周期素依賴性蛋白激酶抑制物1A相互作用鋅指蛋白1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義

[摘要]"目的"分析結(jié)直腸癌組織中周期素依賴性蛋白激酶抑制物1A相互作用鋅指蛋白1（Ciz1）的表達(dá)情況并探討其在臨床診斷和治療中的潛在意義。方法"采用免疫組化技術(shù)和Western"blot法，對結(jié)直腸癌組織、正常癌旁結(jié)直腸組織中Ciz1表達(dá)水平進(jìn)行檢測、對比。結(jié)果"結(jié)直腸癌組織原發(fā)灶表中，Ciz1明顯增加，陽性率與正常組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。采用Western"blot法定量分析，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織Ciz1的表達(dá)量為0.32±0.03，正常大腸黏膜組織中的表達(dá)量為0.11±0.01，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。Ciz1在結(jié)直腸癌組織中過度表達(dá)與多個臨床病理特征密切相關(guān)。患者的年齡、性別、腫瘤部位、分化程度，以及是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與此并無關(guān)聯(lián)（均Pgt;0.05）。結(jié)直腸癌組織中Ciz1的表達(dá)水平升高，與結(jié)直腸癌的T分期（P=0.018）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.022）以及美國癌癥聯(lián)合委員會（American"Joint"Committee"on"Cancer，AJCC）分期（P=0.017）密切相關(guān)。結(jié)論"Ciz1在腫瘤分期過程中參與了腫瘤的發(fā)展和擴(kuò)散。可以預(yù)見Ciz1有望成為一項新的標(biāo)志物，用于評估結(jié)直腸癌患者的預(yù)后情況。

[關(guān)鍵詞]"Ciz1；結(jié)直腸癌；免疫組化

[中圖分類號]"R735.3""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.23.017

Expression"and"clinical"significance"of"Ciz1"in"colorectal"cancer

CAO"Jin，"GAO"Fangyuan，"SUN"Shengbo，"ZHANG"Huanhu，"HAN"Chuanji，"GONG"Qing，"LI"Gangxing

Department"of"Gastrointestinal"Surgery，"Weihai"Municipal"Hospital"Affiliated"to"Shandong"University，"Weihai"264202，"Shandong，"China

[Abstract]"Objective"To"observe"the"expression"of"ciz1"in"human"colorectal"cancer"tissues"and"analyse"the"relationship"between"their"expression"and"clinicopathologic"features."Methods"We"detected"the"expression"of"Ciz1"and"Ciz1"mRNA"by"immunohistochemistry"and"Western"blotting."The"relationship"between"the"expression"of"ciz1"and"clinicopathologic"features"was"analied."Results"According"to"immunohistochemical"results，"Ciz1"showed"significant"high"expression"in"the"primary"lesion"of"colorectal"cancer"tissue，"compared"to"normal"adjacent"tissues"（66.7%"vs."35.0%，"P=0.001）."Through"Western"blot"analysis，"it"was"found"that"the"relative"expression"level"in"colorectal"cancer"tissue"was"0.32"±"0.03，"while"in"normal"colorectal"mucosal"tissue"it"was"0.11"±"0.01."In"addition，"the"relative"expression"level"of"Ciz1"in"colorectal"cancer"tissue"was"significantly"higher"than"that"in"normal"intestinal"mucosal"tissue"（Plt;0.05）."The"study"found"that"the"overexpression"of"Ciz1"in"colorectal"cancer"tissue"is"significantly"correlated"with"the"T"stage"（P=0.018），"lymph"node"metastasis"（P=0.022），"and"AJCC"stage"（P=0.017）"of"the"cancer."The"age，"gender，"tumor"location，"degree"of"differentiation，"and"the"presence"of"distant"metastasis"of"patients"were"not"correlated"with"this"（Pgt;0.05）."The"expression"level"of"Ciz1"in"colorectal"cancer"tissue"is"significantly"increased，"which"is"closely"related"to"the"T"stage"（P=0.018），"lymph"node"metastasis"（P=0.022），"and"American"Joint"Committee"on"Cancer"stage"（P=0.017）"of"colorectal"cancer."Conclusion"This"association"suggests"that"Ciz1"may"play"an"important"role"in"tumor"staging，"participating"in"the"development"and"spread"of"tumors."Therefore，"it"can"be"foreseen"that"Ciz1"is"expected"to"become"a"new"biomarker"for"evaluating"the"prognosis"of"colorectal"cancer"patients.

[Key"words]"Ciz1;"Colorectal"cancer;"Immunohistochemical

周期素依賴性蛋白激酶抑制物1A相互作用鋅指蛋白1（以下簡稱Ciz1）作為CDK2抑制劑p21Cip1/Waf1的重要相互作用蛋白，在細(xì)胞調(diào)控機(jī)制中扮演著不可或缺的角色[1]。研究表明，Ciz1涉及哺乳動物DNA復(fù)制過程，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等諸多關(guān)鍵生物學(xué)活動中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用[2]。Ciz1在多種癌癥組織中的表達(dá)水平上升，Ciz1可能與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。事實上，已有研究報道了Ciz1在肺癌、膽囊癌等多種癌癥中的高表達(dá)現(xiàn)象[3]。

研究表明，早期肺癌患者血液中Ciz1變種（Ciz1-b）可能成為一種新型、非侵入性的早期肺癌診斷標(biāo)志物[4]。本研究目的是使用免疫組化和蛋白印跡技術(shù)，對Ciz1在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和正常癌旁組織中的表達(dá)水平進(jìn)行比較分析。

1""資料與方法

1.1""一般資料

選取2023年1月至12月威海市立醫(yī)院60例患者的新鮮結(jié)直腸癌組織和其癌旁正常組織樣本，男性37例，女性為23例；年齡36～85歲，其中36例年齡在60歲及以上，24例年齡在60歲以下。其中結(jié)腸癌36例，直腸癌24例。根據(jù)結(jié)直腸癌美國癌癥聯(lián)合委員會（American"Joint"Committee"on"Cancer，AJCC）分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，在患者群體中，Ⅰ/Ⅱ期共有32例患者，Ⅲ/Ⅳ期則有28例。均經(jīng)過明確病理診斷和手術(shù)切除。高度分化37例，中低分化23例，T1～T2期26例、T3～T4期34例。其中出現(xiàn)局部淋巴轉(zhuǎn)移的有21例。同時，39名患者未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，3名患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。所有樣本采集經(jīng)威海市立醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)（倫理審批號：2020057）。

1.2""免疫組織化學(xué)染色

處理大腸癌蠟塊組織標(biāo)本時，每個樣本要準(zhǔn)備2張組織切片（每張4μm）。第一張采用HE染色法，明確病理；第二張采用免疫組織化學(xué)染色法，完成之后將其放在59℃恒溫烤箱內(nèi)，時間約1h左右，以確保與載玻片緊密黏附。隨后依次執(zhí)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)和封閉內(nèi)源性過氧化物酶位點等操作步驟。為了提高實驗效果，在勾畫范圍時最好添加抗體，并有效限制范圍防止抗體浪費，之后用PBS洗滌干凈。隨后滴加特定抗體：例如使用兔源多克隆人Ciz1抗體，并在4℃冰箱中培育約12h。整晚放置在4℃常溫冰箱后，執(zhí)行3次PBS液沖洗處理，接著進(jìn)行DAB顯色、蘇木精復(fù)染和乙醇梯度脫水處理。最終進(jìn)行封面鏡檢步驟同時設(shè)置對照組：其中一部分以PBS替代特定抗體，其他流程不變；作為陽性對照則采用已知Ciz1高表達(dá)的肺癌組織樣本。

根據(jù)文獻(xiàn)[9]，在對癌旁正常組織切片進(jìn)行操作時，需要以Ciz1的判讀標(biāo)準(zhǔn)為基準(zhǔn)。評估每張切片時，要結(jié)合標(biāo)記指數(shù)（labelling"index，LI）和染色強(qiáng)度對其進(jìn)行評分。按照標(biāo)記指數(shù)計分方式來看：當(dāng)LI≤5%時，0分；LI為5%～25%，1分；LI為25%～50%，2分；LI為50%～75%，3分；LI≥75%，4分。染色強(qiáng)度同樣采用四級評分標(biāo)準(zhǔn)：若樣本無著色0分；呈淡黃色1分；染色為黃色2分；當(dāng)染色達(dá)到棕黃色時得最高，3分。這一評分過程需要兩位專業(yè)的病理科技術(shù)人員共同參與，以確保評分的準(zhǔn)確性和客觀性。參考下定義Ciz1的表達(dá)水平：0～2為陰性（–），3～5為弱陽性（+），6～8為陽性（++），9～12則視為強(qiáng)陽性（+++）。（-～+）代表Ciz1低表達(dá)，（++～+++）表示Ciz1高表達(dá)[10]"。

1.3""蛋白免疫印跡技術(shù)

首先提取蛋白樣品，接著準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用BCA法測定蛋白濃度。隨后，根據(jù)Ciz1蛋白的分子量為91kDa，在此基礎(chǔ)上選擇6%的SDS-PAGE分離膠配制凝膠進(jìn)行電泳。進(jìn)行完電泳后，執(zhí)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育步驟，并隨后顯影樣品以計算灰度值。

1.4""統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS"19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，采用χ2檢驗，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""Ciz1表達(dá)情況

Ciz1在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)陽性特征，分布集中在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部，黃色顆粒狀。高表達(dá)Ciz1中，顆粒為深濃棕黃色。觀察結(jié)直腸癌組織與癌旁組織的Ciz1表達(dá)情況，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。染色強(qiáng)度評分結(jié)直腸癌組織中Ciz1高表達(dá)率達(dá)66.7%，在正常癌旁組織中的高表達(dá)率則較低為35.0%，結(jié)直腸癌和正常組織Ciz1表達(dá)量Western"blot法檢測結(jié)果見圖2。

2.2""結(jié)直腸癌組織中Ciz1的表達(dá)情況與患者臨床病理特征的關(guān)系

60個結(jié)直腸癌原發(fā)灶的實驗樣本中，有40個樣本顯示出Ciz1蛋白高表達(dá)水平（++～+++）。Ciz1蛋白的過表達(dá)與結(jié)直腸癌的T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及AJCC分期之間存在的相關(guān)性（Plt;0.05），見表1。

3""討論

研究結(jié)果顯示Ciz1在多種腫瘤標(biāo)本和腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)的高度表達(dá)現(xiàn)象[11-12]。這涵蓋了多種類型癌癥，如肺癌、膽囊癌等。研究者認(rèn)為Ciz1可能與一系列關(guān)鍵細(xì)胞周期蛋白相互作用，如細(xì)胞周期蛋白A、E，p21Cip1/Waf1，CDC6或CDK2，對于惡性腫瘤發(fā)展、發(fā)展均有一定的影響。部分癌癥細(xì)胞周期蛋白A1的過度表達(dá)，也惡性細(xì)胞侵襲風(fēng)險、增殖等原因有關(guān)[13]。E1，一種與癌癥有關(guān)的調(diào)節(jié)器，有過度表達(dá)的情況出現(xiàn)。對于細(xì)胞來說，其周期調(diào)控的關(guān)鍵是對CDK活性進(jìn)行有效調(diào)節(jié)。而且需要和對應(yīng)細(xì)胞周期素相結(jié)合，才能對細(xì)胞周期進(jìn)程起到調(diào)節(jié)的作用。

研究表明，肺癌在早期診斷中，可以通過患者血液中的Ciz1-b來判斷。采用蛋白檢測，判斷Ciz1-b可診斷患者是否處在一期肺癌中。同樣的檢測方法對于SCLC、NSCLC來說，其準(zhǔn)確率已高達(dá)98%[4]。這說了Ciz1完全可以作為肺癌腫瘤標(biāo)志物的檢測，以及未來治療中的新靶點。在大腸癌中的表現(xiàn)同樣如此。在本研究中，對包括60個結(jié)直腸癌原發(fā)灶的實驗樣本進(jìn)行了分析。其中，有40個樣本顯示出Ciz1蛋白高表達(dá)水平（++～+++）。將這些數(shù)據(jù)和患者多個臨床病理特點結(jié)合在一起，包括性別、腫瘤具體位置、腫瘤分化度等。本研究發(fā)現(xiàn)Ciz1蛋白的過表達(dá)與結(jié)直腸癌的T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及AJCC分期之間存在的相關(guān)性（Plt;0.05）。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中Ciz1表達(dá)明顯升高，與結(jié)直腸癌T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、AJCC分期等均有關(guān)系。這說明Ciz1和結(jié)直腸癌的病理分期有著緊密的關(guān)系，可能成為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的新標(biāo)準(zhǔn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

• MITSUI"K，"MATSUMOTO"A，"OHTSUKA"S，"et"al."Cloning"and"characterization"of"a"novel"p21（Cip1/Waf1）-"interacting"zinc"finger"protein，"Ciz1[J]."Biochem"Biophys"Res"Commun，"1999，"264（2）："457–464.
• LIU"Q，"NIU"N，"WADA"Y，"et"al."The"role"of"cdkn1A-interacting"zinc"finger"protein"1"（CIZ1）"in"DNA"replication"and"pathophysiology[J]."Int"J"Mol"Sci，"2016，"17（2）："212.
• RAHMAN"F"A，"AZIZ"N，"COVERLEY"D."Differential"detection"of"alternatively"spliced"variants"of"Ciz1"in"normal"and"cancer"cells"using"a"custom"exon-junction"microarray[J]."BMC"Cancer，"2010，"10："482.
• HIGGINS"G，"ROPER"K"M，"WATSON"I"J，"et"al."Variant"Ciz1"is"a"circulating"biomarker"for"early-stage"lung"cancer[J]."Proc"Natl"Acad"Sci"U"S"A，"2012，"109（45）："E3128–E3135.
• ZHANG"D，"WANG"Y，"DAI"Y，"et"al."CIZ1"promoted"the"growth"and"migration"of"gallbladder"cancer"cells[J]."Tumour"Biol，"2015，"36（4）："2583–2591.
• XIAO"J，"VEMULA"S"R，"XUE"Y，"et"al."Motor"phenotypes"and"molecular"networks"associated"with"germline"deficiency"of"Ciz1[J]."Exp"Neurol，"2016，"283（Pt"A）："110–120.
• MOSCOVICH"M，"LEDOUX"M"S，"XIAO"J，"et"al."Dystonia，"facial"dysmorphism，"intellectual"disability"and"breast"cancer"associated"with"a"chromosome"13q34"duplication"and"overexpression"of"TFDP1："Case"report[J]."BMC"Med"Genet，"2013，"14："70.