黃連堿預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠JNK/p38MAPK信號(hào)通路的影響

摘要目的：探討黃連堿預(yù)處理對心肌缺血再灌注（MI/RI）大鼠c-Jun氨基末端激酶（JNK）/促分裂素原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路的影響。方法：將60只大鼠隨機(jī)分為MI/RI組、假手術(shù)組、黃連堿低劑量組（黃連堿-L組，50 mg/kg黃連堿）、黃連堿中劑量組（黃連堿-M組，100 mg/kg黃連堿）、黃連堿高劑量組（黃連堿-H組，200 mg/kg黃連堿）及黃連堿-H＋激活劑組（50 mg/kg黃連堿＋25 mg/L JNK/p38MAPK通路激活劑茴香霉素），每組10只。除假手術(shù)組外，其余各組均進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎構(gòu)建MI/RI大鼠模型，造模后，觀察血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)左室內(nèi)壓最大上升（LVdp/dtmax）、左室內(nèi)壓最大下降速率（LVdp/dtmin）、收縮壓以及舒張末壓變化；采集大鼠腹部主動(dòng)脈血，評(píng)估心肌損傷程度指標(biāo)肌酸激酶同工酶（CK-MB）及乳酸脫氫酶（LDH）含量；分離心肌組織，檢測心肌組織病理學(xué)變化、細(xì)胞凋亡、炎性因子［腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）］水平及JNK/p38MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，MI/RI組存在大量炎性細(xì)胞浸潤、組織結(jié)構(gòu)紊亂，病理損傷嚴(yán)重，LVdp/dtmax、LVdp/dtmin、收縮壓均降低，但凋亡率、舒張壓、LDH、CK-MB、TNF-α、IL-6含量、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)增加（P＜0.05）；與MI/RI組比較，黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組病理損傷得到改善，LVdp/dtmax、LVdp/dtmin、收縮壓均增加，凋亡率、舒張壓、LDH、CK-MB、TNF-α、IL-6含量、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)降低（P＜0.05）；與黃連堿-H組比較，黃連堿-H＋激活劑組病理損傷進(jìn)一步加劇，LVdp/dtmax、LVdp/dtmin、收縮壓均降低，但凋亡率、舒張壓、LDH、CK-MB、TNF-α、IL-6含量、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)增加（P＜0.05）。結(jié)論：黃連堿預(yù)處理可通過抑制JNK/p38MAPK通路減輕MI/RI大鼠心肌損傷。

關(guān)鍵詞心肌缺血再灌注；心肌損傷；黃連堿；c-Jun氨基末端激酶/促分裂素原活化蛋白激酶信號(hào)通路；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.17.008

Effect of Coptisine Pretreatment on JNK/p38MAPK Signaling Pathway in Rats with Myocardial Ischemia-reperfusion Injury

ZHAO Zhicheng， GUO Tianlong

The Fourth Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150000， Heilongjiang， China

Corresponding AuthorGUO Tianlong， E-mail： eginfa32668@163.com

AbstractObjective：To investigate the effect of coptisine pretreatment on c-Jun amino-terminal kinase（JNK）/mitogen-activated protein kinase（p38MAPK） signaling pathway in myocardial ischemia-reperfusion（MI/RI） rats.Methods：Sixty rats were randomly divided into MI/RI group，sham operation group，low dose of coptisine（coptisine-L，50 mg/kg coptisine） group，medium dose of coptisine（coptisine-M，100 mg/kg coptisine） group，and high dose of coptisine（coptisine-H，200 mg/kg coptisine） group and coptisine-H＋activator（50 mg/kg coptisine＋25 mg/L JNK/p38MAPK pathway activator-anisomycin） group，10 rats" in each group.MI/RI rat model was constructed by coronary artery ligation in all groups except the sham operation group.After modeling，the hemodynamic parameters of left chamber pressure maximum rise（LVdp/dtmax），decline rate（LVdp/dtmin），systolic blood pressure，and end diastolic blood pressure were observed.The contents of creatine kinase isoenzyme（CK-MB） and lactate dehydrogenase（LDH） were evaluated by collecting aorta blood from rats.Myocardial tissue was isolated，and myocardial histopathological changes，apoptosis，TNF-α，interleukin-6（IL-6） levels，and JNK/p38MAPK pathway-related protein expression were detected.Results：Compared with the sham operation group，MI/RI group showed a large number of inflammatory cells infiltration，tissue structure disorder，serious pathological damage，LVdp/dtmax，LVdp/dtmin，systolic blood pressure decreased，however，apoptosis rate，end-diastolic blood pressure，LDH，CK-MB，TNF-α，IL-6 content，P-JNK/JNK，P-P38MAPK/p38MAPK expression increased（P＜0.05）.Compared with MI/RI group，the pathological damage of coptisine-L group，coptisine-M group and coptisine-H group were improved，and LVdp/dtmax，LVdp/dtmin and systolic blood pressure increased，and apoptosis rate，end diastolic blood pressure，LDH，CK-MB，TNF-α，IL-6 content，P-JNK/JNK，P-P38MAPK/p38MAPK expression decreased（P＜0.05）.Compared with the coptisine-H group，the pathological damage of coptisine-H＋activator group was further aggravated，and LVdp/dtmax，LVdp/dtmin and systolic blood pressure decreased，however，apoptosis rate，end diastolic blood pressure，LDH，CK-MB，TNF-α，IL-6 content，P-JNK/JNK，P-P38MAPK/p38MAPK expression increased（P＜0.05）.Conclusion：Pretreatment with coptisine could reduce myocardial injury in MI/RI rats by inhibiting JNK/p38MAPK pathway.

Keywords myocardial ischemia reperfusion; myocardial injury; coptisine; c-Jun amino-terminal kinase/mitogen-activated protein kinase signaling pathway; experimental study

缺血性心臟病是全球死亡的主要原因，目前再灌注是急性缺血性心臟病的決定性治療方法，然而目前缺乏有效的治療方法預(yù)防心肌缺血再灌注損傷（myocardial"ischemia reperfusion injury，MI/RI）［1］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡是MI/RI的特征之一，因此，抑制細(xì)胞凋亡可預(yù)防MI/RI的進(jìn)展［2］。已有研究表明，MI/RI發(fā)生后c-Jun氨基末端激酶（JNK）/促分裂素原活化蛋白激酶（p38MAPK）通路信號(hào)明顯被激活，阻斷該通路可明顯減輕臟器功能損傷、抑制細(xì)胞凋亡及炎性水平增加［3］。黃連堿是一種具有多種生物學(xué)功能的生物堿，在缺血再灌注引起的心肌損傷中可發(fā)揮保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚不明確［4］。本研究旨在探討黃連堿預(yù)處理對MI/RI大鼠心肌損傷的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只體質(zhì)量280～300 g的8周齡雄性Sprague Dawley大鼠，購自廣東維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（粵）2022-0063。將大鼠置于（23±2）℃、濕度為40%～60%的12 h∶12 h光照/黑暗循環(huán)中，可以自由獲得標(biāo)準(zhǔn)食物和水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

黃連堿（純度≥98%）購自南京景竹生物科技有限公司；JNK/p38MAPK通路激活劑茴香霉素購自美國MCE公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法試劑盒購自上海拜沃生物科技有限公司；二喹啉甲酸法（BCA）蛋白檢測試劑盒、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法（TUNEL）試劑盒購自Merck公司；p-JNK、p-p38MAPK、JNK、p38MAPK一抗購自Abcam公司。

1.3大鼠分組、預(yù)處理及MI/RI模型的制備

60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為MI/RI組、假手術(shù)組、黃連堿低劑量（黃連堿-L）組、黃連堿中劑量（黃連堿-M）組、黃連堿高劑量（黃連堿-H）組以及黃連堿-H＋激活劑組，每組10只，其中MI/RI組、假手術(shù)組連續(xù)7 d給予生理鹽水灌胃及腹腔注射干預(yù)，每日1次；黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組分別以50、100、200 mg/kg黃連堿灌胃，同時(shí)腹腔注射生理鹽水，每日1次［5］；黃連堿-H＋激活劑組以200 mg/kg黃連堿灌胃干預(yù)，同時(shí)腹腔注射25 mg/L茴香霉素，每日1次［6］。連續(xù)干預(yù)7 d，干預(yù)結(jié)束后，采用戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，之后固定大鼠，進(jìn)行氣管插管，連接呼吸機(jī)維持呼吸，同時(shí)以生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)監(jiān)測左心室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)及心電圖，待數(shù)據(jù)平穩(wěn)后，開胸，暴露心臟，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支部位30 min，再恢復(fù)血流供應(yīng)2 h。其中假手術(shù)組僅穿線，不結(jié)扎。當(dāng)松開結(jié)扎線恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血量，抬高的ST段下降，缺血部位心肌顏色恢復(fù)，標(biāo)志著造模成功，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均符合造模標(biāo)準(zhǔn)［7］。

1.4檢測血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)

造模成功后，通過生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)監(jiān)測左心室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括左室內(nèi)壓最大上升速率（LVdp/dtmax）、左室內(nèi)壓最大下降速率（LVdp/dtmin）、收縮壓及舒張末壓。

1.5評(píng)估心肌損傷程度

采集大鼠腹部主動(dòng)脈血液，離心，收集上清液，通過全自動(dòng)生化分析儀檢測肌酸激酶同工酶（CK-MB）及乳酸脫氫酶（LDH）含量。

1.6ELISA法檢測心肌組織中炎性因子水平

取部分左心室心肌組織，ELISA法的具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，通過酶標(biāo)儀分析TNF-α、IL-6水平。

1.7蘇木精-伊紅（HE）染色檢測心肌組織病理學(xué)變化

取部分心臟組織固定在4%多聚甲醛中，然后將樣品包埋在石蠟中，切成4 μm厚的切片，使用HE染色，在顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.8TUNEL檢測細(xì)胞凋亡

心臟組織脫蠟后，用乙醇脫水，然后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌2次，按照試劑盒的操作步驟，加入TUNEL混合液，于37 ℃避光孵育1 h。繼續(xù)用4，6-雙脒-2-苯基吲哚（DAPI）對細(xì)胞核進(jìn)行染色，在室溫下孵育10 min，并用PBS沖洗2次。在熒光顯微鏡下觀察心肌組織并拍照，其中凋亡細(xì)胞核呈綠色，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.9蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測JNK/p38MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取部分心臟組織，使用BCA蛋白檢測試劑盒測定樣品的濃度。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離等量的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。隨后在室溫下用5%脫脂乳封閉該膜1 h，并與p-JNK、p-p38MAPK、JNK、p38MAPK一抗在4 ℃下孵育過夜。洗滌后，將樣品與二抗在室溫下孵育1.5 h。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）系統(tǒng)和熒光成像系統(tǒng)檢測印跡，Image J分析蛋白表達(dá)水平。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 27.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，以snk-q檢驗(yàn)進(jìn)一步兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1黃連堿對各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

與假手術(shù)組比較，MI/RI組LVdp/dtmax、LVdp/dtmin、收縮壓均降低，但舒張壓增加（P＜0.05）；與MI/RI組比較，黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組LVdp/dtmax、LVdp/dtmin、收縮增加，舒張壓降低（P＜0.05）；與黃連堿-H組比較，黃連堿-H＋激活劑組LVdp/dtmax、LVdp/dtmin、收縮壓降低，舒張壓增加（P＜0.05）。詳見表1。

2.2黃連堿對各組大鼠心肌損傷程度的影響

與假手術(shù)組比較，MI/RI組LDH、CK-MB含量增加（P＜0.05）；與MI/RI組比較，黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組LDH、CK-MB含量降低（P＜0.05）；與黃連堿-H組比較，黃連堿-H＋激活劑組LDH、CK-MB含量增加（P＜0.05）。詳見表2。

2.3黃連堿對各組大鼠心肌組織中炎性因子的影響

與假手術(shù)組比較，MI/RI組TNF-α、IL-6含量增加（P＜0.05）；與MI/RI組比較，黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組TNF-α、IL-6含量降低（P＜0.05）；與黃連堿-H組比較，黃連堿-H＋激活劑組TNF-α、IL-6含量增加（P＜0.05）。詳見表3。

2.4黃連堿對心肌組織病理學(xué)的影響

假手術(shù)組大鼠心肌組織無明顯病理學(xué)變化；MI/RI組存在大量炎性細(xì)胞浸潤、心肌纖維排列松散，組織結(jié)構(gòu)紊亂；黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組病理損傷逐漸改善；但黃連堿-H＋激活劑組與黃連堿-H組比較病理損傷加劇，細(xì)胞結(jié)構(gòu)缺損，炎性浸潤依然存在。詳見圖1。

2.5黃連堿對大鼠細(xì)胞凋亡的影響

與假手術(shù)組比較，MI/RI組細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）；與MI/RI組比較，黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與黃連堿-H組比較，黃連堿-H＋激活劑組細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.6黃連堿對大鼠心肌組織JNK/p38MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，MI/RI組p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)增加（P＜0.05）；與MI/RI組比較，黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)降低（P＜0.05）；與黃連堿-H組比較，黃連堿-H＋激活劑組p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)增加（P＜0.05）。詳見圖3、表5。

3討論

由冠狀動(dòng)脈閉塞引起的急性心肌梗死是全世界發(fā)病率和死亡率的主要原因，給病人帶來了嚴(yán)重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，急性心肌缺血后的早期再灌注治療可以恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流、挽救心肌細(xì)胞并延長存活時(shí)間，但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致額外的損傷并加重心臟功能障礙，增加急性心肌梗死病人的死亡率［8-9］。因此，探索MI/RI的作用機(jī)制有助于尋找有效治療藥物預(yù)防MI/RI的發(fā)生發(fā)展。

中藥具有資源豐富、毒副作用低、易于接受等優(yōu)勢，在心血管疾病防治方面已做出重大貢獻(xiàn)，如人參皂苷能釋放一氧化氮保護(hù)心肌，黃連等有抗心律失常作用［10］。中藥能激發(fā)藥物性預(yù)適應(yīng)對心肌缺血的保護(hù)作用具有重要意義，為防治心肌缺血性疾病提供了新思路。黃連堿是一種天然存在的異喹啉生物堿，是黃連干燥根莖的生物活性成分，具有抗炎、抗高膽固醇血癥、舒張血管和保護(hù)心臟等特性［11］。Guo等［12］研究發(fā)現(xiàn)，黃連堿可抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，保護(hù)心肌缺血再灌注大鼠心臟。本研究發(fā)現(xiàn)，MI/RI大鼠中細(xì)胞凋亡明顯增加，有研究顯示，抑制心肌細(xì)胞凋亡可有效改善MI/RI的進(jìn)展［13］。此外，炎癥反應(yīng)在MI/RI進(jìn)展中也發(fā)揮關(guān)鍵作用［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，MI/RI大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6含量增加，與Kingery等［15］的研究結(jié)果一致，同時(shí)心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH、CK-MB含量上升，HE染色顯示，心肌組織中存在大量炎性細(xì)胞浸潤、心肌纖維排列松散，組織結(jié)構(gòu)紊亂，影響血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，提示MI/RI大鼠心臟功能受損。但經(jīng)黃連堿預(yù)處理的MI/RI大鼠，抑制了細(xì)胞凋亡以及炎癥反應(yīng)，在一定程度上緩解了MI/RI大鼠心臟受損，提示黃連堿可能通過抑制細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)改善MI/RI大鼠心臟受損，但具體機(jī)制尚不明確。

MAPKs在神經(jīng)元的適應(yīng)、增殖和分化中起著重要的作用。MAPK信號(hào)通路通常分為3個(gè)主要的亞組，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2、JNK和p38MAPK。研究表明，ERK1/2激活通常保護(hù)神經(jīng)元免于凋亡，而p38和/或JNK的激活通常導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡，對于腦缺血再灌注期間炎癥和凋亡的調(diào)節(jié)是必不可少的［16-17］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MI/RI大鼠心肌組織中p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)顯著增加，提示激活JNK/p38MAPK通路，可促進(jìn)炎性因子的釋放，加速細(xì)胞凋亡，從而加重MI/RI。研究發(fā)現(xiàn)，咪達(dá)唑侖通過抑制JNK/p38MAPK信號(hào)通路抑制缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［18］。李明航等［19］研究表明，全反式維A酸保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷作用的主要機(jī)制是通過抑制JNK/p38MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)黃連堿預(yù)處理后，p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)明顯被抑制，緩解了MI/RI進(jìn)展。最后實(shí)驗(yàn)以JNK/p38MAPK通路激活劑進(jìn)行恢復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茴香霉素逆轉(zhuǎn)了黃連堿對MI/RI大鼠的保護(hù)作用，表明黃連堿預(yù)處理可減輕MI/RI大鼠心肌損傷，與抑制JNK/p38MAPK通路有關(guān)。

綜上所述，黃連堿預(yù)處理可降低炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡、減輕MI/RI大鼠心肌損傷，可能通過抑制JNK/p38MAPK通路實(shí)現(xiàn)。

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（收稿日期：2023-02-07）

（本文編輯鄒麗）