藏藥十二味翼首散通過抑制中性粒細(xì)胞浸潤減輕脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷的研究

[摘要]"目的"探討藏藥十二味翼首散干預(yù)急性肺損傷的免疫機(jī)制。方法"構(gòu)建脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型，并以十二味翼首散處理。通過肺部病理切片及血?dú)夥治鰴z測明確十二味翼首散對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的干預(yù)作用。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked"immunosorbent"assay，ELISA）技術(shù)檢測大鼠肺泡灌洗液促炎因子腫瘤壞死因子-α（tumor"necrosis"factor-α，TNF-α）及抑炎因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10的表達(dá)情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠肺泡灌洗液、肺、脾及外周血中免疫細(xì)胞的變化情況。結(jié)果"LPS成功誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型，十二味翼首散可在不同程度上減輕LPS誘導(dǎo)急性肺損傷中炎癥細(xì)胞的滲出，升高氧分壓。大鼠肺泡灌洗液ELISA結(jié)果顯示，與NC組比較，急性肺損傷大鼠的肺泡灌洗液TNF-α水平升高、IL-10水平降低，而十二味翼首散可緩解該效應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，十二味翼首散可顯著降低大鼠肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞浸潤，而對巨噬細(xì)胞及適應(yīng)性免疫應(yīng)答無明顯影響。結(jié)論"十二味翼首散可通過抑制中性粒細(xì)胞浸潤減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，這為充分認(rèn)識(shí)十二味翼首散治療作用的效應(yīng)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]"十二味翼首散；急性肺損傷；中性粒細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]"R29；R392.3；R563""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.33.012

Tibetan"medicine"Twelve"Flavors"Yishou"San"alleviated"lipopolysaccharide-"induced"acute"lung"injury"through"inhibiting"neutrophil"infiltration

RONG"Wenling1，"LI"Yaxuan1，"HONG"Yanfei2，"CUI"Jiaqi2，"FENG"Jing1，"CHU"Zhulang1，3，"PENG"Guiying2，"REN"Qingjia3，"DU"Qinghong1

1.School"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Beijing"University"of"Chinese"Medicine，"Beijing"100029，"China;"2.School"of"Life"Sciences，"Beijing"University"of"Chinese"Medicine，"Beijing"100029，"China;"3.Graduate"School，"University"of"Xizang"Medicine，"Lhasa"850000，"Xizang，"China

[Abstract]"Objective"To"explore"the"immune"mechanism"of"Tibetan"medicine"Twelve"Flavors"Yishou"San"in"intervening"with"acute"lung"injury."Methods"Construct"a"lipopolysaccharide"（LPS）-induced"acutenbsp;lung"injury"rat"model"and"treated"it"with"Twelve"Flavors"Yishou"San."The"intervention"effect"of"Twelve"Flavors"Yishou"San"on"LPS"induced"acute"lung"injury"was"determined"through"lung"pathological"sections"and"blood"gas"analysis."Enzyme"linked"immunosorbent"assay"（ELISA）"was"used"to"detect"the"expression"of"pro-inflammatory"cytokine"tumor"necrosis"factor-α"（TNF-α）"and"anti-inflammatory"cytokine"interleukin"（IL）-10"in"rat’s"bronchoalveolar"lavage"fluid."Flow"cytometry"was"used"to"detect"changes"in"immune"cells"in"rat’s"bronchoalveolar"lavage"fluid，"lungs，"spleen"and"peripheral"blood."Results"LPS"successfully"induced"an"acute"lung"injury"model"in"rats，"and"Twelve"Flavors"Yishou"San"could"alleviate"the"exudation"of"inflammatory"cells，"elevated"oxygen"partial"pressure"in"LPS"induced"acute"lung"injury"to"varying"degrees."The"ELISA"results"of"rat"bronchoalveolar"lavage"fluid"showed"that"compared"with"normal"control"group，"the"TNF-α"level"in"the"bronchoalveolar"lavage"fluid"of"rats"with"acute"lung"injury"was"increased"and"the"IL-10"level"was"decreased，"while"the"Twelve"Flavors"Yishou"San"could"alleviate"this"effect."The"results"of"flow"cytometry"showed"that"Twelve"Flavors"Yishou"San"could"significantly"reduce"neutrophil"infiltration"in"rat"bronchoalveolar"lavage"fluid，"but"had"no"significant"effect"on"macrophages"and"adaptive"immune"response."Conclusion"Twelve"Flavors"Yishou"San"can"alleviate"LPS"induced"acute"lung"injury"by"inhibiting"neutrophil"infiltration，"providing"an"important"experimental"basis"for"fully"understanding"the"therapeutic"mechanism"of"Twelve"Flavors"Yishou"San.

[Key"words]"Twelve"Flavors"Yishou"San;"Acute"lung"injury;"Neutrophil

急性肺損傷（acute"lung"injury，ALI）引發(fā)的急性呼吸窘迫綜合征（acute"respiratory"distress"syndrome，ARDS）是危重癥新型冠狀病毒感染（corona"virus"disease"2019，COVID-19）患者死亡的主要原因，其機(jī)制與細(xì)胞因子風(fēng)暴等免疫失衡有關(guān)[1]。藏藥十二味翼首散出自《藏醫(yī)醫(yī)訣補(bǔ)遺》，主治瘟病、時(shí)疫等癥，現(xiàn)主要應(yīng)用于瘟疫、流行性感冒、乙型腦炎、痢疾、發(fā)熱等疾病的治療[2]。十二味翼首散被推薦用于防治COVID-19，但其發(fā)揮的效應(yīng)及機(jī)制尚缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究依據(jù)。本研究應(yīng)用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)ALI大鼠模型，圍繞肺泡炎性滲出和微血管損傷導(dǎo)致的低氧血癥等病理狀態(tài)及免疫細(xì)胞失衡，探討十二味翼首散對ALI的干預(yù)作用及免疫細(xì)胞機(jī)制。

1""材料與方法

1.1""實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6～8周齡雄性SD大鼠[斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司]，體質(zhì)量200～250g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SYXK（京）2019-0010，動(dòng)物使用許可證號(hào)為110324210102492841。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由飲水、進(jìn)食，環(huán)境溫度20～24℃。本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：BUCM-4-2022101701-4005）。

1.2""主要試劑

醋酸地塞米松片購自新鄉(xiāng)市常樂制藥有限責(zé)任公司，雙黃連口服液購自哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司，十二味翼首散為青海省藏醫(yī)院制劑科制備的散劑。LPS購自美國Sigma-Aldrich公司，酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked"immunosorbent"assay，ELISA）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor"necrosis"factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10購自美國Invitrogen公司。異硫氰酸熒光素（fluorescein"isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記小鼠抗大鼠CD3抗體和CD86抗體、別藻藍(lán)蛋白-Cy7標(biāo)記小鼠抗大鼠CD4抗體和CD45抗體、活性紫510標(biāo)記小鼠抗大鼠CD8a抗體、Alexa"Fluor"647標(biāo)記小鼠抗大鼠γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）抗體、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記小鼠抗大鼠IL-4抗體和CD45R抗體、PE-Cy"7標(biāo)記小鼠抗大鼠CD11b/c抗體（美國BD公司）；Alexa"Fluor"647熒光標(biāo)記小鼠抗大鼠CD163抗體（英國Abcam公司），PE標(biāo)記小鼠抗大鼠CD68抗體（美國Biolegend公司）；PE-Cy7標(biāo)記小鼠抗大鼠IL-17A抗體（美國Invitrogen公司）。

1.3""ALI大鼠模型的構(gòu)建及血?dú)夥治?/p>

將本實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周稱重后隨機(jī)分為7組：空白組（NC組）、模型組（LPS組）、雙黃連口服液組（SHL組）、地塞米松組（DXMS組）、十二味翼首散高劑量組（12H組）、十二味翼首散中劑量組（12M組）、十二味翼首散低劑量組（12L組），每組各12只大鼠。造模前24h和2h分別行灌胃給藥。其中，SHL組雙黃連口服液給藥劑量為6ml/kg；DXMS組地塞米松給藥劑量為2mg/kg；十二味翼首散以生理鹽水溶解后，按照人和大鼠體表面積折算，確定12H組、12M組、12L組給藥劑量分別為0.04g/100g、0.02g/100g和0.01g/100g；NC組和LPS組灌胃等容量（10ml/kg）生理鹽水。

造模前8h禁食禁水，除NC組外，其余各組于麻醉后，舌下靜脈注射LPS（5mg/kg）建立ALI模型，造模后24h取材[3]。制備脾臟單細(xì)胞懸液；并從腹主動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血1ml，進(jìn)行血?dú)夥治黾巴庵苎庖呒?xì)胞檢測。

1.4""肺組織病理學(xué)分析

造模結(jié)束處死大鼠，摘取肺組織于10%甲醛溶液中固定72h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作病理切片。染色后利用全自動(dòng)組織掃描機(jī)拍照。蘇木精-伊紅染色評定支氣管周圍的炎癥細(xì)胞浸潤程度。

1.5""肺組織單細(xì)胞懸液制備

取大鼠新鮮肺組織，將肺組織剪碎，經(jīng)含5%乙二胺四乙酸的Hank’s平衡鹽溶液清洗2遍，用1mg/ml膠原酶Ⅲ和20mg/ml脫氧核糖核酸酶Ⅰ于37℃消化45min后，用70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾離心，用4.5ml"40%的Percoll溶液重懸細(xì)胞低速離心25min，留取底部沉淀細(xì)胞，重懸獲得肺組織單細(xì)胞懸液。

1.6""支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞的制備及其因子測定

處死大鼠后暴露氣管及肺，分離氣管，剪開一個(gè)小口，將氣管插管頭小心插入氣管中1cm固定。注射器吸取含1%牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖液0.8ml，緩慢注入肺組織中，回抽注射器，確?；厥章试?0%以上，重復(fù)連續(xù)灌洗全肺3次。將收集的全部肺泡灌洗液在4℃下，1800轉(zhuǎn)/min，離心5min，收集沉淀細(xì)胞，并按ELISA試劑盒說明檢測TNF-α及IL-10的表達(dá)水平。

1.7""流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫細(xì)胞表型

取制備好的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar"lavage"fluid，BALF）細(xì)胞、脾單細(xì)胞、外周血細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)分析免疫細(xì)胞表型。加入Fc受體阻斷劑、細(xì)胞表面熒光抗體，冰上避光孵育30min后置于流式細(xì)胞儀檢測。檢測IL-4等胞內(nèi)細(xì)胞因子分泌時(shí)，在表面抗體結(jié)束后，按胞內(nèi)染色說明書先后依次加入破膜液、胞內(nèi)抗體，最后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。以CD45+F4/80+CD11b+細(xì)胞界定為巨噬細(xì)胞，以CD45+CD11b+Ly6G+細(xì)胞界定為中性粒細(xì)胞；脾、外周血中，以CD4+"IFN-γ+界定為輔助性T（helper"T，Th）1細(xì)胞，以CD4+IL-4+界定為Th2細(xì)胞，以CD4+IL-17+界定為Th17細(xì)胞，以CD3+界定為T細(xì)胞，以B220+界定為B細(xì)胞。

1.8""統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS"26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""十二味翼首散對ALI大鼠肺結(jié)構(gòu)的影響

NC組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡內(nèi)沒有滲出物，肺間質(zhì)也無明顯充血。LPS組大鼠表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷，可見肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡內(nèi)有大量滲出的炎癥細(xì)胞，以中性粒細(xì)胞為主，還含有少量滲出的纖維素和漿液，部分肺泡壁內(nèi)表面形成一層透明膜；肺泡間隔水腫、增寬；部分細(xì)支氣管管腔內(nèi)也有滲出物。SHL組和DXMS組大鼠肺泡滲出明顯減輕。十二味翼首散可不同程度地減輕肺泡滲出，以12H組效果最好，見圖1。

2.2""十二味翼首散對ALI大鼠血?dú)獾挠绊?/p>

2.2.1""動(dòng)脈血pH值""NC組大鼠的動(dòng)脈血pH為7.35～7.45，LPS組大鼠動(dòng)脈血pHlt;7.35，表明ALI所致彌漫性肺泡損傷可導(dǎo)致大鼠嚴(yán)重缺氧和酸中毒；12H組大鼠動(dòng)脈血pHlt;7.35，SHL組、DXMS組、12M組及12L組大鼠動(dòng)脈血pH值均為7.35～7.45，見圖2。

2.2.2""動(dòng)脈血氧分壓""與NC組比較，LPS組大鼠動(dòng)脈血氧分壓（partial"arterial"oxygen"pressure，PaO2）顯著下降（Plt;0.05）；與LPS組比較，DXMS組大鼠PaO2水平顯著升高（Plt;0.05），且12M組大鼠PaO2水平的升高程度顯著高于SHL組（Plt;0.05），見圖3。

2.2.3""動(dòng)脈血二氧化碳分壓""與NC組比較，LPS組大鼠動(dòng)脈血二氧化碳分壓（partial"pressure"of"carbon"dioxide，PCO2）顯著下降（Plt;0.01），表明缺氧可引起肺過度通氣，從而導(dǎo)致動(dòng)脈血PCO2水平降低。與LPS組比較，SHL組大鼠動(dòng)脈血PCO2略升高，DXMS組、12H組、12M組、12L組大鼠動(dòng)脈血PCO2未見明顯改變，見圖4。

2.3""十二味翼首散對ALI大鼠免疫細(xì)胞的影響

2.3.1""十二味翼首散對大鼠免疫細(xì)胞總數(shù)的影響""與NC組比較，LPS組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)顯著升高，十二味翼首散治療后水平下降，見圖5A。提示LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型中，肺泡中大量細(xì)胞浸潤，而十二味翼首散對其有治療作用。12H組大鼠肺組織細(xì)胞數(shù)量明顯高于其他各組（Plt;0.01），見圖5B；與NC組比較，LPS組大鼠外周血、脾臟中的免疫細(xì)胞數(shù)量降低（Plt;0.05），十二味翼首散治療后恢復(fù)，見圖5C、5D。器官層面，與NC組比較，LPS組大鼠的肺組織質(zhì)量、肺指數(shù)均顯著升高，大鼠經(jīng)十二味翼首散治療后，12L組和12M組肺組織重量、肺指數(shù)均下降，但12H組肺組織的質(zhì)量、肺指數(shù)卻升高，見圖5E、圖5F；與NC組比較，LPS組大鼠的脾臟質(zhì)量升高（Plt;0.05），十二味翼首散治療后僅12L組恢復(fù)；12H組大鼠的脾臟指數(shù)高于其他各組（Plt;0.05），見圖5G、圖5H。

2.3.2""十二味翼首散干預(yù)ALI大鼠BALF中免疫細(xì)胞種類的變化""進(jìn)一步以流式細(xì)胞術(shù)分析BALF中免疫細(xì)胞表型，見圖6A。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，LPS組大鼠BALF中促炎M1型巨噬細(xì)胞比例降低，十二味翼首散治療后并沒有恢復(fù)；與NC組比較，LPS組大鼠促炎M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），但12M組明顯降低（Plt;0.05），見圖6B、圖6C；與NC組比較，LPS組大鼠BALF中性粒細(xì)胞的比例和數(shù)量均顯著升高，而12L組、12M組和12H組大鼠經(jīng)不同劑量十二味翼首散治療后，其中性粒細(xì)胞數(shù)量降低，見圖6D、圖6E，提示LPS誘導(dǎo)ALI肺泡灌洗液的免疫炎癥細(xì)胞主要是中性粒細(xì)胞，十二味翼首散則可降低炎癥中性粒細(xì)胞的數(shù)量。

2.3.3""十二味翼首散干預(yù)ALI大鼠肺臟免疫細(xì)胞種類的變化""與NC組比較，LPS組大鼠肺組織中CD3+細(xì)胞比例明顯升高（Plt;0.01），且十二味翼首散治療后完全恢復(fù)；與NC組比較，LPS組大鼠CD3+細(xì)胞數(shù)量明顯降低（Plt;0.01），十二味翼首散治療后并沒有恢復(fù)，見圖7A。進(jìn)一步分析T細(xì)胞亞型變化發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，LPS組大鼠CD4+T細(xì)胞比例沒有明顯變化，其數(shù)量降低，見圖7B；與NC組比較，LPS組CD8+T細(xì)胞數(shù)量及比例均降低，而十二味翼首散治療后恢復(fù)，見圖7C。在CD4+T細(xì)胞亞群中，與NC組比較，LPS組大鼠Th1細(xì)胞數(shù)量及比例降低（Plt;0.05），十二味翼首散治療后，12M組恢復(fù)，見圖7D；與NC組比較，LPS組大鼠Th2細(xì)胞比例升高，但其數(shù)量降低，十二味翼首散治療后，12H組大鼠Th2細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)（Plt;0.05），見圖7E；與NC組比較，LPS組大鼠Th17細(xì)胞數(shù)量及比例降低（Plt;0.01），見圖7F。在CD8+T細(xì)胞即細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic"T"cell，Tc）亞群中，Tc1細(xì)胞比例在各組中均不高，見圖7G；與NC組比較，LPS組大鼠Tc2細(xì)胞數(shù)量降低（Plt;0.05），十二味翼首散治療后，12H組恢復(fù)，雖然12L組、12H組大鼠的Tc2細(xì)胞比例較LPS組升高，但LPS組與NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），可能由于藥物作用，見圖7H；與NC組比較，LPS組大鼠Tc17細(xì)胞比例及細(xì)胞數(shù)量均降低，十二味翼首散治療后，12L組、12H組大鼠Tc17細(xì)胞比例恢復(fù)，見圖7I。理論上分析，在LPS誘導(dǎo)的ALI模型中，如果獲得性免疫激活，T細(xì)胞的數(shù)量、比例應(yīng)升高；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中雖然一些組別的細(xì)胞比例或數(shù)量的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均未體現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的ALI模型中獲得性免疫激活的特征。

2.3.4""十二味翼首散干預(yù)ALI大鼠外周血中免疫細(xì)胞種類的變化""分析外周血中免疫細(xì)胞的變化，見圖8和圖9。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與肺臟中免疫細(xì)胞變化類似，雖然十二味翼首散治療ALI后，12L組大鼠較LPS組大鼠的CD3、CD4、CD8、Th2、Tc1、Tc2、Tc17的細(xì)胞數(shù)量有所升高；但與NC組比較，LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠外周血CD3、CD4、CD8、Th1、Th2、Th17、Tc1、Tc2、Tc17細(xì)胞比例及數(shù)量均無顯著差異，見圖9A～圖9I。提示LPS誘導(dǎo)的ALI短期急性炎癥模型可能并未激活T細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異可能由藏藥十二味翼首散對大鼠的其他作用，而并非針對ALI的治療作用。

2.3.5""十二味翼首散干預(yù)ALI大鼠脾臟免疫細(xì)胞種類的變化""分析脾臟中免疫細(xì)胞變化，見圖10A。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，LPS組大鼠脾臟中B細(xì)胞、CD3+T、CD4+T、CD8+T的比例均無明顯變化，而細(xì)胞數(shù)量均有降低趨勢，提示短期急性炎癥模型可能并未激活T、B細(xì)胞；十二味翼首散處理后，B細(xì)胞、CD3+T、CD4+T、CD8+T的數(shù)量有上升趨勢，提示十二味翼首散可能本身有激活T、B細(xì)胞的功能，而并非對LPS誘導(dǎo)ALI的治療作用，見圖10B～10E。

2.4""十二味翼首散對ALI大鼠炎性因子表達(dá)的影響

2.4.1""TNF-α的表達(dá)""與NC組相比，LPS組大鼠BALF中的TNF-α水平顯著升高（Plt;0.05），見圖11。升高的TNF-α主要來源于浸潤的炎癥細(xì)胞，表明ALI引起肺的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。與LPS組相比，SHL組及12M組、12L組大鼠BALF中TNF-α水平均顯著降低（Plt;0.05），且低劑量十二味翼首散的作用顯著優(yōu)于地塞米松（Plt;0.05）。

2.4.2""IL-10的表達(dá)""與NC組相比，LPS組大鼠BALF中的IL-10水平雖無顯著改變，但雙黃連和低劑量十二味翼首散均能顯著升高IL-10水平（Plt;0.05），見圖12。

3""討論

ALI引發(fā)的ARDS是危重癥COVID-19患者死亡的主要原因[1]。因此，及時(shí)有效地控制ALI對改善危急重癥呼吸系統(tǒng)疾病患者預(yù)后、降低死亡率非常關(guān)鍵。在ARDS發(fā)生發(fā)展過程中，病毒侵入肺后，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞募集到肺泡腔，通過分泌IFN-γ誘導(dǎo)肺泡壁細(xì)胞凋亡；同時(shí)釋放趨化因子和其他細(xì)胞因子增加毛細(xì)血管壁的通透性，繼而招募中性粒細(xì)胞；大量中性粒細(xì)胞通過激活、趨化、浸潤、吞噬及脫顆粒等多種方式導(dǎo)致肺泡壁細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，破壞肺泡-毛細(xì)血管屏障；最終血液中的細(xì)胞、蛋白、血漿等成分外溢，進(jìn)入肺泡腔和肺間質(zhì)引發(fā)水腫，從而妨礙氣-血交換，導(dǎo)致患者進(jìn)行性低氧血癥和呼吸困難[4-5]。另外，重癥COVID-19患者外周血中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞顯著減少，且與疾病的嚴(yán)重程度和病死率相關(guān)[6]。細(xì)胞表面免疫抑制分子如程序性死亡受體1和T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3表達(dá)水平升高，提示其可能走向功能耗竭狀態(tài)[7]。但T細(xì)胞的狀態(tài)卻被顯著激活：CD4+T細(xì)胞中具有高促炎效應(yīng)的Th17細(xì)胞數(shù)量增加，CD8+T細(xì)胞則呈現(xiàn)高顆粒酶細(xì)胞毒性[8]。同時(shí)，BALF中出現(xiàn)明顯的CD8+T細(xì)胞浸潤和克隆擴(kuò)增[9]。與此同時(shí)，COVID-19患者血清中多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子，包括IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-1受體拮抗劑、C-C基序趨化因子配體（C-C"motif"chemokine"ligand，CCL）2、CCL8、CXC基序趨化因子配體（C-X-C-motif"chemokine"ligand，CXCL）2、CXCL8、CXCL9和CXCL16等[10-11]。高水平促炎細(xì)胞因子可導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致肺、心等多組織器官的嚴(yán)重?fù)p傷。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)ALI大鼠肺病理切片炎癥細(xì)胞浸潤明顯增加，血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示PaO2降低、PCO2升高，表明LPS可成功誘導(dǎo)ALI模型，妨礙大鼠肺臟氣血交換。BALF中中性粒細(xì)胞大量浸潤，TNF-α水平顯著升高，IL-10水平降低，表明LPS誘導(dǎo)的ALI與免疫失衡密切相關(guān)。

十二味翼首散的成分包括翼首草150g、榜嘎（唐古特烏頭）150g、角茴香（節(jié)裂角茴香）150g、莪大夏（鐮形棘豆）100g、黑草烏葉（鐵棒錘）100g、石灰華50g、牛黃50g、麝香5g、安息香50g、五靈脂膏（渣馴）50g、白檀香50g、紅花50g。研究表明，翼首草總苷可降低機(jī)體IL-1β、TNF-α、IL-17等水平，其抗炎作用可能阻斷炎癥介質(zhì)的傳遞[12-13]；唐古特烏頭總堿可顯著降低關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清IL-1、TNF-α等水平[14]；細(xì)果角茴香乙醇提取物可減少肺組織炎癥反應(yīng)和炎癥細(xì)胞的浸潤[15]；莪大夏煎液對巨噬細(xì)胞的吞噬功能有促進(jìn)作用，對細(xì)胞免疫具有抑制作用[16]；鐵棒錘烏頭堿的抗炎作用與中樞及炎癥灶內(nèi)前列腺素水平相關(guān)[17]；牛黃能降低急性腦出血后炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6水平，有效干預(yù)炎癥細(xì)胞因子的瀑布效應(yīng)[18]；麝香水溶性蛋白對體液免疫和細(xì)胞免疫有增強(qiáng)作用[19-20]；五靈脂抗炎作用可能與抑制前列腺素E的合成或釋放有關(guān)[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，十二味翼首散可顯著減少LPS誘導(dǎo)ALI大鼠的肺泡腔滲出物，除12H組大鼠動(dòng)脈血pHlt;7.35外，12M組和12L組大鼠動(dòng)脈血pH值均維持在正常（7.35～7.45）范圍內(nèi)（LPS模型組pHlt;7.35）；十二味翼首散升高ALI大鼠PaO2的作用顯著優(yōu)于SHL組；十二味翼首散處理的ALI大鼠BALF中促炎因子TNF-α含量明顯降低；抑炎因子IL-10水平顯著高于LPS組，且十二味翼首散可顯著降低ALI大鼠BALF中中性粒細(xì)胞的數(shù)量及比例，而對外周血、脾臟、肺臟T細(xì)胞和B細(xì)胞及BALF巨噬細(xì)胞滲出無明顯影響。這提示LPS誘導(dǎo)的ALI以中性粒細(xì)胞滲出為主，巨噬細(xì)胞及獲得性免疫細(xì)胞并沒有有效激活，而十二味翼首散可通過降低中性粒細(xì)胞的滲出顯著改善LPS誘導(dǎo)的ALI。

綜上，十二味翼首散可有效改善ALI大鼠的低氧血癥和酸中毒；減輕肺組織滲出，改善肺泡損傷；抑制促炎因子TNF-α、促進(jìn)抑炎因子IL-10的表達(dá)和肺泡中性粒細(xì)胞的滲出，為該藥臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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