調(diào)經(jīng)湯經(jīng)鐵死亡途徑干預(yù)早發(fā)性卵巢功能不全的網(wǎng)絡(luò)藥理靶點(diǎn)分析及活性成分預(yù)測

[摘要]"目的"通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)方法，探索臨床效方調(diào)經(jīng)湯通過鐵死亡途徑治療早發(fā)性卵巢功能不全（premature"ovarian"insufficiency，POI）的有效靶點(diǎn)和活性藥物成分預(yù)測。方法"通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)、用于傳統(tǒng)中藥分子機(jī)制挖掘生物信息學(xué)分析工具數(shù)據(jù)庫獲取調(diào)經(jīng)湯的活性成分和靶基因，使用人類基因綜合數(shù)據(jù)庫、藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫、Drugbank獲取POI的疾病靶點(diǎn)，并通過Venn獲取交集靶點(diǎn)。利用鐵死亡數(shù)據(jù)庫、Cytoscape及STRING軟件構(gòu)建調(diào)經(jīng)湯通過鐵死亡途徑治療POI的核心靶基因網(wǎng)絡(luò)。使用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)調(diào)經(jīng)湯治療POI和鐵死亡相關(guān)的預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體和生物學(xué)途徑富集分析。通過基因表達(dá)總表（gene"expression"omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫獲取POI疾病生物學(xué)差異基因進(jìn)一步提取關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分析，并通過分子對(duì)接驗(yàn)證活性小分子藥物成分結(jié)合力。結(jié)果"調(diào)經(jīng)湯13種中藥中共篩選出154種活性成分，與POI相關(guān)靶點(diǎn)101個(gè)，鐵死亡相關(guān)基因共23個(gè)。富集分析顯示主要涉及通路為磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate"3-kinase/protein"kinase"B，PI3K/Akt）信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路等。通過GEO數(shù)據(jù)庫篩得調(diào)經(jīng)湯通過鐵死亡途徑干預(yù)POI的關(guān)鍵靶點(diǎn)為糖原合成酶激酶3β（glycogen"synthase"kinase-3β，GSK-3β）、小窩蛋白-1（caveolin-1，CAV1）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian"target"of"rapamycin，mTOR）和蛋白激酶C"α（protein"kinase"C"alpha"gene，PRKCA），這些基因在POI疾病中表達(dá)量均降低。分子對(duì)接結(jié)果顯示CAV1-槲皮素、GSK-3β-木犀草素具有較穩(wěn)定的結(jié)合能力。結(jié)論""網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果提示鐵死亡途徑可能是調(diào)經(jīng)湯治療POI的重要機(jī)制，GSK-3β、CAV1、mTOR和PRKCA等靶點(diǎn)及PI3K/Akt信號(hào)通路或在其中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]"早發(fā)性卵巢功能不全；鐵死亡；生物信息學(xué)；調(diào)經(jīng)湯

[中圖分類號(hào)]"R271.1""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.24.006

Network"pharmacological"target"analysis"and"active"component"prediction"of"Tiaojing"decoction"intervention"in"premature"ovarian"insufficiency"by"ferroptosis"pathway

WANG"Weiyu，"YAN"Hang，"ZHANG"Wenyu，"MA"Decong，"WANG"Lu

Department"of"Gynecology，"the"Third"Affiliated"Hospital"of"Zhejiang"Chinese"Medicine"University，"Hangzhou"310005，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"explore"the"effective"target"and"active"ingredient"prediction"of"premature"ovarian"insufficiency"（POI）"treated"by"Tiaojing"decoction"by"ferroptosis"pathway"by"network"pharmacokogy"and"bioniformatics."Methods"The"active"ingredients"and"target"genes"of"Tiaojing"decoction"were"obtained"through"traditional"Chinese"medicine"systems"pharmacology"database"and"analysis"platform"（TCMSP）"and"bioinformatics"analysis"tool"for"molecular"mechanism"of"traditional"Chinese"medicine"databases，"disease"targets"for"POI"were"obtained"by"using"GeneCards，"therapeutic"target"database"and"Drugbank，"and"intersection"targets"were"obtained"by"Venn."Core"target"gene"network"of"Tiaojing"decoction"in"treatment"of"POI"were"constructed"through"the"ferroptosis"pathway"by"ferroptosis"database，"Cytoscape"and"STRING"software."Then，"the"DAVID"database"was"used"to"perform"gene"ontology"and"biological"pathway"enrichment"analysis"on"the"predicted"targets"related"to"ferroptosis"of"POI"treated"with"Tiaojing"decoction."Subsequently，"differential"genes"in"biology"related"to"POI"were"obtained"through"the"gene"expression"omnibus"（GEO）"database"for"further"extraction"of"key"targets，"and"the"binding"affinity"of"active"small"molecule"drug"components"were"verified"through"molecular"docking."Results"A"total"of"154"active"ingredients，"101"targets"related"to"POI"and"23"genes"related"to"ferroptosis"were"selected"from"13"kinds"of"traditional"Chinese"medicines"in"Tiaojing"decoction."The"enrichment"analysis"showed"that"the"main"involved"pathways"were"phosphatidylinositol-4，"5-bisphosphate"3-kinase/protein"kinase"B"（PI3K/Akt）"signaling"pathway"and"hypoxia"inducible"factor-1"signaling"pathway."Through"GEO"database"screening，"the"key"targets"of"Tiaojing"decoction"in"intervening"POI"through"ferroptosis"pathway"were"glycogen"synthase"kinase-3β"（GSK-3β），"caveolin-1"（CAV1），"mammalian"target"of"rapamycin"（mTOR）"and"protein"kinase"C"alpha"gene"（PRKCA），"all"expression"of"which"reduced"in"POI."The"results"of"molecular"docking"showed"that"CAV1-quercetin"and"GSK-3β-luteolin"had"stable"binding"ability."Conclusion"The"network"pharmacology"results"suggest"that"the"ferroptosis"pathway"may"be"an"important"mechanism"of"Tiaojing"decoction"in"treatment"of"POI，"GSK-3β，"CAV1，"mTOR，"PRKCA"and"other"targets，"as"well"as"PI3K/Akt"signaling"pathway，"may"play"important"roles"in"them.

[Key"words]"Premature"ovarian"insufficiency;"Ferroptosis;"Bioinformatics;"Tiaojing"decoction

早發(fā)性卵巢功能不全（premature"ovarian"insufficiency，POI）指在女性40歲之前出現(xiàn)的卵巢功能減退，主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常、促卵泡激素（follicle-stimulating"hormone，F(xiàn)SH）水平升高、雌激素波動(dòng)性下降[1]。由于雌激素分泌減少，常導(dǎo)致月經(jīng)不調(diào)和生育力低下甚至不孕[2]。過早喪失卵巢功能還可增加骨骼脆性及心血管和神經(jīng)認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，亟需探索有效的POI干預(yù)措施。

鐵死亡指受調(diào)節(jié)的細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而產(chǎn)生鐵依賴性累積達(dá)致死水平呈現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡[4]。研究證明鐵死亡在POI中發(fā)揮重要作用，堿核蛋白1（basonuclin"1，BNC1）通過神經(jīng)纖維素2重組蛋白?與Yes相關(guān)蛋白（recombinant"neurofibromin"2-Yes-associatednbsp;protein，NF2-YAP）途徑觸發(fā)卵母細(xì)胞鐵死亡導(dǎo)致卵泡過早活化和濾泡閉鎖過多，使BNC1突變的小鼠表現(xiàn)出POI癥狀[5]。因此卵巢相關(guān)功能細(xì)胞發(fā)生鐵死亡可能是POI疾病發(fā)生的重要病理過程。

調(diào)經(jīng)湯是陳木扇女科流派傳承人陳學(xué)奇醫(yī)師治療POI的經(jīng)驗(yàn)方，由當(dāng)歸、川芎、白芍、生地黃、熟地黃、白術(shù)、黃芪、山藥、香附、丹參、續(xù)斷、紫石英和淫羊藿組成，具有調(diào)和氣血、陰陽及肝、脾、腎的作用[6]。目前已有較多調(diào)經(jīng)湯的相關(guān)研究，但調(diào)經(jīng)湯能否通過鐵死亡途徑干預(yù)POI疾病進(jìn)程仍未明確[6-8]。本研究擬聯(lián)合生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，探究調(diào)經(jīng)湯治療POI的潛在機(jī)制，為調(diào)經(jīng)湯治療POI提供基礎(chǔ)研究支持。

1""材料和方法

1.1""網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1""調(diào)經(jīng)湯活性成分相關(guān)靶點(diǎn)的獲得與篩選""利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（traditional"Chinese"medicine"systems"pharmacology"database"and"analysis"platform，TCMSP）聯(lián)合用于傳統(tǒng)中藥分子機(jī)制挖掘生物信息學(xué)分析工具（bioinformatics"analysis"tool"for"molecular"mechanism"of"traditional"Chinese"medicine，BATMAN-TCM）數(shù)據(jù)庫獲取調(diào)經(jīng)湯活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)，利用UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因名稱標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.1.2""POI疾病靶點(diǎn)的獲得與篩選""基于人類基因綜合數(shù)據(jù)庫（GeneCards）、藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（therapeutic"target"database，TTD）、Drugbank數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“premature"ovarian"insufficiency（POI）”，建立POI相關(guān)靶點(diǎn)集合，去除重復(fù)數(shù)據(jù)，得到POI疾病靶點(diǎn)。

1.1.3""調(diào)經(jīng)湯活性成分治療POI潛在靶點(diǎn)的預(yù)測""運(yùn)用Draw"Venn"Diagram軟件導(dǎo)入活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)，取其交集得到調(diào)經(jīng)湯活性成分治療POI的潛在作用靶點(diǎn)。

1.1.4""調(diào)經(jīng)湯活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein"interaction，PPI）""運(yùn)用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，選擇Network"Analyzer對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，獲取核心靶點(diǎn)?？梢暬磉_(dá)中藥-活性成分-靶點(diǎn)的相互關(guān)系。同時(shí)將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING"11.0數(shù)據(jù)庫，刪除無相互作用的靶點(diǎn)，最后對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理。

1.1.5""鐵死亡機(jī)制相關(guān)靶點(diǎn)的獲取""基于鐵死亡數(shù)據(jù)庫（ferroptosis"database，F(xiàn)errDb）查找鐵死亡機(jī)制相關(guān)靶點(diǎn)，利用Venn"Diagram軟件篩選與1.1.4中核心靶點(diǎn)的交集部分，在Cytoscape軟件中利用cytoHubba插件篩選degree算法獲取最佳基因進(jìn)行可視化處理。

1.1.6""基因本體功能和京都基因與基因組百科全書通路富集分析""將調(diào)經(jīng)湯活性成分通過鐵死亡機(jī)制治療POI的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homo"sapiens”進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes，KEGG）通路富集分析和基因本體（gene"ontology，GO）功能分析，再將結(jié)果導(dǎo)入聯(lián)川數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行可視化處理。

1.2""GEO芯片差異性分析

在GEO數(shù)據(jù)庫中以“premature"ovarian"insufficiency”為關(guān)鍵詞，設(shè)置表達(dá)類型為“Expression"profiling"by"array”進(jìn)行篩選。利用R語言GEOquery包進(jìn)行讀取、數(shù)據(jù)下載，提取表達(dá)矩陣，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化，利用limma包以|log2FC|gt;1、Plt;0.05為條件進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)的差異性分析。采用ggplot"2包繪制火山圖，pheatmap包繪制熱圖。

1.3""GEO芯片中重要差異基因表達(dá)量提取

將調(diào)經(jīng)湯通過鐵死亡機(jī)制干預(yù)POI疾病的核心靶點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)換，篩選GEO芯片中的交集差異基因表達(dá)，以柱狀圖形式呈現(xiàn)基因表達(dá)差異。

1.4""分子對(duì)接

對(duì)調(diào)經(jīng)卵湯治療POI的排名靠前的主要候選化合物與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)由蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（ProteinData"bank，PDB）、對(duì)接小分子庫由Pubchem通過搜索中藥活性成分獲取并建立。使用Discovery"Studio"2019"Client"軟件進(jìn)行受體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備工作。隨后在Dock"Ligands中進(jìn)行精準(zhǔn)分子對(duì)接，找到結(jié)合能最佳匹配的蛋白復(fù)合物與配體進(jìn)行圖像展示。

2""結(jié)果

2.1""調(diào)經(jīng)湯活性成分及靶點(diǎn)

基于TCMSP、BATMAN-TCM等數(shù)據(jù)庫共獲得調(diào)經(jīng)湯的活性成分179種，其中當(dāng)歸2種、川芎7種、白芍13種、生地黃2種、熟地黃2種、白術(shù)7種、黃芪15種、山藥16種、香附18種、丹參65種、續(xù)斷8種、淫羊藿24種，見圖1。對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)117個(gè)。

2.2""調(diào)經(jīng)湯通過鐵死亡途徑治療POI的相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測

從GeneCards、TTD、DrugBank等數(shù)據(jù)庫得到疾病靶點(diǎn)6308個(gè)，與調(diào)經(jīng)湯靶點(diǎn)取交集后得到共同靶點(diǎn)101個(gè)，見圖2A。進(jìn)一步將101個(gè)共同靶點(diǎn)與FerrDb數(shù)據(jù)庫取交集，得到鐵死亡相關(guān)基因共23個(gè)。其中包括與炎癥、免疫相關(guān)的白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、V-rel網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞病毒癌基因同源物A（V-rel"reticuloendotheliosis"viral"oncogene"homolog"A，RELA），與氧化損傷相關(guān)的低氧誘導(dǎo)醌氧化還原酶1[NAD（P）H"dehydrogenase，quinone"1，NQO1]、核因子（網(wǎng)織紅細(xì)胞衍生2）樣2（nuclear"factor"erythroid"2-related"factor"2，NFE2L2），與缺氧死亡相關(guān)的HIF-α，與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化相關(guān)的糖原合成酶激酶-3β（glycogen"synthase"kinase-3β，GSK-3β）、促分裂原活化蛋白激酶8"（mitogen-activated"protein"kinase"8，MAPK8）、表皮生長因子受體（epidermal"growth"factor"receptor，EGFR）等，見圖2B。

2.3""調(diào)經(jīng)湯通過鐵死亡機(jī)制干預(yù)POI相關(guān)基因富集分析

GO富集分析顯示，涉及生物過程（biological"process，BP）153個(gè)條目，細(xì)胞組分（cellular"component，CC）22個(gè)條目，分子功能（molecular"function，MF）47個(gè)條目，將BP、CC、MF結(jié)果按P值大小升序排列后，其中排名前10位的富集信息在聯(lián)川生物云平臺(tái)進(jìn)行可視化分析，見圖3A。結(jié)果顯示藥物作用靶點(diǎn)與有絲分裂細(xì)胞周期的正向調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等BP有關(guān)；與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、染色質(zhì)及轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等CC有關(guān)；與蛋白結(jié)合、酶結(jié)合及DNA結(jié)合等MF有關(guān)。KEGG分析顯示共涉及55個(gè)信號(hào)通路，其中排名靠前的通路有pathways"in"cancer、PI3K/Akt信號(hào)通路、叉頭框蛋白O信號(hào)通路（forkhead"box"O"signaling"pathway，F(xiàn)oxO），見圖3B。

2.4""GEO數(shù)據(jù)庫中篩選野生型與POI小鼠基因表達(dá)差異

通過對(duì)GSE194196數(shù)據(jù)庫基因差異表達(dá)富集分析后，發(fā)現(xiàn)其中336個(gè)基因在POI中顯著上調(diào)，502個(gè)基因在POI中顯著下調(diào)，見圖4A。通過熱圖分析找到表達(dá)差異程度，見圖4B。這些差異表達(dá)基因中與前述鐵死亡相關(guān)POI差異基因共同篩選得到4個(gè)核心基因：CAV1、GSK-3β、mTOR、PRKCA，其在數(shù)據(jù)集中的表達(dá)差異顯著，見圖4C～圖4F。

2.5""信號(hào)通路

在對(duì)2.3中鐵死亡機(jī)制下調(diào)經(jīng)湯干預(yù)POI的KEGG通路分析中，PI3K/Akt通路是排名靠前的作用通路；在對(duì)2.4差異基因分析中發(fā)現(xiàn)最核心的差異表達(dá)基因GSK3β、mTOR、PRKCA均在PI3K/Akt通路上發(fā)揮作用，見圖5。

2.6""分子對(duì)接

基于活性成分與潛在作用靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，將核心靶點(diǎn)蛋白與藥物活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合熱能越低提示受體與配體結(jié)合性越好，分子對(duì)接結(jié)果見表1。結(jié)果提示槲皮素-CAV1、木犀草素-GSK3β具有較穩(wěn)定的結(jié)合能力，使用DS軟件對(duì)其進(jìn)行可視化分析，見圖6。

A."GSE194196數(shù)據(jù)集中上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因，其中紅色實(shí)心點(diǎn)圖代表上調(diào)表達(dá)基因，藍(lán)色實(shí)心點(diǎn)圖代表下調(diào)表達(dá)基因；B."差異表達(dá)基因在各組樣本中的表達(dá)水平熱圖，紅色代表高表達(dá)基因，藍(lán)色代表低表達(dá)基因。C.～F."GSE194196數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)基因與前述鐵死亡相關(guān)POI差異基因。C."CAV1基因；D."GSK3β基因；E."mTOR基因；F."PRKCA基因。*Plt;0.05，#Plt;0.01

3""討論

POI在中醫(yī)學(xué)中根據(jù)其臨床表現(xiàn)歸于“月經(jīng)后期”“不孕癥”“閉經(jīng)”等范疇，《陳素庵婦科補(bǔ)解》調(diào)經(jīng)總論中記載陳木扇女科調(diào)經(jīng)特色思想，POI可參照其中“經(jīng)水后期方論”“經(jīng)水不當(dāng)絕而絕方論”等論治[9-10]。陳學(xué)奇醫(yī)師結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為POI的發(fā)生涉及腎、脾、肝及心四臟的生理功能，在卵泡發(fā)育過程中腎氣充盛、脾胃健運(yùn)、肝氣疏泄有度、心主血脈有節(jié)才可使氣血旺盛通暢、沖任通盛、血海滿溢、卵泡成熟并排出、月經(jīng)如期來潮；當(dāng)腎虛精虧、肝脾失調(diào)、心火上炎則會(huì)沖任失調(diào)、卵泡發(fā)育困難或卵子雖成熟卻難以排出，終至經(jīng)停[11-12]。因此，陳學(xué)奇醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)以調(diào)經(jīng)湯治療POI，治以補(bǔ)腎為主，佐以健脾、疏肝、養(yǎng)心，補(bǔ)虛瀉實(shí)，使氣血通暢、陰陽平衡、血海充盈、胞宮及卵巢得養(yǎng)[11，13]。

調(diào)經(jīng)湯中當(dāng)歸、白芍補(bǔ)血養(yǎng)肝；川芎活血調(diào)經(jīng)；生熟地黃滋陰養(yǎng)血補(bǔ)腎，促進(jìn)卵泡發(fā)育；黃芪、山藥、白術(shù)益氣健脾，固本培元；續(xù)斷、紫石英和淫羊藿溫腎助陽，改善黃體功能；香附、丹參活血化瘀，使補(bǔ)而不滯，滋而不膩，使氣血生化有源，氣機(jī)調(diào)暢，以達(dá)滋陰扶陽補(bǔ)腎、和氣理氣養(yǎng)血的功效。本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)經(jīng)湯中槲皮素及木犀草素是發(fā)揮抗鐵死亡作用的重要活性成分。分子對(duì)接結(jié)果顯示槲皮素-CAV1、木犀草素-GSK-3β具有較穩(wěn)定的結(jié)合能力。槲皮素存在于黃芪中，是一種天然黃酮類化合物，具有強(qiáng)大的抗氧化和抗炎作用[14]。卵巢細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化是發(fā)生鐵蓄積的前提，也是卵巢功能下降的重要原因[15]。研究表明，一方面，槲皮素可逆轉(zhuǎn)顆粒細(xì)胞線粒體功能障礙及通過PGC1-α途徑激活線粒體生物發(fā)生，抑制去乙?；?介導(dǎo)的超氧化物歧化酶2賴氨酸68乙?；?，從而增加顆粒細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，改善卵巢功能[16]；另一方面，木犀草素存在于丹參中，同樣具有強(qiáng)大的抗氧化作用。木犀草素可通過核因子E2相關(guān)因子2信號(hào)通路，促進(jìn)抗氧化劑谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione"peroxidase，GPx）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（chloramphnicolnbsp;acetyltransferase，CAT）、谷胱甘肽等表達(dá)，改善大鼠卵巢形態(tài)，保護(hù)卵巢功能[17]。

通過對(duì)4個(gè)鐵死亡相關(guān)基因功能分析，確定GSK-3β、CAV1、mTOR和PRKCA為卵巢功能細(xì)胞的保護(hù)基因。其中GSK-3β參與PI3K/Akt信號(hào)通路、FoxO和Wnt信號(hào)通路（Wnt"signaling"pathway，WNT）等多條信號(hào)通路傳導(dǎo)。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)WNT2可抑制小鼠顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中GSK-3β的表達(dá)，幫助細(xì)胞周期G1到S的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞增殖。CAV1是一種膜結(jié)合支架蛋白，調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、細(xì)胞死亡和脂質(zhì)代謝，參與抗氧化[19]。已有研究表明，女性卵巢中CAV1基因表達(dá)下調(diào)可影響Notch2信號(hào)通路，導(dǎo)致富含亮氨酸的含有G蛋白偶聯(lián)受體5的重復(fù)序列減少，從而導(dǎo)致POI[20]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已證實(shí)CAV1是鐵死亡“抑制劑”[21]。此外，mTOR是細(xì)胞生長和增殖的重要調(diào)節(jié)基因。在小鼠卵泡中，mTOR通路于排卵前在顆粒細(xì)胞丘細(xì)胞中被選擇性激活以促進(jìn)卵泡發(fā)育和存活[22]。Han等[23]發(fā)現(xiàn)通過活化AMPK-mTOR信號(hào)通路傳導(dǎo)和降低GPX4表達(dá)水平來增強(qiáng)自噬可誘導(dǎo)鐵死亡。而PRKCA是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和轉(zhuǎn)移的功能[24]。在卵母細(xì)胞中，抑制PRKCA表達(dá)可破壞PI3K/Akt通路的傳導(dǎo)，抑制細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂[25]。本研究篩選的GEO數(shù)據(jù)集中，POI患者PRKCA表達(dá)顯著低于對(duì)照組，可見PRKCA的差異表達(dá)在POI的細(xì)胞鐵死亡過程中值得關(guān)注。

本研究的GO和KEGG富集分析表明，調(diào)經(jīng)湯可通過調(diào)控PI3K/Akt、低氧誘導(dǎo)因子-1、FoxO信號(hào)通路作用于POI疾病過程，這反映中藥復(fù)方多靶點(diǎn)多通路的治療策略。4個(gè)核心靶基因中GSK-3β、CAV1和mTOR是PI3K/Akt通路上的重要節(jié)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)卵泡的發(fā)育受PI3K信號(hào)通路的幾種成分調(diào)節(jié)，包括Akt、GSK-3α和GSK-3β[26]；卵母細(xì)胞中PTEN特異性缺失可通過PI3K誘導(dǎo)Akt活化，從而觸發(fā)原始卵泡活化[27]。不僅如此，Akt家族中的Akt1發(fā)生磷酸化后，可磷酸化一系列抑制增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的下游靶蛋白，包括FoxO3a、Bcl-xL/Bcl-2相關(guān)死亡啟動(dòng)子和mTOR，在卵泡顆粒細(xì)胞的死亡和卵母細(xì)胞的周期進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[28]?？梢奝I3K途徑對(duì)卵母細(xì)胞生長和卵泡活化很重要。因此，結(jié)合本研究對(duì)GEO數(shù)據(jù)集的信息提取，筆者發(fā)現(xiàn)卵巢細(xì)胞中多種鐵死亡相關(guān)基因差異表達(dá)或可解釋POI的發(fā)生機(jī)制。

綜上所述，調(diào)經(jīng)湯治療POI是一個(gè)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的過程。調(diào)經(jīng)湯通過GSK-3β、CAV1、mTOR、PRKCA和PI3K/Akt等參與調(diào)節(jié)卵巢功能細(xì)胞鐵死亡過程。同時(shí)，本研究利用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證調(diào)經(jīng)湯中活性成分與POI中鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)之間的相互作用，為進(jìn)一步探索其分子機(jī)制提供依據(jù)。但由于中藥復(fù)方成分的多樣性和作用機(jī)制的復(fù)雜性，單純依靠網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)對(duì)其預(yù)測具有一定局限性。為更好地解釋調(diào)經(jīng)湯通過調(diào)控細(xì)胞鐵死亡治療POI的機(jī)制，還需進(jìn)一步開展藥物質(zhì)譜分析及體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

[1] CHON"S"J，"UMAIR"Z，"YOON"M"S."Premature"ovarian"insufficiency："Past，"present，"and"future[J]."Front"Cell"Dev"Biol，"2021，"9："672890.

[2] EBRAHIMI"M，"AKBARI"ASBAGH"F."Pathogenesis"and"causes"of"premature"ovarian"failure："An"update[J]."Int"J"Fertil"Steril，"2011，"5（2）："54–65.

[3] WESEVICH"V，"KELLEN"A"N，"PAL"L."Recent"advances"in"understanding"primary"ovarian"insufficiency[J]."F1000Res，"2020，"9："1101.

[4] SUN"Y，"CHEN"P，"ZHAI"B，"et"al."The"emerging"role"of"ferroptosis"in"inflammatio"[J]."Biomednbsp;Pharmacother，"2020，"127："110108.

[5] WANG"F，"LIU"Y，"NI"F，"et"al."BNC1"deficiency-triggered"ferroptosis"through"the"NF2-YAP"pathway"induces"primary"ovarian"insufficiency[J]."Nat"Commun，"2022，"13（1）："5871.

[6] 王璐，"林運(yùn)霞，"嚴(yán)航，"等."基于數(shù)據(jù)挖掘的陳學(xué)奇教授治療早發(fā)性卵巢功能不全用藥規(guī)律研究[J]."中國中醫(yī)藥科技，"2021，"28（3）："390–393.

[7] 劉希萍，"劉佳俐，"陳學(xué)奇，"等."基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)比較調(diào)經(jīng)湯與促排卵西藥的作用機(jī)制——以卵巢早衰為例[J]."浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，"2022，"46（6）："579–591.

[8] 沈煒，"陳學(xué)奇."調(diào)經(jīng)湯對(duì)卵巢早衰模型大鼠卵巢功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]."浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，"2017，"27（12）："1040–1043，"1012.

[9] 陳學(xué)奇，"葛蓓芬."《陳素庵婦科補(bǔ)解》調(diào)經(jīng)特色淺析[J]."浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，"2018，"42（5）："374–376.

[10] 楊威，"于崢，"劉寨華."《陳素庵婦科補(bǔ)解》診療思想述要[J]."中醫(yī)雜志，"2012，"53（11）："978–980.

[11] 陳學(xué)奇，"葛蓓芬."卵巢早衰的中醫(yī)治法體會(huì)[J]."浙江中醫(yī)雜志，"2016，"51（10）："703–704.

[12] 陳學(xué)奇，"葛蓓芬."陳木扇女科學(xué)術(shù)思想淺述[J]."中醫(yī)雜志，"2012，"53（14）："1240–1242.

[13] 陳學(xué)奇，"葛蓓芬."從五臟調(diào)治月經(jīng)病探析[J]."中華中醫(yī)藥雜志，"2020，"35（8）："3978–3981.

[14] BOOTS"A"W，"HAENEN"G"R，"BAST"A."Health"effects"of"quercetin："From"antioxidant"to"nutraceutical[J]."Eur"J"Pharmacol，"2008，"585（2-3）："325-337.

[15] 耿子翔，"聶小麗，"劉鵬，"等."電針對(duì)卵巢早衰小鼠鐵死亡的影響[J]."上海針灸雜志，"2023，"42（2）："175–181.

[16] CHEN"Y，"ZHAO"Y，"MIAO"C，"et"al."Quercetin"alleviates"cyclophosphamide-induced"premature"ovarian"insufficiency"in"mice"by"reducing"mitochondrial"oxidative"stress"and"pyroptosis"in"granulosa"cells[J]."J"Ovarian"Res，"2022，"15（1）："138.

[17] HUANG"Y，"ZHANG"X."Luteolin"alleviates"polycystic"ovary"syndrome"in"rats"by"resolving"insulin"resistance"and"oxidative"stress[J]."Am"J"Physiol"Endocrinol"Metab，"2021，"320（6）："1085–1092.

[18] WANG"H"X，"LI"T"Y，"KIDDER"G"M."WNT2"regulates"DNA"synthesis"in"mouse"granulosa"cells"through"beta-catenin[J]."Biol"Reprod，"2010，"82（5）："865–875.

[19] YUN"J"H，"LEE"D"H，"JEONG"H"S，"et"al."STAT3nbsp;activation"in"microglia"exacerbates"hippocampal"neuronal"apoptosis"in"diabetic"brains[J]."J"Cell"Physiol，"2021，"236（10）："7058–7070.

[20] HUANG"K，"DANG"Y，"ZHANG"P，"et"al."CAV1"regulates"primordial"follicle"formation"via"the"Notch2"signalling"pathway"and"is"associated"with"premature"ovarian"insufficiency"in"humans[J]."Hum"Reprod，"2018，"33（11）："2087–2095.