醒腦靜對腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護作用研究

【摘要】目的 探討醒腦靜在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中的腦保護效果及其作用機制，評估醒腦靜對大鼠腦缺血再灌注后的神經功能、炎癥反應及神經元損傷的影響。方法 選取健康成年Sprague Dawley（SD）大鼠60只，根據(jù)隨機數(shù)字表法分為假手術組（20只）、模型組（20只）及醒腦靜組（20只）。醒腦靜組大鼠灌胃給藥醒腦靜3 mL/kg體質量，1次/d，連續(xù)給藥5 d，給予假手術組和模型組大鼠灌胃等體積純凈水。末次給藥后30 min用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型。3組大鼠均術后飼養(yǎng)至再灌注72 h。比較再灌注24 h和72 h 3組大鼠橫木行走實驗評分、神經功能評分及血清神經元特異性烯醇化酶（NSE）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10

（IL-10）水平，以及再灌注72 h 3組大鼠腦組織病理形態(tài)學。結果 與再灌注24 h比，再灌注72 h醒腦靜組大鼠橫木行走實驗評分升高，神經功能評分降低，再灌注24、72 h，與手術組比，模型組和醒腦靜組大鼠橫木行走實驗評分均降低，神經功能評分均升高，與模型組比，醒腦靜組大鼠橫木行走實驗評分均升高，神經功能評分均降低（均Plt;0.05）；與再灌注24 h比，再灌注72 h模型組與醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均降低，再灌注24、72 h，與假手術組比，模型組和醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均升高，與模型組比，醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均降低（均Plt;0.05）；與假手術組比，再灌注72 h模型組和醒腦靜組大鼠腦組織病理形態(tài)學出現(xiàn)明顯改變，腦組織結構不完整，神經元出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，與模型組比，醒腦靜組大鼠的腦組織病理形態(tài)學變化相對較輕，腦組織結構相對完整，神經元壞死相對較少。結論 醒腦靜在大鼠腦缺血再灌損傷中具有顯著的腦保護作用，能夠保護大鼠腦組織結構的完整性，調節(jié)炎癥反應，減輕神經元損傷，進而改善其神經功能和運動功能。

【關鍵詞】醒腦靜 ; 腦缺血再灌注損傷 ; 腦保護 ; 神經功能評分

【中圖分類號】R749.05 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.15.0024.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.15.008

腦缺血再灌注損傷是在腦血流中斷后恢復血流供應過程中，腦組織因再灌注引起的損傷，其病理機制復雜，涉及多種生物學過程，包括氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡、鈣超載、血腦屏障破壞等[1]。動物實驗是研究腦缺血再灌注損傷機制和治療方法的重要手段。大鼠因其腦結構和功能與人類相似，因此，常通過線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，模擬人類腦缺血再灌注損傷過程，研究其病理機制和潛在治療方法。中醫(yī)理論認為腦缺血再灌注損傷屬于“中風”范疇，其病機主要為氣血瘀滯、痰熱內閉、神明失養(yǎng)[2]。醒腦靜是一種中藥復方制劑，主要成分包括麝香、郁金、梔子、冰片等，具有清熱解毒、活血化瘀、鎮(zhèn)靜安神等功效[3]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，醒腦靜具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種藥理作用，能增強血腦屏障的通透性，減輕腦水腫，改善腦缺血再灌注損傷的病理狀態(tài)，具有潛在的治療價值[4]?；诖?，本研究旨在探討醒腦靜在大鼠腦缺血再灌注損傷中的腦保護效果及其作用機制，通過行為學評估、血清指標檢測及腦組織病理學觀察，系統(tǒng)評價醒腦靜的腦保護作用，并探討其可能的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只Sprague Dawley（SD）大鼠[上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證號：SCXK（滬）2022-0004]，體質量250～300 g，平均（277.47±13.59） g；大鼠周齡11～12周，平均（11.50±0.50）周。飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學院實驗動物中心，室溫22～25 ℃，相對濕度40%～70%，采用12 h晝夜循環(huán)照明系統(tǒng)，大鼠均自由進食、飲水。本研究經右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院動物醫(yī)學倫理委員會批準（編號：2023102702）。

1.2 主要試劑與儀器 醒腦靜注射液（河南天地藥業(yè)股份有限公司，國藥準字Z41020664，規(guī)格：10 mL/支），緩沖生理鹽水（北京生物制品研究所有限責任公司，國藥準字S10870001，規(guī)格：1.5 mL/支），水合氯醛/糖漿組合包裝[特豐制藥有限公司，國藥準字H20210012，規(guī)格：水合氯醛濃縮液0.671 g∶0.5 g/糖漿4.5 mL]，發(fā)光二極管熒光顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)德國有限公司，型號：DM2500）。

1.3 研究方法

1.3.1 動物分組和干預 取健康成年SD大鼠60只，按照隨機數(shù)字表法分為假手術組（20只）、模型組（20只）

及醒腦靜組（20只）。醒腦靜組大鼠灌胃給藥醒腦靜3 mg/kg體質量，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥5 d，給予假手術組和模型組大鼠等體積純凈水。末次給藥后30 min造模。

1.3.2 大腦中動脈栓塞（MCAO）大鼠模型構建 造模前1 d禁食不禁水，假手術組大鼠實施假手術，未實現(xiàn)腦缺血后的再灌注，模型組和醒腦靜組大鼠均實施手術，實現(xiàn)腦缺血后的再灌注。延大鼠頸部正中作一10～15 mm切口，分離兩側頜下腺，于兩側頜下腺之間剪開筋膜，顯露實驗大鼠的右側胸鎖乳突肌，由玻璃分針鈍性分離胸鎖乳突肌與舌骨肌間的肌間隙，暴露頸總動脈，依次分離出頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈。頸外動脈近心端穿手術絲線，依次結扎頸總動脈近心端與頸外動脈近心端，用無創(chuàng)動脈夾夾住頸內動脈的近心端，在頸總動脈分為頸內、頸外動脈的近端用絲線結扎，以防穿尼龍絲處的切口滲血。在頸總動脈距離頸內動脈分叉處約5 mm處造口，由此口小心地插入尼龍絲（栓線向內上方的角度插入，以防進入翼鄂動脈），長度為18～20 mm，結扎頸總動脈以固定尼龍絲和防止出血，縫合皮膚。術后注意保暖，術后的大鼠行單籠飼養(yǎng)，準備相對柔軟的鼠糧及充足的飲用水。阻塞2 h后，輕輕拔出栓線約10 mm實現(xiàn)腦缺血后的再灌注。假手術組只分離頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，不結扎，不插線，完成后直接縫合皮膚。

1.3.3 橫木行走實驗 橫木寬2.0 cm，長120 cm，厚1.0 cm，距離地面80 cm水平懸空放置。造模前進行橫木行走訓練，使大鼠全部順利通過橫木。評分標準[5]：

0分代表不能待在橫木上；1分代表待在橫木上不能行動；2分代表試圖通過但從橫木上摔下；3分代表通過橫木，但損傷后肢滑落步數(shù)超過總步數(shù)的50%；4分代表滑落步數(shù)超過1次但不超過總步數(shù)的50%；5分代表僅滑落1次；6分代表順利通過。術前訓練4 d，每天1次，直至所有大鼠評分達到6分。

1.3.4 神經功能評分 采用Zea Longa評分法對大鼠進行神經功能評估[6]，評分標準：0分代表無明顯神經癥狀；1分代表不能完全伸展左側前爪；2分代表行走時向左側旋轉；3分代表行走時向左側傾倒；4分代表不能自主行走；5分代表死亡。

1.3.5 腦組織病理分析 ⑴組織取材：切開胸腹皮肉，充分暴露心臟，經心尖插管，剪開心耳，用緩沖生理鹽水沖洗5 min，用4%多聚甲醛（0.l mol/L磷酸緩沖液，pH值7.4）心內灌注固定。大鼠尾部變硬后，開顱取全腦，冠狀位取視交叉向尾端3～4 mm組織塊，投入相同固定液于4 ℃固定1周，石蠟包埋后，4 ℃保存。⑵蘇木精 - 伊紅（HE）染色：將石蠟切片，切片厚度5 μm，將切片用不同濃度的二甲苯和乙醇脫蠟，蘇木素浸泡染色25 min后用水沖洗。鹽酸乙醇分化液浸泡30 s，純凈水浸泡15 min，0.5%伊紅染液浸泡2 min，沖洗。乙醇梯度脫水，樹脂封片，光鏡下觀察其組織形態(tài)的變化。

1.4 觀察指標 ⑴運動功能和神經功能。分別于再灌注24 h和72 h比較3組大鼠橫木行走實驗評分和神經功能功能評分。⑵血清學指標。每組大鼠分別于再灌注24 h和72 h后經腹腔注射10 %水合氯醛（0.35 mL/100 g體質量），腹主動脈取血，離心（3 000～4 000 r/min，10～15 min，4 ℃）后得到上層血清，使用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測3組大鼠血清神經元特異性烯醇化酶（NSE）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）水平。⑶腦組織病理形態(tài)。再灌注72 h比較3組大鼠腦組織病理形態(tài)學。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料均符合正態(tài)分布且方差齊，以（ x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠橫木行走實驗評分和神經功能評分比較 與再灌注24 h比，再灌注72 h醒腦靜組大鼠橫木行走實驗評分升高，神經功能評分降低；再灌注24、72 h，與假手術組比，模型組與醒腦靜組大鼠橫木行走實驗評分均降低，神經功能評分均升高；與模型組比，醒腦靜組大鼠橫木行走實驗評分均升高，神經功能評分均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05），見表1。

2.2 3組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平比較 與再灌注24 h比，再灌注72 h 模型組與醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均降低；再灌注24、72 h，與假手術組比，模型組和醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均升高；與模型組比，醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05），見表2。

2.3 3組大鼠腦組織HE染色與病理形態(tài)學比較 再灌注72 h后，與假手術組比，模型組和醒腦靜組大鼠腦組織病理形態(tài)學出現(xiàn)明顯改變，腦組織結構不完整，神經元出現(xiàn)壞死現(xiàn)象；與模型組比，醒腦靜組大鼠的腦組織病理形態(tài)學變化相對較輕，腦組織結構相對完整，神經元壞死較少，見圖1。

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一種臨床常見的造成腦損傷的原因，其發(fā)生往往與休克、心跳驟停等多種情況密切相關。在腦缺血再灌注過程中，缺血引起的腦組織損傷往往比缺血本身更嚴重。中醫(yī)學認為腦缺血再灌注損傷屬“中風”范疇，“腦髓損傷，神機失用”是病機關鍵。醒腦靜主要由麝香、郁金、梔子、冰片配伍而成，具有保護腦組織、改善腦部血液循環(huán)、抗炎等作用。醒腦靜在臨床上主要用于治療多種原因導致的腦部疾病，研究表明，醒腦靜在腦缺血再灌注損傷中可能具有一定的保護作用[7-8]。

本研究中，再灌注24、72 h，與假手術組比，模型組與醒腦靜組大鼠橫木行走實驗評分均降低，神經功能評分均升高；與模型組比，醒腦靜組大鼠橫木行走實驗評分均升高，神經功能評分均降低。這提示醒腦靜能夠有效改善腦缺血再灌注損傷大鼠的平衡能力和神經功能。醒腦靜具有鎮(zhèn)靜安神的作用，能夠抑制腦缺血再灌注損傷引起的神經系統(tǒng)興奮性，改善運動功能和神經功能。良好的血液供應對于維持神經系統(tǒng)的正常功能至關重要，而醒腦靜具有活血化瘀的作用，可改善腦部血液循環(huán)，促進腦組織的血液供應和氧氣供給，減輕腦組織損傷[9]。

在腦缺血再灌注過程中，炎性細胞浸潤、炎癥因子釋放，會進一步加重腦組織損傷，NSE是神經元損傷的標志物，當腦組織出現(xiàn)急性缺血缺氧導致壞死時，大量NSE會釋放；IL-6和IL-10主要由單核細胞、巨噬細胞等產生，IL-6水平可反映腦缺血損傷程度，IL-10是抗炎因子，在腦缺血早期處于應激代償狀態(tài)，可抑制炎癥因子的活性。本研究中，再灌注24、72 h，與假手術組比，模型組和醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均升高；與模型組比，醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均降低。這提示醒腦靜能夠減輕炎癥反應，進而降低炎癥因子水平，減輕神經元損傷。醒腦靜具有較好的抗炎、改善血液循環(huán)的作用，通過改善腦組織缺血缺氧狀態(tài)和血腦屏障的通透性，減少炎癥因子對腦組織的損傷。

本研究結果顯示，與模型組比，醒腦靜組大鼠的腦組織結構相對完整，神經元壞死相對較少。這提示醒腦靜能夠有效保護腦組織結構完整性，減輕神經元損傷。醒腦靜具有抗氧化作用，能夠清除再灌注過程中產生的活性氧，減輕氧化應激損傷，從而保護腦組織結構；醒腦靜還具有抗凋亡作用，通過抑制腦缺血再灌注損傷引起的神經元凋亡，減輕神經元損傷，促進腦組織修復[10]。

綜上，醒腦靜在大鼠腦缺血再灌損傷中具有顯著的腦保護作用，通過調節(jié)炎癥反應，減輕神經元損傷，進而保護腦組織結構的完整性，還改善了運動功能和神經功能。未來應進一步深入研究，為醒腦靜治療腦缺血再灌損傷提供更多的科學依據(jù)。

參考文獻

孫亞萍， 霍瑞卿， 趙敏菡， 等. 益氣活血化濁解毒方調節(jié)脂多糖和TLR4/MyD88/MAPK信號通路減輕大鼠腦缺血再灌注損傷研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2023， 38（12）： 5997-6002.

張平文， 王義宣. 醒腦靜注射液治療創(chuàng)傷性腦出血患者的臨床研究[J]. 中國臨床藥理學雜志， 2023， 39（23）： 3351-3355.

郭金赫， 范祥. 醒腦靜注射液治療腦出血研究進展[J]. 中成藥， 2021， 43（2）： 450-453.

王麗琴， 孫逸坤， 王曉峰， 等. 醒腦靜注射液對大鼠腦出血模型血腦屏障通透性及相關蛋白的影響[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥， 2021， 14（6）： 993-999.

楊奕櫻， 劉楊， 劉明， 等. 淫羊藿苷對腦缺血再灌注大鼠恢復早期的神經保護作用研究[J].中藥新藥與臨床藥理， 2020， 31（6）： 662-667.

盧小葉， 呂倩憶， 李棋龍， 等. Zea-longa評分與改良Garcia評分應用于針刺治療CIRI大鼠神經功能缺損評估的研究[J]. 湖南中醫(yī)藥大學學報， 2021， 41（9）： 1356-1360.

劉浩琦， 張涵萊， 李媛媛， 等. 基于GC-MS代謝組學的醒腦靜注射液干預腦缺血再灌注大鼠模型的作用機制研究[J]. 海南醫(yī)學院學報， 2022， 28（8）： 572-578.

曲曉宇， 張月明， 張四喜， 等. 醒腦靜注射液保護大鼠腦缺血 - 再灌注損傷及血腦屏障的作用研究[J]. 中藥材 ，2018， 41（9）： 2196-2200.

賈賀， 李惠勉， 劉超， 等. 醒腦靜注射液對急性腦梗死患者局部腦血流、腦水腫及MMP、NSE的影響[J]. 吉林中醫(yī)藥， 2020， 40（9）： 1202-1205.

陳歡， 司海超， 馬新強， 等. 丁苯酞聯(lián)合醒腦靜預防頸動脈內膜剝脫術后腦高灌注綜合征的療效及對其腦氧代謝、氧化應激的影響[J]. 世界中西醫(yī)結合雜志， 2023， 18（7）： 1462-1465， 1475.

1 基金項目：2022年百色市科學研究與技術開發(fā)計劃項目（編號：百科20224163）

作者簡介：吳曉文，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：重癥醫(yī)學。