內(nèi)附0.22 μm微孔濾膜）過濾，再用截留分子質(zhì)量分別為3 kDa和10 kDa的兩種超濾管進(jìn)行分離，并比較lt;3 kDa、3～10 kDa、gt;10 kDa 3個(gè)不同分子質(zhì)量區(qū)間肽的ACE抑制性。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析方法 所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)后所得結(jié)果，采用 Excel 2010軟件進(jìn)行分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選及沉淀法分離ACE抑制肽最佳pH的確定

由表2可知，胰蛋白酶水解物在pH為6.5處沉淀所獲得的金針菇ACE抑制肽的ACE抑制率最高，因此后續(xù)試驗(yàn)皆選用胰蛋白酶作為蛋白水解酶，酶解溫度為 37 ℃，對(duì)酶解后的產(chǎn)物在pH為6.5處進(jìn)行沉淀分離以獲得金針菇ACE抑制肽。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

利用篩選出的胰蛋白酶按照上面所述方法制備金針菇ACE抑制肽，同時(shí)考察不同的工藝條件對(duì)其ACE抑制率的影響。

2.2.1 液料比的影響 由圖1可知，最佳液料比為50∶1 （mL/g），低于或高于此值時(shí)ACE抑制率都明顯下降。原因可能是當(dāng)液料比過低時(shí)，一方面不利于超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)發(fā)揮破壁的作用，另一方面也會(huì)影響到細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶所作用的底物蛋白質(zhì)分子的浸出以及與酶的結(jié)合；但液料比過高時(shí)，會(huì)降低胰蛋白酶及底物蛋白質(zhì)分子的濃度，從而降低酶解效率［ 23-25］。

2.2.2 超聲功率的影響 由圖2可知，在250 W時(shí)ACE抑制率最高，因此選擇最佳超聲功率為250 W。這是因?yàn)檫m度功率的超聲波作用產(chǎn)生的熱效應(yīng)、空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)不但可以破壞金針菇子實(shí)體細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜從而使胰蛋白酶更容易與細(xì)胞內(nèi)的底物蛋白質(zhì)分子結(jié)合，還可以破壞底物蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象，使原本隱藏于分子內(nèi)部的胰蛋白酶作用位點(diǎn)得以暴露，也有利于酶的水解作用。如果超聲波功率過小就達(dá)不到如此好的效果，而超聲波功率過大，過強(qiáng)的空化效應(yīng)導(dǎo)致空化泡破裂產(chǎn)生的瞬間高溫高壓可使水蒸氣熱解離產(chǎn)生羥基自由基和氫原子，由其引起的氧化還原反應(yīng)不但可使底物蛋白質(zhì)分子降解，也可引起其他多聚物分子的降解，導(dǎo)致大量雜質(zhì)激增，從而影響有效的“胰蛋白酶-底物”復(fù)合物的形成［23，26-28］。

2.2.3 超聲時(shí)間的影響 由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，ACE抑制率呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)超聲時(shí)間為5 min時(shí)，其抑制率最高，因此選擇最佳超聲時(shí)間為5 min。原因可能是超聲時(shí)間過短，不能充分破壞金針菇的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和胰蛋白酶底物蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，使酶解效果不理想；但超聲處理時(shí)間過長(zhǎng)，過強(qiáng)的空化效應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基和氫原子也會(huì)導(dǎo)致底物蛋白質(zhì)分子的降解以及大量雜質(zhì)的產(chǎn)生［23，29-31］。

2.2.4 酶添加量的影響 由圖4可知，隨著酶添加量增多，ACE抑制率呈先升高后降低的趨勢(shì)，在酶添加量為1.2%處達(dá)到最高值。原因可能是酶添加量過低時(shí)，反應(yīng)體系內(nèi)酶濃度過低，不足以滿足胰蛋白酶充分水解底物蛋白質(zhì)分子的需要；當(dāng)酶添加量過多時(shí)，由于底物蛋白的量有限，生成的酶-底物復(fù)合物的量不會(huì)增加，所以產(chǎn)物ACE抑制肽的量也不會(huì)提高，相反過量的酶可能會(huì)增加反應(yīng)液的黏稠度，影響底物蛋白質(zhì)分子的溶出及與酶的結(jié)合［23］。所以最佳酶添加量選擇1.2%。

2.2.5 酶解時(shí)間的影響 由圖5可知，ACE抑制率在酶水解時(shí)間為90 min時(shí)顯示為最高值。原因可能是酶解時(shí)間過短時(shí)，胰蛋白酶與底物蛋白質(zhì)分子間反應(yīng)不完全，造成ACE抑制肽生成量很少；但當(dāng)酶解時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，反應(yīng)過程中產(chǎn)生的酸堿性物質(zhì)或產(chǎn)物的反饋抑制作用都可能使胰蛋白酶活性下降，導(dǎo)致ACE抑制率下降［23］。因此選擇最佳酶解時(shí)間為90 min。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇液料比、超聲時(shí)間、酶添加量、酶解時(shí)間4個(gè)單因素為變量，超聲功率固定為250 W，酶解溫度為37 ℃，酶解pH為8，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分析見表3，方差分析見表4。

利用軟件Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程為：R=

-561.938 54+1.122 92×A+24.910 42×B+584.325 00×C + 4.276 00 × D + 0.028 75 × AB - 0.462 50 × AC +

2.166 67E - 003 × AD - 4.000 00 × BC + 5.000 00E - 003 ×BD - 0.725 00 × CD - 0.016 08 × A2 - 2.314 38 × B2 -

195.500 00×C2-0.019 31×D2。

由表4可知，模型的Plt;0.000 1，表明該回歸方程模型極顯著，且模型失擬值P=0.535 0gt;0.05不顯著，決定系數(shù)R2=0.994 8，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.989 6，說(shuō)明模型擬合性較好。從表4還可以看出，A、B、C、D、BC、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)金針菇肽ACE抑制率的影響極顯著（Plt;0.001），AC的影響顯著（Plt;0.05）。曲面圖和等高線圖如圖6至圖11所示。

由于等高線通常向影響相對(duì)大的因素軸向聚集，因此綜合以上6組圖來(lái)看，4個(gè)因素的影響程度排序?yàn)锳gt;B gt;Cgt;D。

由Design expert 8.0.6 軟件預(yù)測(cè)的最優(yōu)工藝條件為液料比40∶1（mL/g）、超聲時(shí)間4.66 min、酶添加量1.23%、酶解時(shí)間90.44 min，ACE抑制率可達(dá)63.77%。為了試驗(yàn)操作方便，將條件修正為液料比40∶1（mL/g）、超聲時(shí)間5 min、酶添加量1.2%，酶解時(shí)間90 min。3次驗(yàn)證試驗(yàn)后得到金針菇ACE抑制肽的ACE抑制率為（65.36±1.53）%。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值相差很小，表明所建模型與實(shí)際情況高度擬合，此響應(yīng)面法優(yōu)化的超聲波輔助酶解法制備金針菇ACE抑制肽的工藝可靠。

2.4 ACE抑制肽的分級(jí)分離結(jié)果

3個(gè)分子質(zhì)量區(qū)間內(nèi)肽的ACE抑制率見表5。由表5可知，ACE抑制率與肽的分子質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。截留分子質(zhì)量lt;3 kDa的金針菇ACE抑制肽活性最好。

3 小結(jié)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化后的超聲波輔助酶解法制備金針菇ACE抑制肽的最佳條件為：選用胰蛋白酶；在pH為6.5處沉淀分離ACE抑制肽；液料比為40∶1（mL/g），超聲時(shí)間為5 min，酶添加量為1.2%，酶解時(shí)間為90 min。按此條件制備的金針菇ACE抑制肽，其ACE抑制率為（65.36±1.53）%，優(yōu)于發(fā)酵法制備的金針菇ACE抑制肽的抑制率（51.25±1.02）% ［14］；截留分子質(zhì)量lt;3 kDa的金針菇ACE抑制肽活性最好。此研究成果將為金針菇ACE抑制肽更深層次的理論研究和產(chǎn)品開發(fā)奠定一定的基礎(chǔ)。在下一步的工作中，將對(duì)金針菇ACE抑制肽做進(jìn)一步的純化和精制，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行剖析檢測(cè)。

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收稿日期：2023-05-08

基金項(xiàng)目：黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202210236006）；黑龍江省省屬高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（YWK10236200203）

作者簡(jiǎn)介：楊志雨（2002-），女，黑龍江大慶人，在讀本科生，專業(yè)方向?yàn)橹扑幑こ?，（電話?8246833970（電子信箱）76575042@qq.com；通信作者，王廣慧（1973-），女，黑龍江綏化人，教授，碩士，主要從事食用菌中生物活性物質(zhì)的分離與鑒定研究，（電話）18846509786（電子信箱）wanggh5487@sina.com。