CircACAP2靶向miR-29a-3p/CCNT2軸對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響

摘要目的：探討CircACAP2靶向miR-29a-3p/細(xì)胞周期蛋白T2（CCNT2）軸對缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響。方法：將H9c2細(xì)胞分為Control組（正常培養(yǎng)）、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、Model組（建立H/R模型）、si-CircACAP2組（轉(zhuǎn)染si-CircACAP2）、si-CircACAP2＋inhibitor-NC組（si-CircACAP2和inhibitor-NC共轉(zhuǎn)染）、si-CircACAP2＋miR-29a-3p inhibitor組（si-CircACAP2和miR-29a-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染）；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測H9c2細(xì)胞中CircACAP2、miR-29a-3p的表達水平；四唑鹽（MTT）法檢測H9c2細(xì)胞活力；流式細(xì)胞儀檢測H9c2細(xì)胞凋亡；單丹磺酰尸胺（MDC）染色法檢測H9c2細(xì)胞自噬；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒檢測H9c2細(xì)胞上清中LDH、MDA、SOD水平，DCFH-DA熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平；蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、細(xì)胞凋亡蛋白［B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）］、自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、P62）及CCNT2的表達；雙熒光素酶報告檢測CircACAP2對miR-29a-3p的靶向關(guān)系和miR-29a-3p對CCNT2的靶向關(guān)系。結(jié)果：與Control組比較，Model組H9c2細(xì)胞中CircACAP2表達、凋亡率、自噬囊泡數(shù)、LDH釋放率、MDA、ROS水平、Bax、Beclin-1、CCNT2蛋白表達升高，miR-29a-3p表達、OD490值、SOD活性、PCNA、Bcl-2、P62蛋白表達降低（P＜0.05）；與Model組比較，si-CircACAP2組H9c2細(xì)胞中CircACAP2表達、凋亡率、自噬囊泡數(shù)、LDH釋放率、MDA、ROS水平、Bax、Beclin-1、CCNT2蛋白表達降低，miR-29a-3p表達、OD490值、SOD活性、PCNA、Bcl-2、P62蛋白表達升高（P＜0.05）；與si-CircACAP2組比較，si-CircACAP2＋miR-29a-3p inhibitor組H9c2細(xì)胞中CircACAP2表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），凋亡率、自噬囊泡數(shù)、LDH釋放率、MDA、ROS水平、Bax、Beclin-1、CCNT2蛋白表達升高，miR-29a-3p表達、OD490值、SOD活性、PCNA、Bcl-2、P62蛋白表達降低（P＜0.05）；CircACAP2靶向調(diào)控miR-29a-3p的表達，miR-29a-3p靶向負(fù)調(diào)控CCNT2的表達。結(jié)論：敲低CircACAP2可能通過靶向miR-29a-3p來下調(diào)CCNT2表達，進而抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡、自噬能力及氧化應(yīng)激，促進細(xì)胞增殖，發(fā)揮保護作用。

關(guān)鍵詞缺氧/復(fù)氧；CircACAP2；miR-29a-3p/細(xì)胞周期蛋白T2軸；心肌細(xì)胞；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.17.009

Effect of CircACAP2 Targeting miR-29a-3p/CCNT2 Axis on Hypoxia/Reoxygenation Induced Cardiomyocyte Injury

QU Miao， GUAN Xin

Baoji Central Hospital， Baoji 721000， Shaanxi， China

Corresponding AuthorGUAN Xin， E-mail： meipak06@163.com

AbstractObjective：To investigate the effect of CircACAP2 targeting miR-29a-3p/cyclin T2（CCNT2） axis on hypoxia/reoxygenation（H/R） induced cardiomyocyte injury.Methods：H9c2 cells were divided into Control group（normal culture），si-NC group（transfected with si-NC），Model group（established H/R model），si-CircACAP2 group（transfected with si-CircACAP2），si-CircACAP2＋inhibitor-NC group（si-CircACAP2 and inhibitor-NC co-transfection），si-CircACAP2＋miR-29a-3p inhibitor group（si-CircACAP2 and miR-29a-3p inhibitor co-transfection）.The expression levels of CircACAP2 and miR-29a-3p，cell viability and apoptosis of H9c2 cells were detected.H9c2 autophagy，lactate dehydrogenase（LDH），malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD），reactive oxygen species（ROS） levels and expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA），B-cell lymphoma/leukemia-2（Bcl-2），Bcl-2 associated X protein（Bax），Beclin-1，P62 CCNT2 were dected.The targeting relationship of CircACAP2 to miR-29a-3p and the targeting relationship of miR-29a-3p to CCNT2 were detected.Results：Compared with the Control group，the expression of CircACAP2，apoptosis rate，number of autophagy vesicles，LDH release rate，MDA，ROS levels and Bax，Beclin-1，CCNT2 protein increased in H9c2 cells in Model group，the expression of miR-29a-3p，OD490 value，SOD activity，PCNA，Bcl-2 and P62 protein expression decreased（P＜0.05）.Compared with Model group，CircACAP2 expression，apoptosis rate，number of autophagy vesicles，LDH release rate，MDA，ROS levels，Bax，Beclin-1 and CCNT2 protein expression in H9c2 cells of si-CircACAP2 group decreased，miR-29a-3p expression，OD490 value，SOD activity，PCNA，Bcl-2，P62 protein expression increased（P＜0.05）.Compared with si-CircACAP2 group，there was no statistically significant difference in CircACAP2 expression in H9c2 cells of si-CircACAP2＋miR-29a-3p inhibitor group（P＞0.05），apoptosis rate，number of autophagy vesicles，LDH release rate，MDA，ROS levels and Bax，Beclin-1，CCNT2 protein expression increased，and miR-29a-3p expression，OD490 value，SOD activity，PCNA，Bcl-2，P62 protein expression decreased（P＜0.05）.CircACAP2 targeted the expression of miR-29a-3p，and miR-29a-3p negatively regulated the expression of CCNT2.Conclusion：Knockdown of CircACAP2 may down-regulate CCNT2 expression by targeting miR-29a-3p，thereby inhibiting H/R-induced apoptosis，autophagy and oxidative stress of H9c2 cells，promoting cell proliferation and playing a protective role.

Keywords anoxia/reoxygenation; CircACAP2; miR-29a-3p/cyclin T2 axis; myocardial cells; experimental study

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種常見的心血管疾病，血流的再灌注和恢復(fù)是其主要治療策略，但可能導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）的發(fā)生［1-2］。深入了解MIRI的發(fā)生機制有助于開發(fā)新的預(yù)防MIRI的策略。研究表明，環(huán)狀RNA（circular RNA，CircRNA）參與心肌細(xì)胞的增殖［3］、凋亡［4］、自噬［5］等過程，對MIRI的生物學(xué)進程具有調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，CircACAP2在心肌梗死病人中高表達，并通過促進miR-532表達，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡［6］。微小RNA（microRNA，miRNA）是MIRI發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子，參與MIRI的進展。在缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中，miR-19b-3p通過下調(diào)磷酸酶基因（PTEN）加速細(xì)胞凋亡［7］。miR-27a表達在缺血/再灌注（I/R）和H/R的心肌細(xì)胞中顯著上調(diào)，并通過靶向調(diào)節(jié)ATP酶家族含有AAA結(jié)構(gòu)域的蛋白3A（ATAD3a）調(diào)節(jié)MIRI［8］。miR-29a-3p在MIRI大鼠和H/R處理的心肌細(xì)胞和心肌組織中下調(diào)，而細(xì)胞周期蛋白T2（cyclin T2，CCNT2）上調(diào)，上調(diào)miR-29a-3p通過靶向調(diào)控CCNT2，從而抑制乳酸脫氫酶（LDH）活性、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞增殖，減弱MIRI損傷［9］。而CircACAP2通過調(diào)節(jié)miR-29a-3p/CCNT2軸對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響尚不清楚，使用Starbase網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CircACAP2與miR-29a-3p、miR-29a-3p和CCNT2存在結(jié)合位點。因此，本研究主要探究CircACAP2對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響以及其分子機制，以期為MIRI的治療提供新的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自美國ATCC細(xì)胞庫。

1.2主要試劑

杜爾伯科改良伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基（貨號：M0108B）購于上海盈灣生物科技有限公司；RNA提取試劑盒（貨號：SH-2366）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：SOS-1046）、自噬小泡檢測試劑盒-單丹磺酰尸胺（MDC）染色法（貨號：SH-1508）、細(xì)胞蛋白提取試劑盒（貨號：SH-2473）購于北京凱詩源生物科技有限公司；四唑鹽（MTT）試劑盒（貨號：MH1001）購于江蘇麥格生物科技有限公司；LDH（貨號：EY-23376）、丙二醛（malondialdehyde，MDA，貨號：EY-23390）、超氧化物歧化酶試劑盒（superoxide dismutase，SOD，貨號：EY-23253）檢測試劑盒購于上海一研生物科技有限公司；SYBR green qPCR試劑盒（貨號：021-200次×50 μL）、DCFH-DA活性氧（reactive oxygen species，ROS，貨號：D6470）熒光探針購于北京索萊寶科技有限公司；兔源一抗增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA，貨號：ab15498-PCNA）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax，貨號：ab182733）、B細(xì)胞淋巴瘤蛋白2（B cell lymphoma protein2，Bcl-2，貨號：ab203516）、芐氯素1蛋白（Beclin-1，貨號：ab82010）、選擇性自噬接頭蛋白1（sequestosome-1，SQSTM1/P62，貨號：ab30692）、CCNT2（貨號：ab34912）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，貨號：ab9485）購于美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（貨號：XY0650）購于上海信裕生物科技有限公司；CircACAP2及miR-29a-3p引物購于廣州RiboBio公司；CircACAP2敲低質(zhì)粒（si-CircACAP2）及對照（si-NC），miR-29a-3p抑制物（miR-29a-3p inhibitor）及對照（inhibitor-NC）、miR-29a-3p模擬物（miR-29a-3p mimic）及對照（mimic-NC）購于上海吉瑪生物公司。

1.3實驗方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)

用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，在恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。定期更換培養(yǎng)基，消化傳代后，收集對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.3.2H/R模型構(gòu)建及細(xì)胞分組、轉(zhuǎn)染

H9c2心肌細(xì)胞H/R模型構(gòu)建參考Wang等［10］的方法：取對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞構(gòu)建H/R模型，去掉原培養(yǎng)基后用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2次，96孔板加入100 μL無血清無糖的DMEM培養(yǎng)基，置于含94%N2、5%CO2和1%O2的培養(yǎng)箱中缺氧2 h后取出，棄去DMEM培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞，重新加入新的10%DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h。將H9c2細(xì)胞隨機分為Control組（正常培養(yǎng)）、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、Model組（H/R模型）、si-CircACAP2組（轉(zhuǎn)染si-CircACAP2）、si-CircACAP2＋inhibitor-NC組（si-CircACAP2和inhibitor-NC共轉(zhuǎn)染）、si-CircACAP2＋miR-29a-3p inhibitor組（si-CircACAP2和miR-29a-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染），對上述各組H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h。

1.3.3實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測CircACAP2、miR-29a-3p表達

提取各組H9c2細(xì)胞的總RNA、反轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板配置qRT-PCR反應(yīng)體系。CircACAP2正向引物：5′-GAATGGGATTCGAGACCTG-3′，反向引物：5′-TTCTTCCAAAGCTGCCTGT-3′；miR-29a-3p正向引物：5′-TAGCACCATTTGAAATCAGTTT-3′，反向引物：5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；GAPDH正向引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，反向引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；U6正向引物：5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，反向引物：5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3；CircACAP2、miR-29a-3p分別以GAPDH、U6為內(nèi)參，以2－ΔΔCT法計算各組細(xì)胞中相對表達量。

1.3.4MTT法檢測細(xì)胞增殖

各組H9c2細(xì)胞接種在96孔板，設(shè)6個復(fù)孔，1×104個/孔。隨后進行常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入20 μL MTT溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h每孔再加入150 μL的二甲基亞砜，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長處檢測各孔的OD值。

1.3.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

收集各組H9c2細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌2次，添加100 μL結(jié)合緩沖液懸浮各組H9c2細(xì)胞，再分別添加V-異硫氟酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）染液各5 μL，充分混勻，于室溫下避光染色15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3.6MDC染色方法檢測細(xì)胞自噬水平

將各組H9c2細(xì)胞消化并計數(shù)制成1×105的細(xì)胞懸液加入6孔板中，置于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置6個復(fù)孔，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次后，在室溫下用MDC溶液避光染色1 h，再用PBS沖洗2次，激發(fā)波長380 nm，發(fā)射波長525 nm，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計算自噬囊泡數(shù)量。

1.3.7細(xì)胞中LDH、MDA、ROS、SOD水平測定

收集各組H9c2細(xì)胞，制成勻漿后按照LDH、MDA、SOD試劑盒說明書檢測LDH、MDA、SOD含量。DCFH-DA染料通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS的水平。

1.3.8蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測增殖、凋亡、自噬及CCNT2蛋白表達

首先用試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白。然后對各組H9c2的總蛋白進行定量、電泳，轉(zhuǎn)膜后在室溫條件下封閉2 h。最后再分別加入PCNA、Bax、Bcl-2、Beclin-1、P62、CCNT2、GAPDH一抗在4 ℃條件下孵育過夜，加入二抗室溫條件下孵育90 min。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算各個蛋白相對表達水平。

1.3.9雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

構(gòu)建CircACAP2、CCNT2野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒（CircACAP2-WT和CircACAP2-MUT、CCNT2-WT和CCNT2-MUT），將CircACAP2-WT和CircACAP2-MUT、CCNT2-WT和CCNT2-MUT分別與mimic-NC或miR-29a-3p mimic共轉(zhuǎn)染于H9c2細(xì)胞，48 h后檢測熒光素酶活性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad Prism 7.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，單因素方差分析用于多組間的比較，進一步兩組間的比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組H9c2細(xì)胞中CircACAP2、miR-29a-3p表達比較

與Control組、si-NC組比較，Model組H9c2細(xì)胞中CircACAP2表達升高，miR-29a-3p表達降低（P＜0.05）；與Model組比較，si-CircACAP2組H9c2細(xì)胞中CircACAP2表達降低，miR-29a-3p表達升高（P＜0.05）；與si-CircACAP2組、si-CircACAP2＋inhibitor-NC組比較，si-CircACAP2＋miR-29a-3p inhibitor組H9c2細(xì)胞中CircACAP2表達變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），miR-29a-3p表達降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2敲低CircACAP2對細(xì)胞增殖能力的影響

與Control組、si-NC組比較，Model組24、48、72 h時H9c2細(xì)胞的OD490值降低（P＜0.05）；與Model組比較，si-CircACAP2組24、48、72h時H9c2細(xì)胞的OD490值升高（P＜0.05）；與si-CircACAP2組、si-CircACAP2＋inhibitor-NC組比較，si-CircACAP2＋miR-29a-3p inhibitor組24、48、72 h時H9c2細(xì)胞的OD490值降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.3敲低CircACAP2對細(xì)胞凋亡的影響

與Control組、si-NC組比較，Model組H9c2細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與Model組比較，si-CircACAP2組H9c2細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與si-CircACAP2組、si-CircACAP2＋inhibitor-NC組比較，si-CircACAP2＋miR-29a-3p inhibitor組H9c2細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。詳見圖1和表3。

2.4敲低CircACAP2對細(xì)胞自噬的影響

與Control組、si-NC組比較，Model組H9c2細(xì)胞自噬囊泡數(shù)升高（P＜0.05）；與Model組比較，si-CircACAP2組H9c2細(xì)胞自噬囊泡數(shù)降低（P＜0.05）；與si-CircACAP2組、si-CircACAP2＋inhibitor-NC組比較，si-CircACAP2＋miR-29a-3p inhibitor組H9c2細(xì)胞自噬囊泡數(shù)升高（P＜0.05）。詳見圖2和表4。

2.5敲低CircACAP2對細(xì)胞氧化損傷的影響

與Control組、si-NC組比較，Model組H9c2細(xì)胞的LDH釋放率、MDA、ROS水平升高，SOD活性減弱（P＜0.05）；與Model組比較，si-CircACAP2組H9c2細(xì)胞的LDH釋放率、MDA、ROS水平降低，SOD活性增強（P＜0.05）；與si-CircACAP2組、si-CircACAP2＋inhibitor-NC組比較，si-CircACAP2＋miR-29a-3p inhibitor組H9c2細(xì)胞的LDH釋放率、MDA、ROS水平升高，SOD活性減弱（P＜0.05）。詳見表5。

2.6敲低CircACAP2對細(xì)胞增殖、凋亡、自噬及CCNT2蛋白表達的影響

與Control組、si-NC組比較，Model組H9c2細(xì)胞中PCNA、Bcl-2、P62蛋白表達降低，Bax、Beclin-1、CCNT2蛋白表達升高（P＜0.05）；與Model組比較，si-CircACAP2組H9c2細(xì)胞的PCNA、Bcl-2、P62蛋白表達升高，Bax、Beclin-1、CCNT2蛋白表達降低（P＜0.05）；與si-CircACAP2組、si-CircACAP2＋inhibitor-NC組比較，si-CircACAP2＋miR-29a-3p inhibitor組H9c2細(xì)胞的PCNA、Bcl-2、P62蛋白表達降低，Bax、Beclin-1、CCNT2蛋白表達升高。詳見圖3和表6。

2.7CircACAP2與miR-29a-3p、miR-29a-3p與CCNT2的靶向關(guān)系

使用Starbase網(wǎng)站預(yù)測CircACAP2與miR-29a-3p、miR-29a-3p和CCNT2的結(jié)合位點（見圖4、圖5）。與mimic-NC和CircACAP2-WT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-29a-3p mimic和CircACAP2-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性降低（P＜0.05）；與mimic-NC和CircACAP2-MUT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-29a-3p mimic和CircACAP2-MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表7。與mimic-NC和CCNT2-WT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-29a-3p mimic和CCNT2-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性降低（P＜0.05）；與mimic-NC和CCNT2-MUT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-29a-3p mimic和CCNT2-MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表8。

3討論

在缺血性疾病治療的時候容易發(fā)生MIRI，促使心肌細(xì)胞凋亡、壞死，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，降低病人的心功能，甚至導(dǎo)致病人死亡［11-12］。MIRI損傷是心肌梗死后血運重建不良結(jié)局的主要原因［13］。目前，H/R誘導(dǎo)的心肌損傷的機制尚未明確，而且缺少有效的戰(zhàn)略來限制或預(yù)防MIRI的發(fā)生。因此，探索H/R誘導(dǎo)的心肌損傷機制，尋找新的治療策略，顯得十分必要。Bax是細(xì)胞凋亡的正反饋因子，Bcl-2則是細(xì)胞凋亡的負(fù)反饋因子，而LDH是檢測細(xì)胞壞死的重要手段，發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時，ROS和MDA水平顯著上升，SOD水平降低。自噬是細(xì)胞中物質(zhì)溶酶體降解的總稱，與心肌MIRI損傷有關(guān)，發(fā)生心肌缺血時可誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白發(fā)生改變，使得自噬水平上升［14］。本研究結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡率、自噬囊泡數(shù)、LDH釋放率、MDA、ROS水平、Bax、Beclin-1蛋白表達升高，OD490值、SOD活性、PCNA、Bcl-2、P62蛋白表達降低；提示H/R誘導(dǎo)后能抑制H9c2心肌細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡和自噬、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，H/R模型構(gòu)建成功。

circRNA是一類具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)非編碼RNA，circRNA在心血管系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)功能引起了廣泛關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明，circRNA參與多種生物過程，如細(xì)胞增殖、分化和凋亡，并可能在MIRI中發(fā)揮重要作用［15］。Zong等［16］研究表明，circANXA2通過抑制miR-133表達，加重心肌損傷，促進MIRI期間的心肌細(xì)胞凋亡。circNCX1響應(yīng)MIRI而上調(diào)表達，敲低其表達后可以與miR-133a-3p結(jié)合并抑制miR-133a-3p對細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白（CDIP1）活性的調(diào)節(jié)，減少細(xì)胞凋亡并減輕I/R誘導(dǎo)的心肌損傷［17］。Liu等［18］研究表明，CircACAP2在心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞中的表達增加，并通過海綿miR-29誘導(dǎo)心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡。Zhang等［6］研究表明，CircACAP2在心肌梗死病人中高表達，并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，CircACAP2在H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中高表達，抑制CircACAP2的表達，能降低細(xì)胞凋亡率、自噬囊泡數(shù)、LDH釋放率、MDA、ROS水平、Bax、Beclin-1蛋白表達水平，升高OD490值、SOD活性、PCNA、Bcl-2、P62蛋白表達水平。提示沉默CircACAP2可促進H9c2細(xì)胞增殖，抑制其凋亡、自噬與氧化應(yīng)激。

越來越多的證據(jù)表明，miRNA通過參與炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡等，參與MIRI的病理發(fā)生［19］。心肌纖維化是加速心肌梗死心臟重塑的病理過程，miR-29a-3p在心肌梗死小鼠的心肌組織，Leonurine通過上調(diào)miR-29a-3p表達，減輕心肌梗死小鼠的心肌纖維化［20］。miR-29a-3p在MIRI中下調(diào)表達，并能促進ROS的產(chǎn)生和心肌細(xì)胞的凋亡［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a-3p在H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中低表達。敲低CircACAP2可靶向調(diào)控miR-29a-3p表達，且下調(diào)miR-29a-3p表達減弱了敲低CircACAP2對H9c2細(xì)胞凋亡、自噬與氧化應(yīng)激的抑制作用、對其增殖的促進作用。提示敲低CircACAP2可能通過上調(diào)miR-29a-3p促進H9c2細(xì)胞增殖，抑制其凋亡、自噬與氧化應(yīng)激。Tian等［9］研究表明，miR-29a-3p通過靶向調(diào)控CCNT2，抑制LDH活性、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞增殖，減弱MIRI損傷。本研究表明，CCNT2是miR-29a-3p的靶標(biāo)，敲低CircACAP2可下調(diào)CCNT2的表達，下調(diào)miR-29a-3p減弱了敲低CircACAP2對CCNT2蛋白表達的抑制作用，且miR-29a-3p靶向負(fù)調(diào)控CCNT2表達。

綜上所述，敲低CircACAP2可能通過靶向miR-29a-3p來下調(diào)CCNT2表達，進而促進H9c2細(xì)胞增殖，抑制其凋亡、自噬與氧化應(yīng)激。CircACAP2/miR-29a-3p/CCNT2軸可能成為治療MIRI的一種新的靶點。然而本研究尚存在不足之處，僅僅在細(xì)胞水平上驗證了CircACAP2/miR-29a-3p/CCNT2軸對H9c2細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和氧化應(yīng)激的影響，并未在體內(nèi)水平上進行探討，后續(xù)研究將會在體內(nèi)水平上進行進一步探索。

參考文獻：

［1］XIONG Y Y，GONG Z T，TANG R J，et al.The pivotal roles of exosomes derived from endogenous immune cells and exogenous stem cells in myocardial repair after acute myocardial infarction［J］.Theranostics，2021，11（3）：1046-1058.

［2］ROSSIDES M，KULLBERG S，GRUNEWALD J，et al.Risk of acute myocardial infarction in sarcoidosis：a population-based cohort study from Sweden［J］.Respiratory Medicine，2021，188：106624.

［3］BAI M，PAN C L，JIANG G X，et al.CircHIPK3 aggravates myocardial ischemia-reperfusion injury by binding to miRNA-124-3p［J］.European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2019，23（22）：10107-10114.

［4］SUN Y，ZHANG Y M，YE Z B，et al.circRNA-miRNA complex participates in the apoptosis of myocardial cells in myocardial ischemia/reperfusion injury［J］.Discovery Medicine，2022，33（168）：13-26.

［5］HUANG F W，MAI J T，CHEN J W，et al.Non-coding RNAs modulate autophagy in myocardial ischemia-reperfusion injury：a systematic review［J］.Journal of Cardiothoracic Surgery，2021，16（1）：140.

［6］ZHANG J，TANG Y R，ZHANG J，et al.CircRNA ACAP2 is overexpressed in myocardial infarction and promotes the maturation of miR-532 to induce the apoptosis of cardiomyocyte［J］.Journal of Cardiovascular Pharmacology，2021，78（2）：247-252.

［7］LI K，YA X J，DUAN X J，et al.miRNA-19b-3p stimulates cardiomyocyte apoptosis induced by myocardial ischemia reperfusion via downregulating PTEN［J］.Disease Markers，2021，2021：9956666.

［8］BAO Y D，QIAO Y，YU H，et al.miRNA-27a transcription activated by c-fos regulates myocardial ischemia-reperfusion injury by targeting ATAD3a［J］.Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2021，2021：2514947.

［9］TIAN R，GUAN X，QIAN H，et al.Restoration of NRF2 attenuates myocardial ischemia reperfusion injury through mediating microRNA-29a-3p/CCNT2 axis［J］.BioFactors，2021，47（3）：414-426.

［10］WANG D，CHEN T Y，LIU F J.Betulinic acid alleviates myocardial hypoxia/reoxygenation injury via inducing Nrf2/HO-1 and inhibiting p38 and JNK pathways［J］.European Journal of Pharmacology，2018，838：53-59.

［11］WU Y S，LIU H Q，WANG X B.Cardioprotection of pharmacological postconditioning on myocardial ischemia/reperfusion injury［J］.Life Sciences，2021，264：118628.

［12］SHEN Y M，LIU X J，SHI J H，et al.Involvement of Nrf2 in myocardial ischemia and reperfusion injury［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2019，125：496-502.

［13］ZHANG X J，LIU X L，HU M L，et al.Pharmacological inhibition of arachidonate 12-lipoxygenase ameliorates myocardial ischemia-reperfusion injury in multiple species［J］.Cell Metabolism，2021，33（10）：2059-2075.

［14］SHI B H，MA M Q，ZHENG Y T，et al.mTOR and Beclin1：two key autophagy-related molecules and their roles in myocardial ischemia/reperfusion injury［J］.Journal of Cellular Physiology，2019，234（8）：12562-12568.

［15］ALTESHA M A，NI T，KHAN A，et al.Circular RNA in cardiovascular disease［J］.Journal of Cellular Physiology，2019，234（5）：5588-5600.

［16］ZONG L，WANG W X.CircANXA2 promotes myocardial apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury via inhibiting miRNA-133 expression［J］.BioMed Research International，2020，2020：8590861.

［17］LI M Y，DING W，TARIQ M A，et al.A circular transcript of ncx1 gene mediates ischemic myocardial injury by targeting miR-133a-3p［J］.Theranostics，2018，8（21）：5855-5869.

［18］LIU X，WANG M X，LI Q，et al.CircRNA ACAP2 induces myocardial apoptosis after myocardial infarction by sponging miR-29［J］.Minerva Medica，2022，113（1）：128-134.

［19］LI Q，LI Z Q，F(xiàn)AN Z X，et al.Involvement of non-coding RNAs in the pathogenesis of myocardial ischemia/reperfusion injury （Review）［J］.International Journal of Molecular Medicine，2021，47（4）：42.

［20］WANG R Y，PENG L Q，LV D Y，et al.Leonurine attenuates myocardial fibrosis through upregulation of miR-29a-3p in mice post-myocardial infarction［J］.Journal of Cardiovascular Pharmacology，2021，77（2）：189-199.

［21］ ZHANG L，ZHANG J，TONG Q G，et al.Reduction of miR-29a-3p induced cardiac ischemia reperfusion injury in mice via targeting Bax［J］.Experimental and Therapeutic Medicine，2019，18（3）：1729-1737.

（收稿日期：2023-02-17）

（本文編輯鄒麗）