基于Nrf2/NQO1/GCL信號(hào)通路探討益腎健腦方對(duì)血管性癡呆大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

〔摘要〕 目的 研究益腎健腦方對(duì)血管性癡呆（vascular dementia， VD）大鼠神經(jīng)元凋亡的影響及作用機(jī)制。方法 將60只SPF級(jí)大鼠隨機(jī)分為模型制備組50只和空白組10只，模型制備組分時(shí)段結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，空白組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎。術(shù)后4周通過(guò)Morris水迷宮篩選出模型制備成功大鼠28只，隨機(jī)分為模型組、多奈哌齊組（0.45 mg·kg-1·d-1）、益腎健腦方高劑量組（24.3 g·kg-1·d-1）、益腎健腦方低劑量組（12.15 g·kg-1·d-1）各7只，加上空白組10只，共5組。給藥4周后，行Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，HE染色觀察大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)組織病理變化，TUNEL染色觀察大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate-specific proteinase-3， Caspase-3）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-7（cysteinyl aspartate-specific proteinase-7， Caspase-7）蛋白表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)海馬組織核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-E2-related factor 2， Nrf2）、醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1， NQO1）、谷氨酰半胱氨酸連接酶（glutamate-cysteine ligase， GCL）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與空白組比較，模型組定位航行實(shí)驗(yàn)第5天逃避潛伏期明顯增加，空間探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯縮短（Plt;0.01）；模型組腦組織病理?yè)p傷明顯，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高（Plt;0.01）；模型組大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬CA1區(qū)Caspase-3、Caspase-7陽(yáng)性表達(dá)顯著升高（Plt;0.01）；模型組海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達(dá)顯著降低（Plt;0.01）。與模型組比較，多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組定位航行實(shí)驗(yàn)中第5天逃避潛伏期明顯縮短，空間探索實(shí)驗(yàn)中穿越平臺(tái)次數(shù)增加，目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)（Plt;0.05，Plt;0.01）；多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組腦組織病理?yè)p傷減少，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均顯著降低（Plt;0.01）；多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組Caspase-3、Caspase-7陽(yáng)性表達(dá)均顯著降低（Plt;0.01）；多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達(dá)均顯著升高（Plt;0.01）。結(jié)論 益腎健腦方可以改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、抑制Caspase-3和Caspase-7蛋白表達(dá)及減少神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制可能與激活Nrf2/NQO1/GCL信號(hào)通路有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 益腎健腦方；血管性癡呆；氧化應(yīng)激；凋亡；核因子E2相關(guān)因子2；醌氧化還原酶1；谷氨酰半胱氨酸連接酶

〔中圖分類號(hào)〕R255" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.11.006

Effects of Yishen Jiannao Formula on neuronal apoptosis in vascular dementia rats based on Nrf2/NQO1/GCL pathway

WANG Xinqiang1， HU Guoheng1， XIE Dan1，2， WANG Yan1，2， CHEN Ya1*， HE Piao1*

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects and mechanism of action of Yishen Jiannao Formula （YSJNF） on neuronal apoptosis in rats with vascular dementia （VD）. Methods Sixty SPF-grade rats were randomized into a model preparation group （n=50） and a blank group （n=10）. The model preparation group underwent staged ligation of the bilateral common carotid arteries， while the blank group had only separation of the bilateral common carotid arteries without ligation. Four weeks after surgery， 28 rats with successful model preparation， as confirmed by the Morris water maze test， were randomized into model group， donepezil group （0.45 mg·kg-1·d-1）， as well as high-dose （24.3 g·kg-1·d-1） and low-dose （12.15 g·kg-1·d-1） YSJNF groups， with seven rats in each group， coupled with the blank group （n=10）， totaling five groups. Four weeks after administration， Morris water maze was used to assess the learning and memory abilities of the rats. HE staining was employed to observe the histopathological changes in the cerebral cortex and hippocampal CA1 area， and TUNEL staining to evaluate the neuronal apoptosis in these areas. Immunohistochemistry was used to check the protein expression levels of cysteinyl aspartate-specific proteinase-3 （Caspase-3） and cysteinyl aspartate-specific proteinase-7 （Caspase-7） in the cerebral cortex and hippocampal CA1 area， and Western blot to examine the protein expression levels of nuclear factor-E2-related factor 2 （Nrf2）， quinone oxidoreductase 1 （NQO1）， and glutamate-cysteine ligase （GCL） in the hippocampal tissue. Results Compared with the blank group， the model group showed a significantly increased escape latency on the 5th day of the place navigation test， a significantly decreased number of the platform crossings in the spatial probe test， and a significantly shorter time spent in the target quadrant （Plt;0.01）; it also exhibited significant pathological damage of the brain tissue and a markedly increased neuronal apoptosis rate （Plt;0.01）; the positive expressions of Caspase-3 and Caspase-7 in the cerebral cortex and hippocampal CA1 area were significantly elevated （Plt;0.01）， while the protein expressions of Nrf2， NQO1， and GCL in the hippocampal tissue were notably reduced in this group （Plt;0.01）. Compared with the model group， the donepezil group and high- and low-dose YSJNF groups showed a significant reduction in the escape latency on the 5th day of the place navigation test， an increase in the number of platform crossings， and an obviously longer time spent in the target quadrant in the spatial probe test （Plt;0.05， Plt;0.01）; these groups also demonstrated reduced pathological damage in the brain tissue and a significant decrease in neuronal apoptosis rate （Plt;0.01）; furthermore， the positive expressions of Caspase-3 and Caspase-7 were significantly reduced （Plt;0.01）， while the protein expressions of Nrf2， NQO1， and GCL in hippocampal tissue were significantly elevated in these groups （Plt;0.01）. Conclusion YSJNF may improve the learning and memory abilities in VD rats， inhibit the protein expressions of Caspase-3 and Caspase-7， and reduce neuronal apoptosis， the mechanism of which may be related to the activation of the Nrf2/NQO1/GCL signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Yishen Jiannao Formula; vascular dementia; oxidative stress; apoptosis; nuclear factor-E2-related factor 2; quinone oxidoreductase 1; glutamate-cysteine ligase

血管性癡呆（vascular dementia， VD）是指腦卒中等腦血管疾病造成學(xué)習(xí)、記憶、行為相關(guān)腦區(qū)血流低灌注，從而導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能障礙的一組臨床綜合征。到2050年，全球癡呆患者預(yù)計(jì)達(dá)到1.52億人，其中VD患者約8 200萬(wàn)人，VD患者預(yù)后一般，可生存時(shí)間一般為8～10年，主要治療策略為對(duì)癥治療[1-3]。我國(guó)人口老齡化的加劇勢(shì)必伴隨著VD患者的增加，這對(duì)于照料者和社會(huì)而言都是沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]，預(yù)防和治療VD已成為臨床亟待解決的問(wèn)題。

海馬CA1區(qū)是大腦認(rèn)知功能腦區(qū)，其損傷先于自然衰老大鼠空間認(rèn)知的變化，急性腦卒中或長(zhǎng)期腦區(qū)血流低灌注所致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷是VD的病理基礎(chǔ)[5-7]。有研究表明，在腦組織缺血缺氧時(shí)會(huì)發(fā)生氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，引發(fā)神經(jīng)元凋亡，加劇海馬CA1區(qū)衰老退化，最終導(dǎo)致VD的發(fā)生[8]。因此，緩解神經(jīng)元氧化損傷和凋亡是防治VD的重要策略。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，中藥對(duì)氧化應(yīng)激和凋亡的調(diào)控作用逐漸得到證實(shí)，對(duì)VD防治療效良好。益腎健腦方是基于古方七福飲化裁而成，是第六批全國(guó)名老中醫(yī)專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)傳承指導(dǎo)老師胡國(guó)恒教授“腎腦同治”學(xué)術(shù)思想的體現(xiàn)，具有益腎生髓、化痰通絡(luò)的功效，治療VD臨床療效顯著。課題組前期研究證實(shí)，益腎健腦方可以促進(jìn)受損神經(jīng)元修復(fù)，改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[9]。為了進(jìn)一步研究益腎健腦方治療VD的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈分時(shí)段結(jié)扎（2-VO）法建立VD大鼠模型，觀察益腎健腦方抗氧化應(yīng)激損傷、抗凋亡的作用及其可能機(jī)制，為益腎健腦方的臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1" 動(dòng)物

雄性SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004]。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK（湘）2020-0010]，自由攝食飲水，實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審查批號(hào)：ZYFY20210813-37）。

1.2" 藥物及制備

益腎健腦方藥物組成：熟地黃20 g，酒山茱萸15 g，黃芪15 g，白參10 g，川芎10 g，石菖蒲15 g，紅景天10 g，丹參10 g，當(dāng)歸尾10 g，蜜遠(yuǎn)志10 g，炙甘草10 g。飲片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供，經(jīng)鑒定符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部的規(guī)定。常規(guī)方法煎煮，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原藥材濃度為2.43 g/mL，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。鹽酸多奈哌齊片（安理申）[衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H20050978，批號(hào)：2203026，5 mg/片]5 mg研成細(xì)粉末后溶于110 mL蒸餾水，配制成0.045 mg/mL溶液。

1.3" 主要試劑與儀器

兔抗核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-E2-related factor 2， Nrf2）抗體、鼠抗醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1， NQO1）、兔抗谷氨酰半胱氨酸連接酶（glutamate-cysteine ligase， GCL）抗體、兔抗β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（中國(guó)proteintech公司，批號(hào)：16396-1-AP、67240-1-Ig、12601-1-AP、20536-1-AP、SA00001-1、SA00001-2）；兔抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate-specific proteinase-3， Caspase-3）、兔抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-7（cysteinyl aspartate-specific proteinase-7， Caspase-7）抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab32351、ab255818）；TUNEL試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：KGA704）；二步法試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：PV-9004、ZLI-9017）；蘇木素伊紅染色液、RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：BL700A、P0013B）；蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司，批號(hào)：583794）；蛋白磷酸酶抑制劑（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：P1260）；顯影液、定影液（上海市佳信科技有限公司，貨號(hào)：BW-61、BW-62）；SuperECL Plus超敏發(fā)光液（美國(guó)Advansta公司，貨號(hào)：K-12045-D50）。

Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（型號(hào)：ZS-Morris，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；包埋機(jī)（型號(hào)：BMJ-A，常州市中威電子儀器有限公司）；石蠟切片機(jī)（型號(hào)：YD-315，金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；病理切片機(jī)（型號(hào)：RM2016，上海徠卡儀器有限公司）；雙目顯微鏡[型號(hào)：BA210T，麥克奧迪（廈門）醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司]；生物樣品均質(zhì)儀（型號(hào)：BioPrep-24，杭州奧盛儀器有限公司）；精密PH計(jì)（型號(hào)：PHS-3C，上海雷磁儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（型號(hào)：SMR60047，武漢優(yōu)爾生生命科學(xué)裝備有限公司）；搖床（型號(hào)：TS-1，江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)：H1650R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：DYY-6C、DYCZ-40D，北京六一生物科技有限公司）。

1.4" 模型制備與評(píng)價(jià)

60只SD大鼠隨機(jī)分為空白組10只、模型制備組50只，采用改良2-VO法（雙側(cè)頸總動(dòng)脈分次結(jié)扎法）制備VD模型[9]。大鼠術(shù)前禁食24 h、禁水4 h。麻醉、備皮、消毒，頸中切口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈后用5號(hào)無(wú)菌手術(shù)縫線結(jié)扎，完全阻斷右側(cè)頸總動(dòng)脈血流，縫合切口，在切口處均勻涂少量青霉素凍干粉，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在無(wú)菌手術(shù)臺(tái)進(jìn)行，確保無(wú)菌操作。7 d后結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，操作同第1次手術(shù)?？瞻捉M分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎，其余過(guò)程同模型制備組。將大鼠置于溫暖環(huán)境中，防止體溫過(guò)低，注意監(jiān)測(cè)大鼠的呼吸、心跳、體溫等，連續(xù)3 d注射青霉素8萬(wàn)U/250 g抗感染，增加大鼠存活率。

造模4周后，行Morris水迷宮中的定位航行試驗(yàn)，將水池劃分為第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，將平臺(tái)置于第Ⅳ象限，將清水注入迷宮并使水位在平臺(tái)上2 cm。前4 d為訓(xùn)練期，將大鼠依次按第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限放入水中，若大鼠未在120 s內(nèi)站上平臺(tái)，則人為引導(dǎo)至平臺(tái)上停留10 s，第5天從第Ⅱ象限將大鼠放入水中，大鼠爬上平臺(tái)的時(shí)間即為逃避潛伏期（escapelatency， EL），120 s未爬上平臺(tái)則記為120 s。以空白組大鼠EL平均值為參考值A(chǔ)，其余大鼠所測(cè)EL值為參考值B，以（B-A）/Bgt;20%為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，篩選出模型制備成功的VD大鼠28只。

1.5" 分組及給藥

將模型制備成功的28只VD大鼠分為模型組、多奈哌齊組、益腎健腦方高劑量組、益腎健腦方低劑量組，每組7只，加上空白組10只大鼠，共5組。按照人與大鼠體表面積折算給藥劑量，多奈哌齊組：成人每天服用5 mg生藥劑量進(jìn)行換算，換算后得出生藥劑量為0.45 mg·kg-1·d-1；益腎健腦方低劑量組：與70 kg成人等效劑量，以成人每天服用135 g生藥劑量進(jìn)行換算，換算后得出生藥劑量為12.15 g·kg-1·d-1；益腎健腦方高劑量組：益腎健腦方低劑量組兩倍量給藥，為24.3 g·kg-1·d-1?？瞻捉M和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，均連續(xù)干預(yù)4周。

1.6" 觀察指標(biāo)

1.6.1" Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)學(xué)習(xí)和記憶能力" 灌胃結(jié)束后，行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：詳細(xì)操作方法按照“1.4”，記錄各組大鼠第5天的逃避潛伏期；（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，第6天撤除平臺(tái)，將大鼠從第Ⅱ象限放入水中，水迷宮軟件記錄大鼠120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)區(qū)域次數(shù)和在第Ⅳ象限停留的時(shí)間。

1.6.2" HE染色觀察大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)組織病理變化" Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后禁食24 h，麻醉后脊椎脫臼處死大鼠，斷頭取腦，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片，HE染色后梯度乙醇（95%～100%）脫水，透明后中性樹膠封片，400倍顯微鏡觀察大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)組織病理變化。

1.6.3" TUNEL檢測(cè)大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況" 腦組織用多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋切片、脫蠟水化后進(jìn)行通透（熱修復(fù)抗原），1%高碘酸封閉，生物素封閉，Streptavidin-HRP標(biāo)記工作液標(biāo)記，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，晾干后加中性樹膠和蓋玻片，400倍光鏡下觀察拍照，IPP軟件分析神經(jīng)元凋亡率（黃褐色陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比）。

1.6.4" 免疫組織化學(xué)檢測(cè)大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)Caspase-3、Caspase-7蛋白表達(dá)水平" 取腦組織于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）抗原修復(fù)溶液處理，加入1%高碘酸滅活內(nèi)源性酶，滴加適當(dāng)稀釋的一抗Caspase-3（1∶200）、Caspase-7（1∶200），4 ℃過(guò)夜，PBS洗滌，滴加抗兔-IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片后顯微鏡下觀察，陽(yáng)性染色為黃色或棕黃色/褐色，采用IPP軟件測(cè)定平均光密度（累積光密度/陽(yáng)性表達(dá)面積）。

1.6.5" Western blot檢測(cè)海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達(dá)水平" 海馬組織低溫勻漿，裂解液裂解后離心，提取上清液蛋白，測(cè)定蛋白濃度后變性處理，制膠后上樣，通過(guò)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠75 V恒壓電泳，300 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉，稀釋后的一抗Nrf2（1∶1 000）、NQO1（1∶5 000）、GCL（1∶2 000）、β-actin（1∶5 000）4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后用稀釋HRP標(biāo)記的二抗（1∶6 000）孵育90 min，ECL顯色曝光后掃描，Image J軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白（β-actin）光密度為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7" 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用“ｘ±s”表示，多樣本計(jì)量資料符合正態(tài)分布和方差齊性者，進(jìn)行單因素方差分析，兩組之間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；方差不齊者，兩組之間比較用Dunnett's T3法。均以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" 益腎健腦方對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與空白組比較，模型組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)第5天逃避潛伏期明顯增加，空間探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯縮短（Plt;0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)中第5天逃避潛伏期均明顯縮短，空間探索實(shí)驗(yàn)中穿越平臺(tái)次數(shù)均增加，目標(biāo)象限停留時(shí)間均明顯延長(zhǎng)（Plt;0.05，Plt;0.01）。詳見(jiàn)圖1。

2.2" 益腎健腦方對(duì)VD大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬CA1區(qū)組織病理的影響

空白組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列規(guī)則緊密，細(xì)胞體形狀飽滿，輪廓清晰，細(xì)胞核核仁清晰無(wú)皺縮，染色質(zhì)分布均勻無(wú)凝集；模型組神經(jīng)元稀疏，排列不規(guī)則，細(xì)胞胞體腫脹，形狀不規(guī)則，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝集，細(xì)胞質(zhì)空泡狀；多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組神經(jīng)元排列相對(duì)緊密，細(xì)胞體形狀規(guī)則，可見(jiàn)少部分多邊形細(xì)胞體，細(xì)胞核核仁及染色質(zhì)相對(duì)清晰，偶見(jiàn)細(xì)胞核皺縮、染色質(zhì)凝集。詳見(jiàn)圖2。

2.3" 益腎健腦方對(duì)VD大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

空白組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬CA1區(qū)可散見(jiàn)少量黃褐色凋亡細(xì)胞；模型組見(jiàn)多量黃褐色凋亡細(xì)胞彌漫分布；多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組見(jiàn)黃褐色凋亡細(xì)胞散在分布，但數(shù)量明顯較模型組減少。與空白組比較，模型組大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高（Plt;0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均顯著降低（Plt;0.01）。詳見(jiàn)圖3。

2.4" 益腎健腦方對(duì)VD大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬CA1區(qū)Casepase-3、Casepase-7蛋白表達(dá)的影響

Caspase-3陽(yáng)性染色呈棕褐色，主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，Caspase-7陽(yáng)性染色呈棕黃色，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有表達(dá)。與空白組比較，模型組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬CA1區(qū)Caspase-3、Caspase-7陽(yáng)性表達(dá)顯著升高（Plt;0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬CA1區(qū)Caspase-3、Caspase-7陽(yáng)性表達(dá)均顯著降低（Plt;0.01）。詳見(jiàn)圖4—5。

2.5" 益腎健腦方對(duì)VD大鼠海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達(dá)顯著降低（Plt;0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組大鼠海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達(dá)均顯著升高（Plt;0.01）。詳見(jiàn)圖6。

3 討論

VD分為腦卒中后癡呆、皮質(zhì)下缺血性血管性癡呆、多發(fā)梗死性癡呆和混合型癡呆4種類型，發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，也無(wú)特效治療藥物[10]。VD患者的典型癥狀為認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)功能障礙和運(yùn)動(dòng)功能障礙，嚴(yán)重情況下可致人死亡，我國(guó)VD的患病率為1.1%～3.0%，年發(fā)病率在0.5%～0.9%[3]。隨著我國(guó)的低生育率及人口老齡化加劇，VD的患病率和發(fā)病率將進(jìn)一步增加，因此，對(duì)于VD的防治研究刻不容緩。腦組織主要由易于氧化的脂質(zhì)組成，耗氧量約占機(jī)體耗氧量的20%，因此，腦組織對(duì)氧化應(yīng)激損傷很敏感，慢性腦低灌注（chronic cerebral hypoperfusion， CCH）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡、突觸樹突減少和棘密度減低，是VD認(rèn)知障礙的重要因素[11-12]。

生理情況下，機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)?？寡趸到y(tǒng)分為酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)，酶類抗氧化系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、硒谷胱甘肽過(guò)氧化酶等，非酶類抗氧化系統(tǒng)主要包括維生素C、谷胱甘肽（glutathione， GSH）等，非酶類抗氧化系統(tǒng)是酶類抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生的基礎(chǔ)。因?yàn)槟X組織耗氧多且代謝旺盛，神經(jīng)元自身GSH含量不多，NQO1等抗氧化酶含量也較低，抗氧化系統(tǒng)薄弱，所以腦組織相對(duì)其他組織更容易受到氧化損傷，缺血缺氧后神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS消耗抗氧化物質(zhì)，使得GSH減少，SOD等抗氧化酶活性降低，對(duì)細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、DNA產(chǎn)生毒性作用，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡和老化[13]。Nrf2是重要的內(nèi)源性抗氧化因子，其下游有200多種基因，具有維持體內(nèi)氧化和抗氧化平衡、抑制炎癥和細(xì)胞凋亡等作用。生理狀態(tài)下，Nrf2和Kelch樣Ech相關(guān)蛋白1（Keap1）耦聯(lián)穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中，腦組織低灌注時(shí)，神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2與Keap1解離，易位到細(xì)胞核與ARE的特異識(shí)別位點(diǎn)相互結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)下游抗氧化酶NQO1表達(dá)和GSH合成[12，14]。NQO1是一種抗氧化酶，可抑制ROS產(chǎn)生，在氧化應(yīng)激過(guò)程中起到保護(hù)細(xì)胞的作用，GSH是體內(nèi)廣泛存在的重要抗氧化劑和自由基清除劑，GCL是GSH生物合成中的第一個(gè)限速酶，GSH與有毒的過(guò)氧化物發(fā)生還原反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激損傷[15]。

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，生理狀態(tài)下細(xì)胞凋亡對(duì)于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要作用，在神經(jīng)元缺血缺氧時(shí)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，則可通過(guò)啟動(dòng)程序基因調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生，引起神經(jīng)元變性，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[16]。細(xì)胞凋亡的激活有兩條途徑，分別是死亡受體通路（外部）和線粒體通路（內(nèi)部），無(wú)論是哪種途徑，都與Caspase蛋白酶家族密不可分，最終都會(huì)激活執(zhí)行死亡的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶Caspase-3和Caspase-7，Caspase-3和Caspase-7能對(duì)受損或異常細(xì)胞的DNA、細(xì)胞膜和細(xì)胞器等進(jìn)行剪切和降解，引起不可逆的細(xì)胞死亡過(guò)程。

VD屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”“呆病”范疇，腎虛腦髓失養(yǎng)是其病機(jī)關(guān)鍵。益腎健腦方以景岳名方七福飲為基礎(chǔ)加減而成，由熟地黃、酒山茱萸、黃芪、白參、川芎、石菖蒲、紅景天、丹參、當(dāng)歸尾、蜜遠(yuǎn)志、炙甘草組成，具有益腎生髓、化痰通絡(luò)之功效。方中以熟地黃、酒山茱萸為君藥，補(bǔ)益肝腎使腦髓得充，取“肝腎同源”之義；以黃芪、白參、紅景天為臣藥，補(bǔ)益脾胃化生氣血且大補(bǔ)元?dú)?，使腦得所養(yǎng)；以川芎、當(dāng)歸尾、丹參、石菖蒲、蜜遠(yuǎn)志為佐藥，化瘀通絡(luò)兼化痰益智；炙甘草為使藥，調(diào)和諸藥。

本研究采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈分時(shí)段結(jié)扎（2-VO）法建立VD大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低，大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元稀疏，細(xì)胞質(zhì)空泡狀，細(xì)胞核固縮，黃褐色凋亡細(xì)胞彌漫分布，神經(jīng)元凋亡水平上升，Caspase-3、Caspase-7蛋白表達(dá)升高，海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達(dá)水平降低，表明VD大鼠神經(jīng)元發(fā)生了氧化應(yīng)激及凋亡，且其引發(fā)的氧化應(yīng)激可以抑制Nrf2/NQO1/GCL信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)元凋亡；給予鹽酸多奈哌齊和益腎健腦方高、低劑量處理的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力提高，大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)病理?yè)p傷改善，神經(jīng)元凋亡水平下降，Caspase-3、Caspase-7蛋白表達(dá)降低，海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達(dá)水平升高，表明益腎健腦方可能通過(guò)激活Nrf2/NQO1/GCL信號(hào)通路來(lái)抑制神經(jīng)元凋亡，從而減輕氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元損傷，改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，益腎健腦方可通過(guò)激活Nrf2/NQO1/GCL信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激，減輕慢性腦灌注不足導(dǎo)致的大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，這可能是益腎健腦方防治VD、發(fā)揮其改善認(rèn)知障礙作用的機(jī)制之一。

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