SYT7調(diào)控Hedgehog/Gli信號通路對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展的影響

[摘要]"目的"探討人突觸結(jié)合蛋白Ⅶ（synaptotagmin-7，SYT7）通過調(diào)控Hedgehog/Gli信號通路對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展的影響。方法"通過構(gòu)建并轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA（short"hairpin"RNA，shRNA）慢病毒載體，利用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative"reverse"transcriptase-mediated"polymerase"chain"reaction，qRT-PCR）分析SYT7在人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系中的表達(dá)，采用蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR分析U87細(xì)胞中SYT7"shRNA的敲低效率。通過細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞周期分析和動物實驗驗證SYT7在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用。結(jié)果"qRT-PCR分析顯示SYT7在U87細(xì)胞系中的表達(dá)高于正常腦細(xì)胞系。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR分析證實SYT7"shRNA在U87細(xì)胞中的有效敲低。細(xì)胞計數(shù)顯示SYT7"shRNA的表達(dá)通過慢病毒載體下調(diào)SYT7，抑制U87細(xì)胞的生長；流式細(xì)胞術(shù)證實細(xì)胞周期阻滯。此外，基因富集分析和蛋白質(zhì)印跡發(fā)現(xiàn)SYT7通過促進(jìn)p53磷酸化與Hedgehog/Gli信號通路相關(guān)，進(jìn)而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮作用。結(jié)論"SYT7通過調(diào)控Hedgehog/Gli信號通路促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長，因此SYT7可能是治療膠質(zhì)瘤的潛在靶點。

[關(guān)鍵詞]"突觸結(jié)合蛋白Ⅶ；p53；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

[中圖分類號]"R473.73""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.33.004

Effect"of"SYT7"regulation"of"Hedgehog/Gli"signaling"pathway"on"the"progression"of"glioblastoma

XIAO"Bing

Department"of"Neurosurgery，"the"Second"Affiliated"Hospital"of"Nanchang"University，"Nanchang"330006，"Jiangxi，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"effect"of"synaptotagmin-7"（SYT7）"on"the"progression"of"glioblastoma"by"regulating"Hedgehog/Gli"signaling"pathway."Methods"The"expression"of"SYT7"in"U87"cell"line"was"analyzed"by"quantitative"reverse"transcriptase-mediated"polymerase"chain"reaction"（qRT-PCR）"and"transfection"with"short"hairpin"RNA"（shRNA）"lentiviral"vector."Western"blotting"and"qRT-PCR"were"used"to"analyze"the"knockdown"efficiency"of"SYT7"shRNA"in"U87"cells."Cell"counting，"cell"cycle"analysis，"and"animal"studies"confirm"the"role"in"glioblastoma."Results"qRT-PCR"analysis"showed"that"the"expression"of"SYT7"in"U87"cell"line"was"higher"than"human"normal"glial"cell"line."Western"blotting"and"qRT-PCR"analysis"showed"low"knockdown"efficiency"of"SYT7"shRNA"in"U87"cells."Cell"counts"showed"that"the"lentiviral"vector"expressing"SYT7"shRNA"down-regulated"SYT7"and"inhibited"the"growth"of"U87"cells."Flow"cytometry"confirmed"cell"cycle"block，"gene"enrichment"analysis"and"Western"blotting"revealed"that"SYT7"was"associated"with"Hedgehog/Gli"signaling"pathway"by"promoting"p53"phosphorylation."It"was"further"demonstrated"in"glioblastoma"by"animal"experiments."Conclusion"The"results"of"this"study"suggest"that"SYT7"promotes"glioblastoma"growth"by"regulating"the"Hedgehog/Gli"signaling"pathway，"so"SYT7"may"be"a"potential"therapeutic"target"for"glioma.

[Key"words]"Synaptotagmin-7;"p53;"Glioblastoma

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其整體預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率較高[1]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的確切發(fā)病機制尚不清楚[2]。人突觸結(jié)合蛋白Ⅶ（synaptotagmin-7，SYT7）是突觸結(jié)合蛋白（synaptotagmin，SYT）家族中的一員，該家族包含17個亞型，是細(xì)胞分泌過程中鈣信號通路的受體，參與鈣依賴性跨膜轉(zhuǎn)運[3-5]。研究表明SYT7可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、凋亡、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和胺類生物合成，參與溶酶體介導(dǎo)的修復(fù)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。SYT7作為溶酶體分泌的細(xì)胞外激活劑，與多種疾病相關(guān)，包括自身免疫性肌炎、糖尿病、炎癥性關(guān)節(jié)炎、肺纖維化等。

研究顯示Hedgehog/Gli信號通路與皮膚基底細(xì)胞癌、胃腸道腫瘤、前列腺癌、胰腺癌和肺癌的形成有關(guān)[7]。該信號通路由靶細(xì)胞膜上的兩個受體Patched和Smoothened控制[8]。核轉(zhuǎn)錄因子Gli在這一通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。Gli有3個同源基因，分別編碼Gli1、Gli2和Gli3。其中，Gli1因其與膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)且被首次命名[10]。隨著Hedgehog信號通路的激活，Gli1相關(guān)的下游靶基因（如n-myc、CyclinD1、Foxm1、bcl-2）的表達(dá)發(fā)生變化，從而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[11]。

p53作為腫瘤抑制基因在抑制膠質(zhì)瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[12]。P53蛋白可防止細(xì)胞癌變，維持基因組穩(wěn)定，避免突變。研究表明p53與Gli1密切相關(guān)，p53通過調(diào)節(jié)Gli1蛋白水平抑制Gli1活性[13]。筆者推測SYT7通過調(diào)控p53介導(dǎo)的Hedgehog/Gli信號通路參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展，p53可能是SYT7調(diào)控Hedgehog/Gli信號通路的關(guān)鍵橋梁。為驗證這一推測結(jié)果進(jìn)行本研究，并報道如下。

1""材料與方法

1.1""材料和試劑

DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自武漢賽維爾公司；SYT7基因陰性對照（5′-TCACCGTGAAGATCATGAA-3′）購自上?；蚧瘜W(xué)有限公司；定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative"reverse"transcriptase-mediated"polymerase"chain"reaction，qRT-PCR）檢測試劑盒購自日本Takara公司；SYT7引物購自上海基因化學(xué)有限公司；U87細(xì)胞系和正常腦細(xì)胞系為本實驗室保有。4周齡雄性SCID小鼠購自北京維通利華生物科技有限公司，飼養(yǎng)于SPF級實驗動物中心。動物實驗符合3R原則，經(jīng)南昌大學(xué)批準(zhǔn)許可[許可證號：SYXK（贛）2021-0004]。本研究經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過（倫理審批號：NCULAE-20221031035）。

1.2""細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞于37℃、5%"CO2條件下進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3""RNA提取和qRT-PCR分析

使用短發(fā)夾RNA（short"hairpin"RNA，shRNA）轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞48h，用TRIzol（賽默飛世爾科技）試劑提取總RNA。使用qRT-PCR檢測試劑盒按說明書要求檢測SYT7"mRNA表達(dá)水平。SYT7的定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative"PCR，qPCR）采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate"dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參。SYT7正向引物：5′‐ACTCCATCATCG"TGAACATCATC‐3′，反向引物：5′‐TCGAAGGCGA"AGGACTCATTG‐3′；GAPDH正向引物：5'-TGACTT"CAACAGCGACACCA-"3'；反向引物：5'-CACCCTGT"TGCTGTAGCCAAA-3'。采用生物系統(tǒng)7300熒光定量PCR系統(tǒng)，qPCR分析采用Takara"Bio公司的SYBR"PrimeScript"qPCR試劑盒。反應(yīng)混合物在95?C條件下孵育30s，在95?C條件下擴增45次，擴增時間分別為5s，60?C條件下擴增30s，72?C條件下擴增60s，72?C條件下擴增7min。通過2–ΔΔCq方法計算SYT7"mRNA的相對表達(dá)量，用GAPDH"mRNA表達(dá)量進(jìn)行歸一化[14]。

1.4""shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

表達(dá)shRNA的慢病毒和SYT7基因陰性對照（5′-TCACCGTGAAGATCATGAA-3′）購自上?；蚧瘜W(xué)有限公司。將以上shRNA克隆到具有AgeI/EcoRI位點的pgcsil-綠色熒光慢病毒載體中，獲得重組慢病毒shRNA的表達(dá)載體。將U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于6孔板中，每孔種植4×105個細(xì)胞。用shSYT7慢病毒（4×108TU/ml×2.5μl）或陰性對照（8×108TU/ml×1.25μl）感染6孔板細(xì)胞，分為shSYT7組和對照組。感染后5d采用qPCR檢測shRNA-SYT7載體的敲除效率。

1.5""細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染48h后，用胰蛋白酶消化U87細(xì)胞，以5×103個/孔的密度接種于12孔板。shSYT7組和對照組在顯微鏡下計數(shù)5d。

1.6""蛋白質(zhì)印跡分析

轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，在Beyotime緩沖液中裂解30min，用二氫二酸蛋白檢測試劑盒提取細(xì)胞蛋白。離心后進(jìn)行上清電泳。將樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜密封1h。一抗為小鼠抗syt7、小鼠抗p53、小鼠抗p-p53和抗GAPDH抗體，4℃過夜。以山羊抗小鼠免疫球蛋白G偶聯(lián)辣根過氧化物酶為二抗，1∶2000稀釋，室溫作用2h。增強化學(xué)發(fā)光和蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)檢測結(jié)合抗體。GAPDH為內(nèi)參。

1.7""細(xì)胞周期分析

采用2ml–20°C預(yù)冷的70%乙醇收集細(xì)胞，重懸，在–20°C下固定過夜。離心后丟棄上清液，加入1ml預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate"buffered"saline，PBS）重懸細(xì)胞沉淀，37℃孵育30min。在細(xì)胞懸液中加入1∶20"1mg/ml的碘化丙啶儲存液，在37℃黑暗中孵育30min。使用BD"FACSCalibur流式細(xì)胞儀（Becton，Dickinson"Bioscience）。FlowJo軟件分析DNA倍性和細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞周期分布。

1.8""動物實驗

將4周齡雄性SCID小鼠腹腔皮下注射與基質(zhì)膠混合的3×106"U87細(xì)胞（shSYT7組和對照組）。將20只小鼠在恒濕（40%～70%）、恒溫[（21±2）℃]條件下飼養(yǎng)，在特定的無菌設(shè)施中自由攝食和飲水。研究結(jié)束后2周用卡尺測量腫瘤大小。所有數(shù)據(jù)按公式v=0.5×a×b2（v為腫瘤體積；a為腫瘤長徑；b為腫瘤寬徑）計算體積。實驗結(jié)束后處死小鼠或在腫瘤直徑達(dá)到15mm時取腫瘤組織進(jìn)一步檢查。部分腫瘤組織石蠟包埋切片。

1.9""免疫組織化學(xué)

首先對腫瘤組織切片進(jìn)行脫蠟處理，切片組織置于烤箱。對切片進(jìn)行常規(guī)二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水：順序為二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ15min，無水乙醇Ⅰ15min，無水乙醇Ⅱ15min，95%乙醇15min，80%乙醇15min，蒸餾水中15min，1×PBS洗滌5min，3次?？乖迯?fù)：將切片置于0.01mol/L枸櫞酸緩沖液（pH"6.0）中，煮沸（95℃，15～20min），待其自然冷卻至室溫，1×PBS洗滌5min，共3次。在組織切片上滴加10%山羊血清封閉液，37℃下孵育30min，倒去封閉液。滴加一抗：一抗稀釋液對一抗稀釋后滴加在切片上，4℃過夜，1×PBS洗滌5min，3次。在37℃下孵育30～60min，1×PBS洗滌5min，3次。組織切片上滴加Ⅲ抗（辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液），在37℃下孵育30min，1×PBS洗滌5min，3次。滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液（新鮮配制），遵循現(xiàn)用現(xiàn)配原則。以水沖洗組織切片，應(yīng)用蘇木精進(jìn)行復(fù)染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，使用中性樹膠進(jìn)行封片，37℃下干燥，顯微鏡觀察并拍照。

1.10""統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS"21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用c2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""SYT7在U87細(xì)胞中表達(dá)情況及shSYT7在U87細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率

通過RT-qPCR評估SYT7"mRNA的表達(dá)水平，見圖1A。與正常腦細(xì)胞（HEB）比較，在U87細(xì)胞中SYT7"mRNA的表達(dá)水平顯著升高。用shSYT7敲低SYT7，通過RT-qPCR評估SYT7"mRNA的表達(dá)水平，見圖1B。與對照組比較，shSYT7可顯著降低SYT7"mRNA的表達(dá)水平。

2.2""下調(diào)SYT7可抑制細(xì)胞增殖

細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，與對照組比較，shSYT7對U87細(xì)胞生長有抑制作用（Plt;0.05），見圖2。

2.3""SYT7敲低組U87細(xì)胞進(jìn)程阻滯在G0/G1期

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組比較，shSYT7將U87細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，見圖3。

2.4""SYT7與Hedgehog/Gli信號通路密切相關(guān)

基因富集結(jié)果顯示SYT7與膠質(zhì)瘤的Hedgehog/"Gli信號通路密切相關(guān)，見圖4，蛋白質(zhì)印跡顯示抑制SYT7可促進(jìn)p53磷酸化，導(dǎo)致P53蛋白聚集，Gli1蛋白也受到抑制，見圖5。

2.5""SYT7的下調(diào)抑制腫瘤生長

對SCID小鼠進(jìn)行異種移植試驗。在U87細(xì)胞系中，shSYT7在整個實驗過程中均可減緩腫瘤的生長，SYT7敲低組小鼠的腫瘤大小明顯小于對照組，見圖6A；腫瘤體積明顯小于對照組，見圖6B；腫瘤質(zhì)量明顯小于對照組，見圖6C。Ki-67免疫組化顯示，對照組小鼠的Ki-67表達(dá)更高，見圖6D。

3""討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在中國的年發(fā)病率為（3～6）例/10萬人[15]。目前，基于神經(jīng)外科、放療、腫瘤學(xué)的影像、病理相結(jié)合的多學(xué)科綜合診療模式已應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的治療，但整體治療效果較差，靶向生物治療給患者帶來新的希望。尋找新的治療靶點，探索膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制具有十分重要的意義。生物靶向治療的前提和關(guān)鍵是靶點選擇。目前腫瘤血管生成、免疫檢查點、癌基因等生物治療靶點已取得很大進(jìn)展，相應(yīng)的靶向藥物已用于臨床治療[16-25]。但大多數(shù)腫瘤具有異質(zhì)性特征，導(dǎo)致同一藥物靶點在不同類型的腫瘤或不同患者中存在較大差異。因此，探索腫瘤發(fā)病的分子機制是目前治療膠質(zhì)瘤的最佳途徑。

本研究結(jié)果顯示SYT7通過調(diào)節(jié)Hedgehog/Gli信號通路促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長；檢測SYT7在U87細(xì)胞系中的表達(dá)水平，但僅檢測mRNA的表達(dá)，SYT7在腫瘤樣本中的表達(dá)情況仍需進(jìn)一步研究。蛋白質(zhì)印跡和qPCR結(jié)果顯示，shSYT7可有效抑制SYT7蛋白水平，并在U87MG細(xì)胞中發(fā)揮作用。細(xì)胞計數(shù)實驗表明，shSYT7顯著抑制U87MG細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，shSYT7使U87細(xì)胞周期停滯在G0/G1期。本研究發(fā)現(xiàn)SYT7通過調(diào)節(jié)Hedgehog/Gli信號通路促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長。SYT7的抑制可促進(jìn)p53的磷酸化，導(dǎo)致P53蛋白積累，同時抑制Gli1蛋白的表達(dá)，這表明SYT7通過促進(jìn)p53的磷酸化與Hedgehog/Gli信號通路相關(guān)。在SCID小鼠的異種移植實驗中，shSYT7可顯著減緩腫瘤的生長，SYT7敲低組小鼠的腫瘤大小、體積明顯小于對照組，Ki-67免疫組化結(jié)果與前期實驗一致，表明shSYT7可抑制異種移植物中U87細(xì)胞的增殖。以上結(jié)果表明下調(diào)SYT7在體內(nèi)可抑制腫瘤的生長。然而，本研究結(jié)論僅基于單個細(xì)胞系，需要體外和體內(nèi)實驗進(jìn)一步確定SYT7的生物學(xué)作用。

綜上所述，SYT7通過調(diào)節(jié)Hedgehog/Gli信號通路促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長，SYT7可能是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤新的治療靶點。SYT7在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用機制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：作者聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–03–29）

（修回日期：2024–11–21）