響應(yīng)面法優(yōu)化金槍魚魚骨肽提取工藝研究

摘要：以超低溫金槍魚魚骨為原料，利用酶法提取制備金槍魚魚骨肽，篩選復(fù)合蛋白酶為最佳提取用酶，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以加酶量、酶解溫度、酶解時間為自變量，以金槍魚魚骨肽提取率為響應(yīng)值，基于Box-Behnken中心組合原理，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，確定了最佳酶解工藝條件為復(fù)合蛋白酶添加量625 U/g、酶解時間5.5 h、酶解溫度50 ℃，在該條件下測得金槍魚魚骨肽的提取率為34.58%，制備的金槍魚魚骨肽中低聚肽含量為91.7%，分子量≤1 kDa的低聚肽占比98.7%，金槍魚魚骨肽中游離氨基酸含量為10.66 g/100 g，呈味氨基酸和必需氨基酸含量相對較高，分別為26.4%和48.1%，是一種極具開發(fā)價值的海洋生物資源。

關(guān)鍵詞：金槍魚魚骨肽；提取工藝；響應(yīng)面優(yōu)化試驗

中圖分類號：TS201.1""""" 文獻標(biāo)志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）09-0138-06

Optimization of Extraction Process of Tuna Fish Bone Peptide by

Response Surface Method

LIU Meng1， ZHU Lai-jing1， WANG Yan-li1， YU Hai-tao2， KE Ben-hong3， ZHAO Xiang-zhong1*

（1.School of Food Science and Engineering， Qilu University of Technology （Shandong Academy

of Sciences）， Jinan 250353， China; 2.Shandong Withinpeak Food Technology Co.， Ltd.，

Weihai 264211， China; 3.Shandong Zhonglu Oceanic （Yantai） Foods Co.， Ltd.，

Yantai 264000， China）

Abstract： Using ultra-low temperature tuna fish bone as the raw material， tuna fish bone peptide is extracted and prepared by enzymatic method， and complex protease is selected as the best enzyme for extraction. On the basis of single factor test， with enzyme addition amount， enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time as the independent variables， with the extraction rate of tuna fish bone peptide as the response value， the extraction process is optimized by response surface method based on Box-Behnken central combination principle， and the optimal enzymatic hydrolysis process conditions are determined as follows： the addition amount of complex protease is 625 U/g， the enzymatic hydrolysis time is 5.5 h and the enzymatic hydrolysis temperature is 50 ℃. Under these conditions， the extraction rate of tuna fish bone peptide is 34.58%， the oligopeptide content of the prepared tuna fish bone peptide is 91.7%， the oligopeptide with molecular weight ≤1 kDa accounts for 98.7%， the content of free amino acids of tuna fish bone peptide is 10.66 g/100 g， and the content of flavor amino acids and essential amino acids is relatively high， which is 26.4% and 48.1% respectively. It is a kind of marine biological resource with great exploration value.

Key words： tuna fish bone peptide; extraction process; response surface optimization test

收稿日期：2024-03-14

基金項目：齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）-威海市產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新基金（2021CXY-03）

作者簡介：劉萌（1998—），女，碩士，研究方向：蛋白質(zhì)工程。

*通信作者：趙祥忠（1969—），男，副教授，碩士，研究方向：海洋食品與生物技術(shù)。

金槍魚又名吞拿魚，主要分布于太平洋、大西洋、印度洋一帶，是大洋暖水性洄游魚類。近年來，全世界金槍魚年捕撈量在478萬噸以上[1]，2020年我國遠洋金槍魚漁獲量高達32.74萬噸，占遠洋漁業(yè)年總量的14.1%[2-3]。每年加工金槍魚罐頭30萬噸，生食金槍魚10萬噸左右，而且呈逐年上升趨勢[4]。金槍魚是世界上重要的經(jīng)濟魚類之一，金槍魚加工按照品種不同主要分為鰹魚和超低溫金槍魚兩大類，鰹魚主要用于罐頭的生產(chǎn)加工，超低溫金槍魚主要用于生食魚片的生產(chǎn)[5-6]。在超低溫金槍魚加工過程中，邊角料主要包括魚頭、魚骨、魚皮和血合肉四部分，占魚總重的50%～60%[7]，冷云等[8]、張楠等[9]、王聰艷[10]分別利用魚皮制備了金槍魚膠原蛋白肽；辛建美[11]、呂樂等[12]、李桂芬等[13]、徐茂琴等[14]開展了對金槍魚碎肉和血合肉的酶解研究；而占魚重10%的魚骨[15]一直未得到較好的開發(fā)利用，造成資源的大量浪費。賈建萍等[16]測定了金槍魚魚骨的營養(yǎng)成分，鮮味氨基酸（Glu和Asp）含量為17.06%，甜味氨基酸（Gly和Ala）含量為27.98%，表明金槍魚魚骨酶解液具有潛在的呈味特性，可用于水產(chǎn)調(diào)味料的開發(fā)利用。本研究以金槍魚魚骨為原料，經(jīng)破碎處理后采用復(fù)合酶酶解，優(yōu)化提取制備金槍魚魚骨肽，以期實現(xiàn)金槍魚魚骨的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚魚骨：山東省中魯遠洋（煙臺）食品有限公司；中性蛋白酶（酶活力：20萬U/g）、風(fēng)味蛋白酶（酶活力：30萬U/g）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（酶活力：4 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；堿性蛋白酶（酶活力：30萬U/g）：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；復(fù)合蛋白酶（胰蛋白酶-中性蛋白酶-氨肽酶三者復(fù)合，酶活力：10萬U/g）：山東隆科特酶制劑有限公司。

HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國宇儀器制造有限公司；YGNJ-300骨泥機 青島海云天機械設(shè)備有限公司；BXM-110FL立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HT200高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；PHS-23S數(shù)顯pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 金槍魚魚骨粉成分的測定

蛋白質(zhì)的測定：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》。

脂肪的測定：參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》。

灰分的測定：參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》。

分子量分布、低聚肽、游離氨基酸的測定：參照GB/T 22729—2008中規(guī)定的方法。

1.2.2 金槍魚魚骨酶解工藝

1.2.2.1 工藝流程

新鮮的金槍魚魚骨→冷凍→破碎→冷凍干燥→金槍魚魚骨粉→復(fù)配→控溫酶解→滅酶→離心分離→上清液→脫色→真空濃縮→噴霧干燥→金槍魚魚骨肽粉。

1.2.2.2 操作步驟

選取新鮮的金槍魚魚骨，于－60 ℃的超低溫冷庫中冷凍12 h，用骨泥機粉碎至100目以上，制得魚骨漿，將魚骨漿冷凍干燥，制得粉末狀的金槍魚魚骨粉。精確稱取2 g（精確到0.001 g）魚骨粉加入一定比例的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH后加入蛋白酶，在50 ℃下酶解，酶解后采用100 ℃滅酶5 min，水浴冷卻至35 ℃時以8 000 r/min離心10 min，收集上清液加入0.5%的活性炭脫色處理，過濾后將上清液進行真空濃縮，然后噴霧干燥制得金槍魚魚骨肽粉。

1.2.3 金槍魚魚骨肽提取率的測定

取潔凈干燥的培養(yǎng)皿，稱量質(zhì)量m0；將離心收集的酶解液倒入上述培養(yǎng)皿中，冷凍干燥后稱量質(zhì)量ml；然后用蒸餾水將凍干樣品復(fù)溶，用0.45 μm的微孔膜過濾，將濾液移入50 mL容量瓶中，定容搖勻，測定游離氨基酸含量m2，計算多肽提取率。

魚骨肽提取率（%）=（m1－m0－m2）/M×100%。

（1）

式中：m0為空培養(yǎng)皿的質(zhì)量（g）；m1為酶解液冷凍干燥后培養(yǎng)皿的總質(zhì)量（g）；m2為酶解液中游離氨基酸的質(zhì)量（g）；M為稱取凍干金槍魚魚骨粉的質(zhì)量（g）。

1.2.4 金槍魚魚骨肽降解用酶的篩選

以金槍魚魚骨粉為原料，選擇中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶5種酶在料液比1∶15、加酶量500 U/g、各自最適酶解溫度和pH條件下酶解5 h，然后滅酶冷卻，離心收集上清液，處理后測定魚骨肽的提取率，確定魚骨粉酶解的最佳用酶。

1.2.5 單因素試驗

采用復(fù)合蛋白酶提取金槍魚魚骨肽的影響因素較多，試驗中選取加酶量、酶解溫度和酶解時間3個影響較大的因素進行單因素試驗，考察3個變量對魚骨肽提取率的影響，得到最優(yōu)的單因素條件。

1.2.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在復(fù)合蛋白酶單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗中心設(shè)計原理，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，以復(fù)合蛋白酶加酶量、酶解溫度和酶解時間3個因素為自變量，以金槍魚魚骨肽提取率（Y）為響應(yīng)值，使用Design-Expert 13軟件設(shè)計復(fù)合蛋白酶酶解各因素的響應(yīng)面分析試驗。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

每次試驗做3個平行，利用Origin 2017、IBM SPSS、Design-Expert 13進行作圖和數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金槍魚魚骨粉的營養(yǎng)成分

金槍魚魚骨粉營養(yǎng)成分檢測結(jié)果見表1。

2.2 酶制劑的篩選

由圖1可知，影響金槍魚魚骨肽提取率的酶的種類順序為復(fù)合蛋白酶gt;胰蛋白酶gt;堿性蛋白酶gt;中性蛋白酶gt;風(fēng)味蛋白酶；對酶解液品評發(fā)現(xiàn)，單獨使用堿性蛋白酶和胰蛋白酶會造成酶解液出現(xiàn)較明顯的苦味，因此，從金槍魚魚骨肽提取率和苦味方面考慮，確定金槍魚魚骨肽提取最適用酶為復(fù)合蛋白酶。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 加酶量對金槍魚魚骨肽提取率的影響

復(fù)合蛋白酶酶解條件：料液比為1∶15，pH 為7.0，酶解溫度為50 ℃，酶解時間為5 h，自變量加酶量分別為300，400，500，600，700 U/g，試驗結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著復(fù)合蛋白酶添加量的逐漸增加，金槍魚魚骨肽提取率呈現(xiàn)快速上升趨勢，當(dāng)酶添加量達到500 U/g時，魚骨肽提取率達到34.2%，繼續(xù)提高加酶量，魚骨肽提取率增加不明顯，逐漸趨于平緩。說明在底物濃度一定的條件下，加酶量與魚骨肽的提取率呈正相關(guān)，但過量的酶不會增加底物與酶的結(jié)合位點，不會繼續(xù)提高魚骨肽提取率，因此，選擇500 U/g為本試驗的最適加酶量。

2.3.2 酶解溫度對金槍魚魚骨肽提取率的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，金槍魚魚骨肽提取率呈現(xiàn)快速上升趨勢，當(dāng)酶解溫度為50 ℃時，魚骨肽提取率達到最大值33.9%，然后呈現(xiàn)快速下降趨勢。這主要是由于酶解溫度與酶活性密切相關(guān)，初期溫度升高有利于酶活性的發(fā)揮，提高了魚骨肽的提取率，50 ℃為復(fù)合酶的最適酶解溫度，此時酶活力最大，酶解效果最好，超過50 ℃后繼續(xù)升高溫度會導(dǎo)致酶活降低甚至完全喪失，降低了魚骨肽的提取率，因此，選擇50 ℃為本試驗的最適酶解溫度。

2.3.3 酶解時間對金槍魚魚骨肽提取率的影響

由圖4可知，隨著酶解時間的延長，金槍魚魚骨肽提取率呈現(xiàn)先快速上升后趨于平緩的趨勢。在4.0～5.0 h區(qū)間內(nèi)，魚骨肽提取率從26.9%快速升高到34.2%，繼續(xù)延長酶解時間到6.0 h，魚骨肽提取率仍保持上升趨勢，但增加量僅為0.6%，說明魚骨中的蛋白質(zhì)在5.0 h內(nèi)基本都被降解成小分子的肽且溶解在酶解液中，因此，選擇5.0 h為本試驗的最適酶解時間。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，響應(yīng)面試驗設(shè)計見表2，試驗結(jié)果見表3。

利用Design-Expert 13對金槍魚魚骨肽提取率進行多元回歸擬合，得到二次多項式回歸模型方程：Y=4.13+0.115 7A－0.181 5B+0.108 4C－0.157 5AB+0.082 2AC－0.196 7BC－0.818 6A2－1.30B2－0.705 5C2。

根據(jù)二次多項式回歸模型方程，對響應(yīng)面試驗所得到的回歸模型方程進行方差分析，并對該模型各系數(shù)進行顯著性檢驗，得到的響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果見表4。

由表4可知，模型的Plt;0.000 1，說明該回歸模型已經(jīng)達到極顯著水平，失擬項的P=0.146 1gt;0.05，失擬項不顯著，說明該模型的擬合效果較好。模型一次項A、C極顯著，B顯著；二次項A2、B2、C2極顯著；交互項AB、AC極顯著，BC不顯著。校正相關(guān)系數(shù)R2為0.987 2，說明該模型的預(yù)測值與試驗值具有良好的響應(yīng)信號。上述數(shù)據(jù)表明，該試驗得到的模型與試驗數(shù)據(jù)擬合較好，可用該模型優(yōu)化和預(yù)測工藝參數(shù)，并利用該模型得到從金槍魚魚骨中提取魚骨肽的最佳試驗研究工藝。一次項中，加酶量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）這3個因素對魚骨肽提取率影響的主次順序為Agt;Cgt;B。

2.4.2 各因素之間交互作用及優(yōu)化

通過Design-Expert 13軟件對金槍魚魚骨肽提取率進行分析并繪制多元回歸模型方程的響應(yīng)曲面圖，由響應(yīng)曲面圖可以得出結(jié)論：三因素三水平的交互作用對響應(yīng)值的影響不是單一的線性關(guān)系，可以根據(jù)響應(yīng)面的陡峭程度來判斷3個因素交互作用的強度。響應(yīng)曲面圖中曲線越彎曲說明因素對響應(yīng)值的影響越大，等高線呈橢圓形說明因素間的交互作用顯著，等高線呈圓形說明因素間的交互作用不顯著，每條曲線上提取物質(zhì)量相同，圖形顏色的改變與提取物質(zhì)量相關(guān)，結(jié)果見圖5～圖7。

由圖5～圖7可知，復(fù)合蛋白酶的加酶量與酶解溫度交互作用的響應(yīng)面曲圖曲線較彎曲，等高線圖呈橢圓形，說明當(dāng)復(fù)合蛋白酶的加酶量一定時，隨著酶解溫度的持續(xù)升高，魚骨肽的提取率先逐漸增大，隨后減??；當(dāng)酶解溫度保持不變時，魚骨肽的提取率隨著復(fù)合蛋白酶加酶量的增加而增大，達到最大值后逐漸減小，表明兩者交互作用對響應(yīng)值的影響顯著。復(fù)合蛋白酶的加酶量與酶解時間交互作用的響應(yīng)面曲線較平坦，等高線呈現(xiàn)圓形，說明當(dāng)酶解時間一定時，隨著加酶量的增加，魚骨肽的提取率隨之增加，達到最大值后逐漸變??；當(dāng)加酶量一定時，魚骨肽的提取率隨著酶解時間的延長而升高，達到最大值后逐漸減小，表明兩者交互作用對響應(yīng)值的影響不顯著。酶解溫度與酶解時間交互作用的響應(yīng)面曲線彎曲程度較大，等高線呈現(xiàn)橢圓形，當(dāng)酶解溫度一定時，魚骨肽的提取率隨著酶解時間的延長而增加，達到最大值后開始減小；當(dāng)酶解時間一定時，魚骨肽的提取率隨著酶解溫度的升高而逐漸增大到最大值，隨后逐漸減小，表明兩者交互作用對響應(yīng)值的影響非常顯著。

2.4.3 響應(yīng)面最佳條件驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面分析得到最優(yōu)酶解條件為酶添加量626.51 U/g、酶解時間5.51 h、酶解溫度50.02 ℃，在此條件下最終試驗測得金槍魚魚骨肽提取率為34.31%。為了便于實際操作，將酶解條件修正為酶添加量 625 U/g、酶解時間5.5 h、酶解溫度50 ℃。在該條件下進行3次平行試驗，測得水解度為34.58%，與理論值接近，表明該模型適用于金槍魚魚骨肽酶解工藝的分析和預(yù)測。

2.5 金槍魚魚骨肽分子量分布和游離氨基酸檢測

對酶解后的金槍魚魚骨肽進行了分子量分布和低聚肽含量檢測，結(jié)果見圖8、表5和表6。

由圖8和表5可知，采用提取優(yōu)化工藝制備的金槍魚魚骨肽主要以小分子低聚肽為主，其中分子量≤1 kDa的低聚肽占比98.7%。由表6可知，提取的金槍魚魚骨肽中低聚肽含量占比較高，為91.7%，游離氨基酸含量為10.66 g/100 g，游離氨基酸中，精氨酸、亮氨酸、丙氨酸、賴氨酸含量相對較高，呈味氨基酸含量占比為26.4%，必需氨基酸含量占比為48.1%，開發(fā)利用價值較高。

3 結(jié)論

本文以超低溫金槍魚魚骨為研究對象，優(yōu)化了金槍魚魚骨肽的提取工藝，進行了金槍魚魚骨肽分子量分布、低聚肽含量和游離氨基酸含量的檢測。通過試驗確定最佳用酶為復(fù)合蛋白酶，利用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計得出最佳酶解工藝條件為加酶量625 U/g、酶解時間5.5 h、酶解溫度50 ℃、料液比1∶15、pH 7.0，在此條件下試驗測得金槍魚魚骨肽提取率為34.58%；采用該優(yōu)化工藝制備的金槍魚魚骨肽中低聚肽含量為91.7%，分子量≤1 kDa的低聚肽占比為98.7%，游離氨基酸含量為10.66 g/100 g，呈味氨基酸和必需氨基酸含量相對較高，是一種極具開發(fā)潛力的優(yōu)質(zhì)海洋蛋白肽資源。

參考文獻：

[1]高飛，徐劍宏，王晉，等.金槍魚營養(yǎng)價值及加工現(xiàn)狀研究進展[J].食品研究與開發(fā)，2023，44（15）：212-218.

[2]張成林，劉晃，徐皓，等.日本金槍魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及對中國的啟示[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2021，48（5）：10-17.

[3]農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局，全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，中國水產(chǎn)學(xué)會.中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2022：3-9.

[4]尚艷麗.金槍魚生魚片主要加工及運輸工藝的研究[D].舟山：浙江海洋學(xué)院，2013.

[5]ABEROUMAND A， FAZELI A. Comparison of analysis and the nutritional value of fresh common carp， frozen and southern canned tuna[J].Potravinarstvo Slovak Journal of Food Sciences，2019，13（1）：593-597.

[6]FERREIRO N， RODRIGUES N， VELOSO A C A， et al. Impact of the covering vegetable oil on the sensory profile of canned tuna of Katsuwonus pelamis species and tuna's taste evaluation using an electronic tongue[J].Chemosensors，2022，10（1）：18.

[7]丁偉璐，趙小慧，丁佳，等.酶解金槍魚加工下腳料制備蛋白粉加工工藝研究[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2014（10）：75-78.

[8]冷云，王慧云，陳海華，等.制備金槍魚皮膠原蛋白肽的預(yù)處理工藝研究[J].青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，30（3）：214-218.

[9]張楠，陳海華，冷云，等.金槍魚皮膠原蛋白肽分離純化工藝的研究[J].食品與機械，2014，30（5）：206-210.

[10]王聰艷.金槍魚魚皮膠原蛋白的分離制備、性質(zhì)及應(yīng)用研究[D].大連：大連工業(yè)大學(xué)，2019.

[11]辛建美.酶解金槍魚碎肉制備活性肽及其分離的研究[D].舟山：浙江海洋學(xué)院，2011.

[12]呂樂，丁慧璞，胡偉，等.金槍魚粉的酶解工藝及其酶解產(chǎn)物功能活性研究[J].食品工業(yè)科技，2020，41（3）：168-174.

[13]李桂芬，何定芬，鄭霖波，等.響應(yīng)面法優(yōu)化金槍魚蛋白抗痛風(fēng)活性肽制備工藝[J].浙江海洋大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2020，39（1）：41-50.

[14]徐茂琴，潘俊嫻，藺佳良，等.鰹魚血合肉風(fēng)味改良的研究[J].核農(nóng)學(xué)報，2014，28（8）：1430-1439.

[15]BOUTINGUIZA M， POU J， COMESANA R， et al.Biological hydroxyapatite obtained from fish bones[J].Materials Science and Engineering C，2012，32（3）：478-486.

[16]賈建萍，周彥鋼，林賽君，等.金槍魚骨營養(yǎng)成分分析[J].食品工業(yè)科技，2013，34（10）：334-337.