聚合抗稻瘟病基因Pia和抗白葉枯病基因Xa23的廣親和恢復(fù)系選育

摘要：為獲得抗白葉枯病和稻瘟病的水稻恢復(fù)系材料，選擇攜帶抗白葉枯病基因Xa23的抗病品系RF76及攜帶抗稻瘟病基因Pia的甬優(yōu)1540（F1）為供體材料，與多個優(yōu)良雜交水稻恢復(fù)系進(jìn)行多代雜交和回交，在分離群體中利用分子標(biāo)記輔助選擇和田間表型鑒定選擇相結(jié)合的方法，獲得70份農(nóng)藝性狀穩(wěn)定且導(dǎo)入Pia、Xa23、Pia+Xa23目標(biāo)基因的水稻恢復(fù)系。采用白葉枯病鑒別菌系P6對230份重點株系及其雜交組合進(jìn)行抗性鑒定，所有材料在孕穗期都表現(xiàn)為抗白葉枯病。稻瘟病抗性鑒定結(jié)果表明，含Pia基因的恢復(fù)系及其配組的雜交稻組合稻瘟病抗性優(yōu)于親本材料RF76，均表現(xiàn)為中抗及以上。以此恢復(fù)系配置的雜交組合“華浙優(yōu)2473”參加浙江省單季秈稻雜交稻區(qū)試及生產(chǎn)試驗，農(nóng)藝性狀表現(xiàn)良好，2年抗性鑒定結(jié)果顯示，稻瘟病和白葉枯病抗性均達(dá)到中抗以上。試驗結(jié)果表明，Pia和Xa23的導(dǎo)入，結(jié)合連續(xù)抗病試驗的篩選，獲得抗稻瘟病和白葉枯病的恢復(fù)系材料，將其用于配組雜交稻組合，在生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：水稻；分子標(biāo)記；白葉枯??；稻瘟病；Pia基因；Xa23基因

中圖分類號：S435.111.4+1；S435.111.4+7文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）11-0111-05

稻瘟病、白葉枯病是影響我國水稻生產(chǎn)的主要病害，每年都會發(fā)生不同程度的危害，在病害流行年份會導(dǎo)致水稻嚴(yán)重減產(chǎn)。稻瘟病是由稻瘟病菌引起的，發(fā)病嚴(yán)重時可導(dǎo)致50%以上減產(chǎn)，甚至造成部分區(qū)域絕產(chǎn)［1］。白葉枯病由水稻黃單胞桿菌水稻致病變種引起，在流行年份，發(fā)病地區(qū)一般減產(chǎn)20％～30％，嚴(yán)重的可達(dá)80％［2］。20世紀(jì)80—90年代，浙江省水稻白葉枯病發(fā)生較重，沉寂了近20年后，2014年發(fā)病又呈上升趨勢。2014—2016年，浙江省晚稻在生育后期發(fā)病點多、面廣，溫州、臺州、寧波、紹興、金華、麗水、衢州等地均有發(fā)生，局部呈現(xiàn)快速擴(kuò)散蔓延之勢。據(jù)統(tǒng)計，全省2020年發(fā)病面積1.67萬hm2，2021年達(dá)到3.27萬hm2以上，個別地區(qū)危害尤其嚴(yán)重，臺州、金華、衢州等地已出現(xiàn)發(fā)病晚稻連片絕收現(xiàn)象，防控形勢十分嚴(yán)峻，對全省水稻安全生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

培育和推廣具有多種抗性的水稻品種是最經(jīng)濟(jì)、有效、安全的病蟲害防治途徑［3］。近年來，關(guān)于水稻抗性基因的研究日益增多，截至目前，500多個數(shù)量性狀和100多個稻瘟病抗性基因已被鑒定出，38個抗病R基因被成功克隆，并且在稻瘟病抗性遺傳育種方面取得了巨大進(jìn)展［4］。

Pia是日本水稻品種（愛知旭）所含有的抗病基因，先前研究表明，Pia的抗譜較窄，抗性效果較弱［5］。但研究表明，一些抗性效果較弱的抗病基因與其他抗病基因聚合在一起，可發(fā)揮重要的作用［6］。Okuyama等的研究進(jìn)一步解釋了Pia基因的抗稻瘟病功能，是Pia內(nèi)的SasRGA4和SasRGA5 2個基因長期平衡選擇的結(jié)果［7］。因此筆者所在課題組以Pia為靶基因，結(jié)合稻瘟病表型鑒定，篩選出聚合Pia抗病基因的材料。

目前已鑒定出42個抗白葉枯病基因［8］。Xa23基因在全生育期具有抗性廣譜、高抗性且抗性轉(zhuǎn)移效應(yīng)強等特點，由章琦等于普通野生稻中鑒定而來，后育成了含Xa23近等基因系的CBB23［9］。基于CBB23開發(fā)的標(biāo)記已被應(yīng)用于水稻輔助選擇育種工作中，在水稻抗白葉枯病分子育種中有著廣闊的應(yīng)用前景［10-12］。本研究利用水稻抗白葉枯病中間材料RF76對廣親和恢復(fù)系進(jìn)行抗性改良，以期通過回交轉(zhuǎn)育技術(shù)和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)得到具有白葉枯病抗性基因Xa23的雜交水稻新恢復(fù)系。通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)聚合多個抗病基因，培育抗性強的水稻新品種（組合），以期提高水稻綜合抗性水平。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供體親本：水稻抗白葉枯病中間材料RF76（含Xa23）。受體親本：廣親和恢復(fù)系甬優(yōu)1540（F1）。鑒定菌系：浙江省稻瘟病優(yōu)勢小種和水稻白葉枯病鑒別菌系P6，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所提供。

Pia基因采用GFM標(biāo)記進(jìn)行檢測，正反引物序列分別為Pia-1F：5′-GCGACTGACACTTTCAATAGC-3′；Pia-1R：5′-CGGTAGAGCAATTTAGAAGCAG-3′［13］。

Xa23基因采用連鎖標(biāo)記RM206進(jìn)行檢測，正反引物序列分別為RM206-F：CCCATGCGTTTAACTATTCT；RM206-R：CGTTCCATCGATCCGTATGG［14］。

1.2 試驗方法

1.2.1 PCR 檢測

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法［15］提取DNA。PCR反應(yīng)體系：20 μL反應(yīng)體積中包括2×PCR Mix 10 μL，10 μmol/L的正反引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL，其余為ddH2O。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取6 μL PCR產(chǎn)物，采用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察、采集圖像。

1.2.2 田間接種鑒定

在水稻3葉1心期，采用噴霧式接種法進(jìn)行稻瘟病接種，接種后保溫保濕7 d，調(diào)查發(fā)病情況；在水稻孕穗期采用人工剪葉法接種白葉枯?。河眉舻墩喝【汉蠹羧ゼs2 cm劍葉，每株剪4～5張葉片，接種后20 d調(diào)查發(fā)病情況，記載標(biāo)準(zhǔn)［16］見表1。

1.2.3 恢復(fù)系基因?qū)?/p>

2016年秋在嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗基地用含Xa23基因的自選中間材料RF76與含Pia基因的材料甬優(yōu)1540（F1代）以及多個優(yōu)良雜交水稻恢復(fù)系進(jìn)行雜交、 復(fù)交及回交。成熟后將收獲的雜交種（F1代）于冬季帶至海南進(jìn)行加代，同時利用抗性基因Pia的GFM標(biāo)記、Xa23基因的RM206標(biāo)記對植株進(jìn)行初步篩選，結(jié)合田間接種結(jié)果選擇抗病植株混收（F2代種子），曬干后種植F2代，再根據(jù)檢測及接種結(jié)果從F2代群體中遴選到32個株系，經(jīng)品質(zhì)鑒定后保留13個株系（F3代）在冬季帶至海南進(jìn)行加代；從其中5個系中遴選到21個株系，經(jīng)抗性、品質(zhì)鑒定保留其中9個株系（F4代）于嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗基地夏季種植，經(jīng)過擇優(yōu)篩選到35個株系（F5代），擇優(yōu)16個株系繼續(xù)加代，此后每一代都進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇及抗性鑒定，篩選出70份農(nóng)藝性狀穩(wěn)定且含有Pia、Xa23、Pia+Xa23目標(biāo)基因的水稻恢復(fù)系。以白葉枯病鑒別菌系P6對230份重點株系及其雜交組合進(jìn)行抗性鑒定，所有材料在孕穗期都表現(xiàn)為抗白葉枯病。從F5代中優(yōu)選出一系列生長較整齊且豐產(chǎn)性好的株系與多個不育系制種測配，同時對該株系繼續(xù)加代提純，選擇優(yōu)良株系進(jìn)行小面積制種。于2020年秋定名TF473的恢復(fù)系，與華浙2A所配組合定名為華浙優(yōu)2473，2年抗性鑒定稻瘟病和白葉枯病抗性均達(dá)到中抗以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性基因分子標(biāo)記在抗感親本間的多態(tài)性分析

利用與稻瘟病抗性基因Pia連鎖的GFM標(biāo)記、與白葉枯病抗性基因Xa23連鎖的RM206標(biāo)記對不育系華浙2A、攜帶抗白葉枯病基因Xa23的恢復(fù)系供體親本RF76、攜帶抗稻瘟病基因Pia的恢復(fù)系供體親本甬優(yōu)1540（F1代）及部分中間選育材料進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果（圖1）顯示，Pia基因的GFM標(biāo)記在不育系華浙2A和Pia供體親本甬優(yōu)1540（F1代）中擴(kuò)增出約150 bp的片段，而在RF76中擴(kuò)增出約190 bp的片段，說明RF76中不含Pia基因?；騒a23的RM206標(biāo)記在Xa23供體親本RF76中擴(kuò)增出約120 bp的片段，而在受體材料甬優(yōu)1540（F1代）和不育系華浙2A中擴(kuò)增出約170 bp的片段，說明甬優(yōu)1540（F1代）和不育系華浙2A均不含Xa23基因。Pia基因的GFM標(biāo)記和Xa23基因的RM206連鎖標(biāo)記在互為供受體的RF76與甬優(yōu)1540（F1代）間都具有明顯的多態(tài)性。

2.2 材料的抗性基因分子改良系創(chuàng)制

將含有Pia基因的親本甬優(yōu)1540（F1代）、含有Xa23基因的親本RF76分別與多個優(yōu)良雜交水稻恢復(fù)系進(jìn)行雜交，并對F1代植株進(jìn)行復(fù)交，聚合Pia和Xa23。利用抗性基因Pia和Xa23的基因標(biāo)記對F2代植株進(jìn)行檢測，選擇擴(kuò)增出目的條帶且性狀優(yōu)良的植株，種植成F3，此后每一代都結(jié)合接種鑒定結(jié)果及分子標(biāo)記進(jìn)行選擇，直至得到純合的抗病品系。圖2為高世代材料的分子檢測結(jié)果。從圖2可以看出，經(jīng)過幾代轉(zhuǎn)育，高世代材料基本都攜帶有抗病基因。經(jīng)過配組得到一系列優(yōu)良的聚合Xa23和Pia基因的恢復(fù)系材料。

2.3 恢復(fù)系及雜交組合的抗病性檢測

苗期稻瘟病接種鑒定結(jié)果（表2）表明，Pia受體親本材料RF76對浙江的優(yōu)勢小種菌株表現(xiàn)為感病，而Pia供體親本甬優(yōu)1540（F1代）表現(xiàn)為抗?。话ɑ謴?fù)系TF465（R10）和TF473（R11）在內(nèi)的11個穩(wěn)定材料對浙江省的優(yōu)勢小種菌株均表現(xiàn)為抗性，綜合抗性評價為抗病，表明Pia可用于該地區(qū)的稻瘟病抗性改良。對用恢復(fù)系TF465和TF473配組的雜交稻組合浙禾優(yōu)165、浙禾優(yōu)256、浙禾優(yōu)365、華浙優(yōu)2473進(jìn)行接種鑒定，綜合抗性評價為抗病。

以白葉枯病鑒別菌系P6對重點株系及其雜交組合進(jìn)行抗性鑒定，結(jié)果（表3）表明，除對照甬優(yōu)1540（F1代）及未檢測出Xa23基因的材料R9外，所有材料在孕穗期都表現(xiàn)抗白葉枯病。本研究利用Xa23基因通過回交轉(zhuǎn)育技術(shù)和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對雜交水稻的骨干恢復(fù)系進(jìn)行遺傳改良，得到具有白葉枯病抗性基因Xa23的雜交水稻新恢復(fù)系及雜交組合，并通過田間鑒定進(jìn)一步驗證了標(biāo)記RM206檢測的準(zhǔn)確性。

3 討論與結(jié)論

培育推廣抗性品種是水稻病蟲害防治最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、有效的措施。聚合多個抗病基因是水稻持久抗病的最有效方法［17］。研究表明，具有單一抗性基因的株系與同時含有2個抗性基因的抗性水平相當(dāng)且農(nóng)藝性狀與受體材料相比差異不顯著［18］。分子標(biāo)記輔助育種能夠從基因?qū)用孢M(jìn)行直接選擇，是實現(xiàn)多個優(yōu)良性狀高效聚合的最佳手段之一［19］。潘曉飚等利用分子標(biāo)記輔助選擇和田間鑒定選擇相結(jié)合的方法，獲得5個聚合抗稻瘟病基因及白葉枯病基因的改良系，對比試驗效果顯著［20］。倪大虎通過基因聚合復(fù)交，得到4個聚合Pi9、Xa21及Xa23 3個基因的株系，F(xiàn)2代群體分子標(biāo)記輔助選擇準(zhǔn)確率高達(dá)98%［21］。本研究選擇攜帶抗白葉枯病基因Xa23的抗病品系RF76及攜帶抗稻瘟病基因Pia的甬優(yōu)1540（F1代）為供體材料，與多個優(yōu)良雜交水稻恢復(fù)系進(jìn)行多代雜交和回交，采用分子標(biāo)記結(jié)合人工接種等鑒定方法快速聚合多個抗病基因，結(jié)果表明，聚合Xa23和Pia的恢復(fù)系及配組的雜交組合，對浙江省的稻瘟病、白葉枯病優(yōu)勢小種均有較好的綜合抗性水平。

近年來，Pia基因的GFM標(biāo)記以及Xa23基因的連鎖標(biāo)記RM206已成功運用到水稻的遺傳改良中，為本研究奠定了豐厚的基礎(chǔ)［13-14］。本研究中Pia基因的GFM標(biāo)記和Xa23基因的RM206連鎖標(biāo)記在互為供受體的RF76與甬優(yōu)1540（F1代）間都具有明顯的多態(tài)性，通過分子標(biāo)記輔助選擇，篩選攜帶抗病基因的材料，經(jīng)田間接種鑒定，結(jié)果高度一致。從而得到抗稻瘟病、白葉枯病的雜交稻新組合，并通過審定。進(jìn)一步驗證了Pia基因的GFM標(biāo)記以及Xa23基因的連鎖標(biāo)記RM206選擇基因的適用性和準(zhǔn)確性。

經(jīng)過改良的恢復(fù)系與多個不育系進(jìn)行測配，雜交組合對稻瘟病和白葉枯病均有較好的綜合抗性水平。多個組合已參加各級區(qū)試及生產(chǎn)試驗，其中華浙優(yōu)2473通過了浙江省審定，該組合抗白葉枯病、抗稻瘟病并且產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)，在白葉枯病、稻瘟病頻繁高發(fā)的當(dāng)下具有較好的發(fā)展前景。

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