冬凌草及冬凌草甲素對類風濕關節(jié)炎血瘀證小鼠炎癥模型的影響

〔摘要〕 目的 研究中藥冬凌草（Rabdosia Rubescens， RR）及其主要活性成分冬凌草甲素（Oridonin， ORI）對類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）血瘀證小鼠炎癥模型的炎癥影響，為RA血瘀證提供新的治療藥物。方法 將C57BL/6雌性小鼠隨機分為對照組（Control組）、模型組（Model組）、低濃度RR組（L-RR組）、高濃度RR組（H-RR組）、低濃度ORI組（L-ORI組）、高濃度ORI組（H-ORI組），每組6只。除Control組外，其余5組小鼠雙側后肢足墊內(nèi)注射1次10 μL乳化的完全弗氏佐劑，背部皮下注射0.1 mg/kg鹽酸腎上腺素注射液2 h后，置于4 ℃冷水中游泳5 min，1次/d，連續(xù)7 d。L-RR組、H-RR組灌胃240、480 mg/（kg·d）的RR溶液，L-ORI組、H-ORI組腹腔注射20、40 mg/（kg·d）的ORI溶液，1次/d，連續(xù)14 d。每3天測量小鼠后足足掌的厚度；治療14 d后，稱量小鼠體質量，評估關節(jié)炎指數(shù)評分，ELISA法檢測足趾血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A， VEGFA）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素（interleukin， IL）-1β和IL-6濃度，HE染色、番紅固綠染色檢測踝關節(jié)組織破壞程度。結果 各組間體質量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與Contorl組比較，Model組關節(jié)腫脹、關節(jié)炎癥細胞浸潤、滑膜增生、軟骨被破壞，后足足掌厚度、關節(jié)炎指數(shù)評分及TNF-α、IL-6、IL-1β、VEGFA濃度均增加（P＜0.05）。與Model組比較，L-RR組、H-RR組、L-ORI組、H-ORI組關節(jié)腫脹癥狀減輕；H-RR組、L-ORI組、H-ORI組第22天后足足掌厚度降低（P＜0.05）；H-RR組、H-ORI組的關節(jié)炎指數(shù)評分降低（P＜0.05）；H-RR組、L-ORI組、H-ORI組TNF-α、IL-6、IL-1β濃度降低（P＜0.05）；H-RR組、L-ORI組、H-ORI組VEGFA濃度降低（P＜0.05）；L-RR組、H-RR組、L-ORI組、H-ORI組的踝關節(jié)組織中炎癥細胞浸潤、滑膜增生及軟骨破壞均減少。結論 RR、ORI可改善血瘀證RA小鼠模型關節(jié)腫脹、后足足掌厚度，降低關節(jié)炎指數(shù)評分及炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β和VEGFA的濃度，并能減少踝關節(jié)組織中炎癥細胞浸潤、滑膜增生及軟骨破壞，說明RR及其主要活性成分ORI具有治療RA血瘀證炎癥模型的作用，VEGFA可能作為RA血瘀證療效評估的指標。

〔關鍵詞〕 冬凌草；冬凌草甲素；類風濕關節(jié)炎；血瘀證；炎癥

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.11.007

Effects of Rabdosia Rubescens and oridonin on the inflammatory model of rheumatoid arthritis with blood stasis pattern in mice

HE Shoudi1，2， SUN Chenxia1， LIAO Weiquan2， LIAO Kanghan1， ZHU Huijun1， HUANG Shengguang1，

ZHANG Jianyong2*， TAN Ning1*

1. Rheumatology Department of Chinese Medicine， Shenzhen Hospital Collaborating with Huazhong University of Science and Technology， Shenzhen， Guangdong 518000， China; 2. Rheumatology Department， The Fourth Clinical Hospital of

Guangzhou University of Chinese Medicine， Shenzhen， Guangdong 518000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study the effects of Chinese medicine Rabdosia Rubescens （RR） and its main active ingredient oridonin （ORI） on inflammation in a mouse model of rheumatoid arthritis （RA） with blood stasis pattern， and provide new therapeutic drugs for the treatment of this disease. Methods The C57BL/6 female mice were randomized into Control group， Model group， low concentration RR （L-RR） group， high concentration RR （H-RR） group， low concentration ORI （L-ORI） group， and high concentration ORI （H-ORI） group，with six mice in each group. Except for Control group， the other five groups were injected with 10 μl of emulsified complete Freund's adjuvant into the foot pads of bilateral hind limbs once. Two hours after the subcutaneous injection of adrenaline hydrochloride 0.1 mg/kg on the back， they were placed in cold water at 4℃ for five minutes， once a day， for seven consecutive days. L-RR and H-RR groups were treated with RR solution at the doses of 240 mg/（kg·d） and 480 mg/（kg·d） respectively by gavage， while L-ORI and H-ORI groups were intraperitoneally injected with ORI solution at the doses of 20 mg/（kg·d） and 40 mg/（kg·d） respectively， once a day， for 14 consecutive days. The thickness of the hind paws of mice was examined every 3 days. After 14-day treatment， the body mass was measured and the arthritis index score was evaluated. Besides， ELISA was used to check the conc？鄄entrations of vascular endothelial growth factor A （VEGFA）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， and interleukin-6 （IL-6） in the toes of mice， while HE staining and safranin-fast green staining to assess the degree of the ankle joint tissue damage. Results There was no statistically significant difference in body mass among the six groups （Pgt;0.05）. Compared with Control group， Model group showed joint swelling， infiltration of inflammatory cells in the joints， synovial hyperplasia， and cartilage destruction with increases in the thickness of the hind paws， arthritis index score， as well as the concentrations of TNF-α， IL-6， IL-1β， and VEGFA （Plt;0.05）. Compared with Model group， L-RR， H-RR， L-ORI， and H-ORI groups showed alleviated joint swelling; H-RR， L-ORI， and H-ORI groups had decreased hind paw thickness after 22 days （Plt;0.05）; H-RR and H-ORI groups had reduced arthritis index scores （Plt;0.05）; H-RR， L-ORI， and H-ORI groups had lower concentrations of TNF-α， IL-6， and IL-1β （Plt;0.05）; H-RR， L-ORI， and H-ORI groups had lower VEGFA concentration （Plt;0.05）; L-RR， H-RR， L-ORI， and H-ORI groups all had reduced inflammatory cell infiltration， synovial hyperplasia， and cartilage destruction in the ankle joint tissue. Conclusion For a mouse model of RA with blood stasis pattern， RR and ORI can alleviate the joint swelling， decrease the hind paw thickness， lower the arthritis index scores and the concentrations of inflammatory factors including TNF-α， IL-6， IL-1β， and VEGFA， and reduce the inflammatory cell infiltration， synovial hyperplasia， and cartilage destruction in the ankle joint tissue. This indicates that RR and its main active ingredient ORI have therapeutic effects on the inflammatory model of RA with blood stasis pattern， and VEGFA may serve as an indicator for evaluating the efficacy of treatments for RA with blood stasis pattern.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Rabdosia Rubescens; oridonin; rheumatoid arthritis; blood stasis pattern; inflammation

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性對稱性關節(jié)滑膜炎癥為臨床特征的自身免疫性疾病。RA的早期癥狀包括全身乏力、關節(jié)腫脹、壓痛以及晨僵，后期導致軟骨破壞、關節(jié)畸形，甚至可引起心臟、腎臟、肺臟、消化道、肝臟、皮膚和神經(jīng)系統(tǒng)損傷[1]。RA在全世界的患病率為0.5%～1%[2]。RA病理機制是在多因素下造成免疫紊亂，刺激關節(jié)腔成纖維樣滑膜細胞類腫瘤樣增殖、血管翳形成，導致軟骨破壞和骨侵蝕，伴隨促炎細胞因子過度產(chǎn)生，進一步促進疾病進展[3]。RA在中國古籍中被記載為“骨痹”“鶴膝風”“歷節(jié)”等，而近代中醫(yī)大家將RA歸屬于“尪痹”范疇。正虛、邪侵和痰瘀是RA的主要病因病機。血瘀在RA發(fā)病過程中是主要致病因素，又是主要病機，貫穿于整個疾病的始終。

冬凌草（Rabdosia Rubescens，RR）是一種現(xiàn)代中藥，為唇形科香茶菜屬碎米婭的全草，全草為民間常用草藥，RR收載于《中華人民共和國藥典》2010年版、2015年版、2020年版[4-6]。RR味苦、甘，性微寒，具有清熱解毒、活血止痛的功效，主治咽喉腫痛、扁桃體炎、感冒、關節(jié)風濕痛、蛇蟲咬傷。目前，RR主要用于治療腫瘤、病毒感染，在關節(jié)腫痛、RA中的治療報道較少。冬凌草甲素（Oridonin，ORI）是RR的主要活性成分，具有較強的抗炎、抗腫瘤功效[7]。RA西醫(yī)治療主要以抗炎、抑制免疫為主。目前，治療RA的大多數(shù)藥物來源于抗腫瘤藥，而RR具有活血化瘀的功效，RR、ORI具有抗炎、抗腫瘤作用。因此，本研究建立RA血瘀證炎癥小鼠模型，初步探究RR及主要活性成分ORI對RA血瘀證炎癥小鼠模型的影響，為RR及ORI治療RA提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1" 實驗動物

36只6～7周齡雌性C57BL/6小鼠，體質量16～20 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（粵）2022-0002。小鼠在標準條件下，于深圳大學SPF級動物房飼養(yǎng)及實驗。本研究獲得深圳大學醫(yī)學部倫理委員會根據(jù)動物實驗控制和監(jiān)督委員會的批準（倫理號：A202200953）。

1.2" 主要試劑

RR片（中國河南省安陽市華安藥業(yè)有限公司，國藥準字號：Z41020054，批號：130289）；ORI（中國上海阿拉丁公司，批號：1910218）；完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）（美國Chondrex公司，批號：210370）；白細胞介素（interleukin，IL）-1β（批號：EK0394）、IL-6（批號：EK1093）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（批號：EK0527）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）（批號：AR1103）ELISA試劑盒均購自武漢博士德生物公司；改良番紅O-固綠軟骨染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1371）。

1.3" 主要儀器

全波長多功能酶標儀、低溫離心機、-80 ℃超低溫冰箱（美國Therm Fisher公司，型號：A51119500C、75002430、88600V）；顯微鏡（日本尼康公司，型號：LV150N）。

1.4" 動物分組

將36只小鼠隨機分為6組，對照組（Control組）、模型組（Model組）、低濃度RR組（L-RR組）、高濃度RR組（H-RR組）、低濃度ORI組（L-ORI 組）、高濃度ORI組（H-ORI組），每組6只。

1.5" RA血瘀證炎癥小鼠模型建立

采用CFA作為C57BL/6小鼠關節(jié)炎誘導劑。使用5 mL注射器反復抽吸CFA，直到CFA完全乳化后，形成油包水狀態(tài)。造模的第0天，在Model組、L-RR組、H-RR組、L-ORI組和H-ORI組動物的左、右后肢足墊內(nèi)皮下各注射1次0.01 mL完全乳化的CFA，Control組注射等體積的空氣。注射CFA同時進行RA血瘀證炎癥小鼠模型的造模[8]，以鹽酸腎上腺素注射液0.1 mg/kg劑量注射于Model組、L-RR組、H-RR組、L-ORI組和H-ORI組小鼠背部皮下，2 h后置于4 ℃冷水中游泳5 min，1次/d，連續(xù)7 d。

1.6" 藥物干預治療

L-RR組、H-RR組：根據(jù)人類每天的口服劑量及人與小鼠的體表面積比值進行換算[9]，小鼠的口服劑量濃度為0.002 6×2 g/20 g=487.5 mg/kg。L-RR組、H-RR組小鼠分別灌胃240、480 mg/（kg·d）RR溶液（溶于滅菌注射用水，每天分2次灌胃），共14 d。L-ORI組、H-ORI組：ORI的劑量、用法參考文獻[10]，L-ORI組、H-ORI組分別腹腔注射10、20 mg/（kg·d）的ORI（將ORI溶于濃度低于0.1%的DMSO中，1次/d），共14 d。Control組和Model組不做任何處理。

1.7" 小鼠體質量檢測、關節(jié)照相

治療第14天，用精密電子體質量計測量小鼠的體質量，高清相機拍攝小鼠右足關節(jié)腫脹照片。

1.8" 小鼠后足足掌厚度測量

治療第0、3、6、9、12、14天，用精密游標卡尺測量小鼠左、右側后足足掌厚度，求平均值。

1.9" 小鼠關節(jié)炎指數(shù)評分

通過對小鼠后足關節(jié)的腫脹評分評估藥物的效果。治療第14天評估小鼠足爪腫脹程度，從紅斑和水腫方面評估疾病嚴重程度。參照SEEUWS等[11]的關節(jié)炎指數(shù)評分評估方法，疾病的嚴重程度通過0～4分來量化。0分：無腫脹跡象；1分：肢體輕度紅腫；2分：肢體中度紅腫；3分：嚴重踝關節(jié)和跗跖關節(jié)受累或肢體輕度扭曲；4分：嚴重踝關節(jié)和全肢體紅腫、腫脹或扭曲。關節(jié)炎指數(shù)評分取每個小鼠后足左、右關節(jié)的評分總和的平均值。

1.10" 小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGFA檢測

治療第14天，收集左足踝組織，勻漿機研磨，3 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），收集上清液，根據(jù)小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGFA的ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGFA濃度。

1.11" 小鼠踝關節(jié)病理評估

在治療的第14天，處理動物后，摘除左踝關節(jié)，去掉踝關節(jié)表皮和毛，修剪踝關節(jié)。將踝關節(jié)組織放入4%多聚甲醛固定液中，4 ℃固定24 h。轉移至EDTA脫鈣液中進行脫鈣，每3天更換1次脫鈣液，脫鈣完全后進行脫水、透明、包埋、切片、脫蠟。進行HE染色及番紅固綠染色，顯微鏡下觀察踝關節(jié)的軟骨破壞及滑膜增生情況，通過滑膜組織病理分級進行評分[12]。0分：無浸潤跡象；1分：微小浸潤；2分：輕微浸潤；3分：中度浸潤；4分：嚴重浸潤。

1.12" 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，采用“ｘ±s”進行統(tǒng)計描述，兩組比較使用獨立樣本t檢驗，若方差齊，使用t檢驗，方差不齊使用t'檢驗；多組比較，若方差齊，使用SNK檢驗，若方差不齊，使用Dunnett T3檢驗。若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，兩組比較使用獨立樣本Mann-Whitney U檢驗；多組比較，使用Kruskal-Wallis檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1" RR及ORI對RA血瘀證炎癥小鼠體質量的影響

各組間體質量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.2" RR及ORI對RA血瘀證炎癥小鼠后足足掌厚度的影響

第7、10、13、16、19、22天，與Control組比較，其余各組后足足掌厚度均增加（P＜0.05）。第10天，與Model組比較，H-ORI組后足足掌厚度下降（P＜0.05）。第16天，與Model組比較，L-ORI組和H-ORI組后足足掌厚度明顯下降（P＜0.05）。第19天，與Model組比較，H-ORI組后足足掌厚度下降（P＜0.05）。第22天，與Model組比較，H-RR組、L-ORI組、H-ORI組后足足掌厚度明顯下降（P＜0.05）。詳見圖1。

2.3" RR及ORI對RA血瘀證炎癥小鼠關節(jié)腫脹的影響

與Control組比較，Model組小鼠整個右踝關節(jié)腫脹充血，關節(jié)變形。與Model組比較，L-RR組、H-RR組、L-ORI組及H-ORI組小鼠右踝關節(jié)腫脹充血程度減輕，而H-RR組、H-ORI組右踝關節(jié)腫脹充血減輕更明顯。詳見圖2。

2.4" RR及ORI對RA血瘀證炎癥小鼠關節(jié)炎指數(shù)評分的影響

與Control組比較，其余各組小鼠關節(jié)炎指數(shù)評分均升高（P＜0.05）。與Model組比較，H-RR組、H-ORI組小鼠關節(jié)炎指數(shù)評分均下降（P＜0.05）。詳見表2。

2.5" RR及ORI對RA血瘀證炎癥小鼠關節(jié)炎癥因子的影響

與Control組比較，其余各組TNF-α、IL-1β、IL-6濃度均升高（P＜0.05）。與Model組比較，H-RR組、L-ORI組、H-ORI組TNF-α、IL-1β、IL-6濃度均下降（P＜0.05）。與L-RR組比較，H-RR組、L-ORI組IL-1β濃度均下降（P＜0.05），H-ORI組IL-1β、IL-6濃度均下降（P＜0.05）。與H-RR組比較，H-ORI組IL-1β濃度下降（P＜0.05）。與L-ORI組比較，H-ORI組IL-1β濃度下降（P＜0.05）。詳見表3。

2.6" RR及ORI對RA血瘀證炎癥小鼠關節(jié)VEGFA的影響

與Control組比較，其余各組VEGFA濃度均升高（P＜0.05）。與Model組比較，H-RR組、L-ORI組、H-ORI組VEGFA濃度均下降（P＜0.05）。與L-RR組比較，H-RR組、L-ORI組、H-ORI組VEGFA濃度均下降（P＜0.05）。與H-RR組比較，H-ORI組VEGFA濃度下降（P＜0.05）。與L-ORI組比較，H-ORI組VEGFA濃度下降（P＜0.05）。詳見表4。

2.7" RR及ORI對RA血瘀證炎癥小鼠踝關節(jié)的影響

與Control組比較，Model組關節(jié)腔內(nèi)大量炎癥細胞浸潤、滑膜增生、關節(jié)軟骨變薄。治療后，L-RR組、H-RR組、L-ORI組、H-ORI組關節(jié)腔內(nèi)仍可見炎癥細胞浸潤、滑膜增生、軟骨破壞。與Model組比較，各組炎癥程度、滑膜增生、軟骨破壞減少，以H-RR組、H-ORI組改善較明顯。

與Control組比較，其余各組滑膜組織病理評分均升高（P＜0.05）。與Model組比較，H-RR組、L-ORI組、H-ORI組滑膜組織病理評分均下降（P＜0.05）。與L-RR組比較，H-ORI組滑膜組織病理評分下降（P＜0.05）。詳見圖3。

3 討論

RA以關節(jié)腫脹、畸形為主要表現(xiàn)，歸屬于中醫(yī)學“尪痹”范疇，血瘀證是尪痹常見證候之一[13]?；钛龇ㄊ荝A中醫(yī)治療的主要方法，血瘀證作為常見的中醫(yī)癥候，目前已有相關成熟的動物模型，而RA血瘀證模型也有報道。李茜等[8]通過在雌性SD大鼠的Ⅱ型膠原誘導關節(jié)炎模型基礎上，結合小劑量長期注射鹽酸腎上腺素和4 ℃冷水應激的方法，成功建立RA血瘀證動物模型，并將足趾腫脹度、關節(jié)炎指數(shù)、類風濕因子、TNF-α、血栓素A2、超敏C反應蛋白、紅細胞沉降率、關節(jié)病理作為評估RA血瘀證模型的量化指標。本研究參考其方法建立RA血瘀證小鼠炎癥模型，Model組足趾腫脹、關節(jié)評分、關節(jié)腫脹程度、炎癥因子、關節(jié)病理量化指標結果均與李茜等建立的模型一致，而關節(jié)紅腫疼痛體現(xiàn)了血瘀證“瘀血阻滯，不通則痛”的病機，細胞因子升高、關節(jié)病理滑膜炎癥損傷，體現(xiàn)了“因炎致瘀”的血瘀理論[14]。從多方面證明，初步建立RA血瘀證炎癥模型。

本研究使用不同濃度RR治療RA血瘀證炎癥模型，2015年版《中華人民共和國藥典》記載RR具有清熱解毒、活血止痛的功效[5]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，RR具有抗癌、抗炎作用[10，15]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，低濃度的RR能改善關節(jié)腫脹、關節(jié)病理的改變，高濃度的RR能降低炎癥因子的濃度，說明RR的療效與劑量有關。TNF-α、IL-1β和IL-6等是RA的主要炎癥因子[16-18]。VEGFA是RA血管翳形成的關鍵因素[19]。炎癥能誘導機體組織損傷、充血、滲出或細胞形態(tài)結構變化，炎癥因子能激活凝血系統(tǒng)，促進血小板聚集，促進血栓形成，與中醫(yī)學“因炎致瘀”理論相契合[13]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，RR能抑制炎癥因子、VEGFA的表達。因此，從炎癥方面論證了RR治療RA血瘀證的理論。而血管翳的形成是RA軟骨和關節(jié)破壞的主要原因[20]。在本研究中，RA血瘀證動物模型VEGFA濃度明顯上升，同時表現(xiàn)為血瘀的狀態(tài)，而使用RR及ORI治療后，RA血瘀證小鼠模型的血瘀癥狀改善，同時VEGFA濃度也不同程度下降。因此，推測VEGFA可以作為RA血瘀證模型判定的指標。為進一步探究RR的功效，同時使用RR的主要活性成分ORI治療RA血瘀證炎癥模型，本研究結果發(fā)現(xiàn)，低、高濃度的ORI均能改善RA血瘀證模型的關節(jié)腫脹、炎癥因子、關節(jié)病理，且高濃度的ORI效果更明顯，與RR結果相似。因此，推斷RR改善RA血瘀證模型的主要成分可能是ORI，而ORI結果進一步支持RR能治療RA血瘀證的猜測。

綜上所述，本研究從關節(jié)腫脹、關節(jié)病理、炎癥因子、血管內(nèi)皮細胞因子等方面證明RR、ORI治療RA血瘀證炎癥模型有效，表明RR及其活性成分ORI可能成為治療RA血瘀證的潛在藥物，VEGFA可能作為RA血瘀證的一個療效觀察指標。

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