尼克酰胺轉甲基酶通過介導細胞內活性氧影響肝癌細胞鐵死亡的作用研究

[摘要]"目的"探究尼克酰胺轉甲基酶介導細胞內活性氧（reactive"oxygen"species，ROS）在肝癌細胞鐵死亡中的影響及其機制。方法"選取2019年3月至2020年2月于筆者醫(yī)院接受治療的40例原發(fā)性肝細胞癌患者作研究對象，分別取患者的癌旁組織標本及肝癌組織標本。使用串聯液相質譜儀檢測細胞中甲基尼克酰胺（methyl"nicotinamid，MNA）表達，使用流式細胞儀檢測ROS及過氧化脂質的平均熒光強度，采用蛋白質印跡法（Western"blot）法檢測人肝癌細胞（SK-Hep-1、Hep3B）細胞表達的情況變化。采用免疫組化法檢測癌旁組織、肝癌組織中尼克酰胺轉甲基酶（nicotinamide"N-methyltransferase，NNMT）及ROS水平，采用CCK-8法檢測不同鐵濃度細胞的生存活性。結果"肝癌組織組中的MNA水平較癌旁組織組有所提升差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。與癌旁組織組比較，肝癌組織組的ROS平均熒光強度表達升高，過氧化脂質平均的熒光強度表達降低，SK-Hep-1、Hep3B細胞表達量上升，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。與對照組比較，NNMT組2、10、20及25μmol/L的細胞生存活性水平升高（Plt;0.05）。與NNMT組比較，鐵抑制組不同鐵濃度（2μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、25μmol/L）的細胞生存活性表達下降差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。結論"經尼克酰胺轉甲基酶介導可引導產生ROS及能量紊亂，提高了腫瘤細胞的死亡率。

[關鍵詞]"肝癌；尼克酰胺轉甲基酶；細胞內活性氧；鐵死亡

[中圖分類號]"R735.7""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.23.007

Study"on"the"effect"of"NNMT"enzyme"on"iron"death"of"hepatocellular"carcinoma"cells"by"mediating"ROS

WANG"Jinchun1，"DAI"Yongqing1，"WANG"Yaqing1，"CHEN"Jue1，"LIU"Zuping2"，"LI"Yejia3

1.Department"of"Blood"Transfusion，"Affiliated"Hospital"of"Shaoxing"University，"Shaoxing"312000，"Zhejiang，"China;"2.Department"of"Pathology，"Affiliated"Hospital"of"Shaoxing"University，"Shaoxing"312000，"Zhejiang，"China;"3.Department"of"Clinical"Laboratory，"Affiliated"Hospital"of"Shaoxing"University，"Shaoxing"312000，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"explore"the"effect"of"nicotinamide"transmethylase"on"intracellular"reactive"oxygen"species"（ROS）"in"iron"death"of"hepatocellular"carcinoma"cells"and"its"mechanism."Methods"Methyl"nicotinamide"（MNA）"expression"in"cells"was"detected"using"a"tandem"liquid"chromatography-mass"spectrometry."The"average"fluorescence"intensity"of"ROS"and"lipid"peroxidation"was"measured"using"a"flow"cytometer."Western"blot"was"used"to"detect"changes"in"the"expression"of"human"liver"cancer"cells"（SK-Hep-1，"Hep3B）."Forty"patients"with"primary"hepatocellular"carcinoma"who"received"treatment"in"our"hospital"from"March"2019"to"February"2020"were"selected"as"the"study"subjects，"and"their"adjacent"tissue"samples"and"liver"cancer"tissue"samples"were"collected."Immunohistochemical"methods"were"used"to"detect"the"levels"of"nicotinamide"N-methyltransferase"（NNMT）"and"ROS"in"adjacent"and"liver"cancer"tissues."CCK-8"method"was"used"tonbsp;detect"the"survival"activity"of"cells"with"different"iron"concentrations."Results"The"MNA"levels"in"the"liver"cancer"tissue"group"were"higher"than"those"in"the"adjacent"tissue"group"（Plt;0.05）."Compared"with"the"adjacent"tissue"group，"the"average"fluorescence"intensity"expression"of"ROS"in"the"liver"cancer"tissue"group"increased，"while"the"average"fluorescence"intensity"expression"of"lipid"peroxidation"decreased"（Plt;0.05）."Compared"with"the"adjacent"tissue"group，"the"expression"levels"of"SK"Hep-1"and"Hep3B"cells"in"the"liver"cancer"tissue"group"increased"（Plt;0.05）."Compared"with"the"control"group，"NNMT"groups"2，"10，"20，"and"25"μmol/L"The"cell"survival"activity"level"increased"（Plt;0.05）;"Compared"with"the"NNMT"group，"the"iron"inhibition"group"had"different"iron"concentrations"（2μmol/L，"10μmol/L，"20μmol/L，"25μmol/L."The"expression"of"cell"viability"decreased"（Plt;0.05）."Conclusion"ROS"mediated"by"nicotinamide"methyltransferase"can"be"guided"to"produce"ROS"and"energy"disorders，"leading"to"increased"tumor"cell"death.

[Key"words]"Liver"cancer;"Nicotinamide"methyltransferase;"Intracellular"reactive"oxygen"species;"Ferroptosis

肝細胞癌為原發(fā)性肝癌中的重要類型（gt;80%），其死亡率位居世界腫瘤疾病第2位，目前新發(fā)肝細胞癌例數及病死率不斷上升[1]。對于早期肝細胞癌患者實施肝移植、肝臟切除或是局部消融有利于改善患者預后，而肝硬化或晚期肝細胞癌患者預后治療效果較差[2-3]。尼克酰胺轉甲基酶（nicotinamide"N-methyltransferase，NNMT）是甲基轉移酶家族中依賴于S-腺苷甲硫氨酸的一員，屬于肝臟組織中較高表達的代謝酶，NNMT主要針對外源性化合物及多類藥物給予生物性解毒與轉化，也參與尼克酰胺的代謝過程，尤其是經甲基化之后對尼克酰胺的清除可幫助調節(jié)細胞中尼克酰胺的表達[4-5]。同時NNMT在人體疾病狀況與健康狀況下都有較廣的生物學能力，如NNMT能夠在調節(jié)肝臟及脂肪代謝中有所參與，與胃癌、胰腺癌、肝癌等多類癌癥的進展或是其他類型的癌細胞轉移及入侵有關，此外NNMT在機體中表達較高時具備保護性和致病效果，這與NNMT下游效應器激活及組織分布相關[6]。

細胞內活性氧（reactive"oxygen"species，ROS）在肝臟組織細胞中的積聚可造成細胞自噬、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic"acid，DNA）受損、耐藥等多種類生物學作用，且經對細胞中ROS表達進行調節(jié)，可有助于腫瘤細胞凋亡。研究表明，ROS可能參與了腫瘤細胞鐵死亡過程[7]?；诖耍狙芯刻接慛NMT是否與ROS反應相關聯，以及后者是否有助于誘導體內肝癌細胞出現鐵死亡，為臨床靶向治療肝細胞癌提供有利參考。

1""材料與方法

1.1""實驗材料

人肝癌細胞系SK‐Hep‐1、Hep3B和正常肝細胞系（中國科學院上海細胞庫）；RPMI-1640培養(yǎng)基（上海百賽生物技術股份有限公司，貨號：10-040-CM）；光鏡（廣州市明美光電技術有限公司，型號：MF52-N）；Lipofectamine"TM"2000轉染試劑（11668019）（北京百奧創(chuàng)新科技有限公司）；磷酸緩沖液（phosphate"buffer，PBS）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，型號：P196987-500ml）；CCK-8液體（漢恒生物工程（上海）有限公司，HB-CCK-8-500T）；酶標檢測儀（美谷分子儀器（上海）有限公司，型號：SpectraMax"iD5）；ROS試劑盒流式細胞儀（上海頂儀科技有限公司，型號：FACSCalibur）；蛋白質定量試劑盒（BCA試劑盒）（賽默飛世爾科技，貨號：23221-23230）；Hoechst"33342染色（北京索萊寶科技有限公司，貨號：C0031）。

1.2""培養(yǎng)與檢測方法

1.2.1""細胞培養(yǎng)""選擇SK-Hep-1（高表達"NNMT）和Hep3B（低表達"NNMT）兩種肝癌細胞株與正常肝細胞（對照組）進行實驗。將5%青鏈霉素混合液+10%"胎牛血清+RPMI-1640培養(yǎng)基放溫度5%CO2、37℃、飽和濕度的環(huán)境下予以培養(yǎng)，每24h觀察細胞的生長情況，平均48h對培養(yǎng)基予以更換或是傳代，光鏡下SK-Hep-1、Hep3B細胞貼壁成長，細胞呈現圓形或多邊形。

1.2.2""細胞轉染""用含有shRNA-NNMT"慢病毒對SK-Hep-1"細胞轉染，獲取低表達NNMT的細胞株；經構建NNMT"質粒對Hep3B"細胞進行轉染，獲取NNMT高表達的細胞株，或于Hep3"B細胞培養(yǎng)液內放MNA以發(fā)揮補充NNMT的效果。

1.2.3""轉染效率驗證""采用實時熒光定量（real"time"polymerase"chain"reaction，RT-PCR）法測定NNMT的轉染效率，在NNMT轉染24h后取各組的細胞，提取RNA，用Takara反轉錄試劑盒行反轉錄，獲取總cDNA，用Primer5.0軟件設計引物序列，開啟PCR儀，反應條件：94"℃預變性2"s、97℃"6s、65℃"30s，共循環(huán)45次，通過2-△△Ct方法算出NNMT的表達量，反應體系：0.5"μl"上下游引物、2μl""cDNA模板、8"μl""SYB"Green，放蒸餾水到25"μl"。Notch1引物序列：上游：5’-AGCTGGAGAAGTGGCTGAAG-3’，下游：5’-"TGGACCCTTGACTCTGTTCC-3’，內參GAPDH引物序列：上游：5’-GATTGGAATCTGGCTACT-3’，下游：5’-TAGGGCTGAAGACAGGG-3’。重復試驗3次。

1.2.4""串聯液相質譜儀檢測細胞中MNA的表達""使用串聯液相質譜儀及試劑盒測定每組細胞中MNA表達，步驟主要按試劑盒說明書予以完成。試驗重復3次。

1.2.5""流式細胞儀檢測ROS及過氧化脂質的平均熒光強度""集取細胞，用PBS清洗，按ROS試劑盒說明書的步驟進行操作，加ROS試劑，在避光環(huán)境中培養(yǎng)30min，用流式細胞儀測定每組的ROS、過氧化脂質的平均熒光強度。

1.2.6""Western"blot法檢測NNMT表達""取70%～"80%生長密度的SK-Hep-1、Hep3B細胞，按每孔細胞3×105個在6孔板內接種，待細胞貼壁24h之后培養(yǎng)至50～60%時，后PBS沖洗細胞2次，加入蛋白裂解液（RIPA的裂解液）60μl"，放于冰上裂解（4min），收集蛋白的裂解液，在6℃、8min、轉速10"000r/min下給予離心處理，分離清液，用BCA法檢測細胞濃度，在電泳處理、轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）內、脫脂奶粉5%后進行2h密封。5℃環(huán)境中培養(yǎng)，過夜，后用0.1%"Tris"鹽緩沖液（TBS+Tween，TBST）進行洗膜，加入靜電式揚聲器（electrostatic"loudspeaker，ESL）給予曝光、顯影處理，以獲得每組SK-Hep-1、Hep3B細胞表達量。

1.2.7""免疫細胞形態(tài)學檢測""首先將癌旁組織及癌組織樣本切片，分別用NNMT"抗體、Perl鐵染色試劑及ROS"熒光施以Hoechst"33342染色，且陰性對照組反應同時實施，無放抗體的步驟。通過使用四級評分系統(tǒng)對染色強度進行表示（陰性=0、低于5%，弱陽=+1、6%～24%，中度陽=+2、25%～50%，強陽=+3、高于50%），以5%閾值作陽性標準，免疫組化法染色的結果主要通過2名病理學?？漆t(yī)師予以檢測。

1.2.8""CCK-8法檢測不同鐵濃度細胞的生存活性""首先培養(yǎng)SK-Hep-1、Hep3B細胞直到對數生長時期，重懸消化，于96孔板內以細胞密度1×104個/mL接種，每孔250μl，孵育直到細胞貼壁，分別用濃度"""0、2、10、20、25μmol/L的NNMT對細胞予以處理，每組設有3個復孔，在培養(yǎng)48h之后，移去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，每孔滴加CCK-8溶液120μl，避光環(huán)境、37℃下培養(yǎng)1.0～1.5h，檢測酶標檢測儀460nm處的波長，即為吸光度A值。細胞生存活性=（NNMT組A-鐵抑制組A）/（NNMT組A-對照組A）×100%。

1.3""統(tǒng)計學方法

采用SPSS"19.0統(tǒng)計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間進行比較采用F檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2""結果

2.1""MNA、ROS、過氧化脂質平均的熒光強度表達水平比較

肝癌組織組的MNA表達水平為81.13±7.51，而癌旁組織組的MNA表達水平為64.37±5.43，明顯低于肝癌組織組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。肝癌組織組的ROS平均熒光強度表達高于癌旁組織組，而過氧化脂質平均的熒光強度表達低于癌旁組織組，差異有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05），見表1。

2.2""SK-Hep-1、Hep3B細胞表達水平比較

肝癌組織組的SK-Hep-1、Hep3B細胞表達量高于癌旁組織組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見表2。

2.3""細胞形態(tài)學檢測

對各組肝臟細胞進行染色并用光鏡進行觀察，觀察對照組和NNMT組的熒光強度。在激發(fā)最大波長575nm、發(fā)射最大的波長598nm時，與對照組比較，NNMT組的線粒體形態(tài)顯著性縮減，細胞核狀態(tài)有所改變，細胞中熒光強度上升，細胞的增值率下降，對于細胞的濃度有一定依賴性，見圖1。

2.4""不同鐵濃度細胞的生存活性表達比較

NNMT組2、10、20及25μmol/L的鐵濃度細胞生存活性水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05）。鐵抑制組的不同鐵濃度（2μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、25μmol/L）細胞生存活性表達較NNMT組下降，差異有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05），見表3。

3""討論

肝細胞癌為高病死率的原發(fā)性肝癌，其進展快速、惡性程度較高，患者遠期預后效果較差[8-9]。肝細胞癌的發(fā)生進展為復雜的細胞生化及病理學的過程，有較多研究證明肝癌細胞中存在明顯鐵代謝水平失衡[10-11]。研究顯示，鐵代謝水平障礙在肝細胞癌疾病中有較廣泛存在[12-13]。經鐵調素-排鐵蛋白軸有較多鐵聚集于肝癌細胞中，導致氧化應激水平失衡。因此對于鐵代謝的調控機制的研究能為臨床靶向診治肝細胞癌疾病提供新思路。

NNMT是指近幾年發(fā)現的一類癌癥相關蛋白，屬于甲基轉移酶，NNMT可有效對甲基予以催化從S-腺苷蛋氨酸轉移至尼克酰胺，分別出現甲基尼克酰胺及S-腺苷同型半胱氨酸。近來研究顯示，NNMT能提高對肝癌細胞的轉移能力及改善患者預后不良[14-15]。鐵代謝障礙極易引起細胞發(fā)生鐵死亡，而鐵死亡屬于一類依賴于鐵的以ROS與脂質過氧化物積聚作為主要因素的新細胞死亡的形式[16]。目前，鐵死亡在癌癥發(fā)展及化療、放療中已被表明可發(fā)揮出較重要的作用。在肝癌細胞內鐵死亡期間調控多種上游信號通路，如p53可調控鐵死亡而誘導肝細胞癌病癥發(fā)展，鐵硫結構域蛋白1（CDGSH鐵流域I）能夠有效對鐵死亡予以調控，對肝細胞癌的進程、產生也有較大影響[17]。

本研究肝癌組織組的MNA水平較癌旁組織組有所提升（Plt;0.05）。與癌旁組織組比較，肝癌組織組的ROS平均熒光強度表達升高，過氧化脂質平均的熒光強度表達降低（Plt;0.05）。故全面分析鐵死亡可有效減緩肝細胞癌疾病的發(fā)展。NNMT的底物NAM及鐵均可作為細胞中參與電子傳導的重要指標，在探究NNMT活性水平變化及鐵過載小鼠模型時，都能對還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide"adenine"dinucleotide，NADH）表達變化清晰觀察，表明鐵可經電子傳導對NNMT表達造成一定影響[18]。研究顯示，在小鼠正常的肝臟組織細胞內，過量鐵可顯著性減少肝臟中NNMT轉錄的表達量，且在人正常血清內，肝臟NNMT轉錄表達和鐵含量呈現負相關[19-20]。由于對鐵和NNMT水平間關系的考慮，預測NNMT表達與鐵死亡狀況可能有著緊密聯系，需更深一步分析NNMT在肝癌細胞產生鐵死亡中具體的調控病理機制。

本研究中，與癌旁組織組比較，肝癌組織組的SK-Hep-1、Hep3B細胞表達量上升（Plt;0.05）。肝細胞癌患者體內鐵蛋白上升，證實肝細胞癌患者伴有顯著的鐵代謝障礙。研究表明，NNMT能有效降低腫瘤細胞ROS含量，而降低NNMT水平后可引導ROS表達上升，能有助于腫瘤細胞自噬及凋亡提升，降低其對藥物化療的耐藥性[21]。研究證實，在結直腸癌細胞內提高NNMT表達能有效降低細胞的凋亡，而NNMT水平下降可明顯提升細胞的凋亡概率。且下調NNMT可提升ROS，而ROS的出現可作為觀察鐵死亡產生的重要信號之一，但引發(fā)ROS生成病理機制尚未清晰[22]。

本研究中，與對照組比較，NNMT組2、10、20及25μmol/L的細胞生存活性水平升高（Plt;0.05）；與NNMT組比較，鐵抑制組不同鐵濃度（2μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、25μmol/L）的細胞生存活性表達下降（Plt;0.05）。提示通過尼克酰胺轉甲基酶介導ROS，可有效誘發(fā)肝癌細胞中鐵死亡，緩解細胞的活性，對MNA表達進行調節(jié)，改善ROS、過氧化脂質的熒光強度變化水平，以促進疾病恢復加快，與其他研究結果較相似[23-25]。原因可能腫瘤的進展、產生屬于多因素、多基因相互作用的一種結果，在進展的不同時期，不同的抑癌基因或癌基因的種類、數量、作用等各不同，其在NNMT能對細胞凋亡、傳導信號、物質代謝（糖、脂類等）、分化細胞有關基因水平，故證明NNMT能夠在腫瘤細胞生物能力中有所參與，而NNMT水平及癌細胞的轉移與腫瘤時期呈正相關，因此，可將NNMT作為一類能有效轉移腫瘤細胞的調控指標。表明NNMT能有效調節(jié)肝癌細胞中的鐵代謝，誘導細胞出現鐵死亡，緩和過氧化脂質、ROS水平，改善疾病。

綜上所述，肝癌細胞因存有較常見的鐵代謝水平障礙，極易引發(fā)細胞中鐵死亡，對于調控鐵死亡可對肝細胞癌的發(fā)展有一定影響，且在肝細胞內NNMT和鐵代謝水平有一定關聯，NNMT水平提升可有效增強腫瘤細胞增殖、侵襲及遷移能力，提高了腫瘤細胞對于疾病用藥物化療中的耐藥效果，而降低NNMT，可經引導產生ROS及能量紊亂，提高了腫瘤細胞的死亡，使得細胞的生存水平下降。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–01–26）

（修回日期：2024–05–30）