紫花苜蓿生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子的全基因組鑒定及干旱脅迫下特征分析

摘要：為揭示紫花苜蓿（Medicago sativa）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子（GRF）響應(yīng)干旱脅迫中的生理功能及響應(yīng)機(jī)制，以勁能5020為試驗(yàn)材料，基于全基因組分析，對(duì)紫花苜蓿GRF家族成員進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析，并采用RT-qPCR方法分析相關(guān)基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果表明，在紫花苜蓿中共鑒定出8個(gè)GRF編碼基因的非冗余成員，可定位于7條染色體上。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，紫花苜蓿GRF（MsGRF）可分為4個(gè)亞家族，同一亞家族的MsGRF都包含共同的高度保守基序、基因結(jié)構(gòu)及多種順式作用元件，表明MsGRF具有潛在的功能多樣性。RNA-seq、qPCR表達(dá)模式表明，MsGRF在幼嫩組織和根系中具有較高的表達(dá)活性。RT-qPCR進(jìn)一步表明，8個(gè)MsGRF成員中，6個(gè)基因（MsGRF1、MsGRF3、MsGRF5、MsGRF6、MsGRF7、MsGRF8）在干旱脅迫下上調(diào)表達(dá)，其中MsGRF1相對(duì)表達(dá)水平45.8～83.1，表達(dá)活性最高、契合度最佳。綜上，MsGRF在紫花苜蓿抗干旱過程中具有重要作用，推測(cè)MsGRF1是紫花苜蓿耐旱的關(guān)鍵基因。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子；全基因組；干旱脅迫；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S541.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）12-0045-08

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子（GRF）是植物重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于綠色植物中，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中扮演著重要角色［1］。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子（GRF）是轉(zhuǎn)錄因子的重要家族成員之一，GRF在N端區(qū)域包含2個(gè)特征和保守的功能域，即QLQ域（Gln、Leu、Gln）和WRC域（Trp、Arg、Cys）［ ］。QLQ結(jié)構(gòu)域包含GRF相互作用因子（GIF）相互作用的位點(diǎn)［4］，而WRC結(jié)構(gòu)域包含DNA結(jié)合基序和核定位信號(hào)，WRC結(jié)構(gòu)域由DNA結(jié)合的C3H基序和核定位信號(hào)（NLS）組成，因此QLQ域比WRC域更為保守［5］。所有真核生物都含有QLQ，WRC為植物特異性結(jié)構(gòu)域，GRF的C端區(qū)域、氨基酸殘基的種類和數(shù)量差異較大，這使得不同植物、同植物不同基因型，同基因型不同成員的相似度均較低［6］。由于C端結(jié)構(gòu)域差異較大，且C末端區(qū)域的長(zhǎng)度決定著蛋白質(zhì)的大小，因此植物GRF蛋白往往具備功能多樣性［7］。

GRF參與植物早期生長(zhǎng)發(fā)育，在植物組織或器官的形成中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，如葉拓展、莖伸長(zhǎng)和根系分化［8］。這些轉(zhuǎn)錄因子直接影響植物形態(tài)建成，進(jìn)而影響植物生理代謝強(qiáng)度及產(chǎn)量。水稻（Oryza sativa）的OsGRF1是在植物中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)GRF成員，基因克隆顯示其可編碼赤霉素生物合成蛋白從而誘導(dǎo)莖伸長(zhǎng)，且其他GRF成員可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖來調(diào)節(jié)目標(biāo)植物葉片的形狀和大?。?］。在模式植物擬南芥中，與野生型相比，AtGRF1、AtGRF2和AtGRF5過表達(dá)植株的葉片更厚，但包括GRF3-1、GRF5-1、GRF1-1、GRF2和GRF3突變體的葉片比寬型植物?。?］。目前，一些研究表明，GRF基因可抑制KNOX基因表達(dá)以調(diào)節(jié)關(guān)鍵生物合成基因GA20氧化酶來抑制S-腺苷甲硫氨酸（SAM）循環(huán)中的GA生物合成或通過控制降解GA的GA2氧化酶水平，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖［9］。

大多數(shù)GRF基因是microRNA396（miR396）的靶基因，有證據(jù)表明miR396可以通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控直接抑制GRF表達(dá)［10］。目前，GRF基因家族的鑒定和功能已在多種植物中進(jìn)行了研究，在擬南芥中鑒定得到GRF 9個(gè)［4］、大豆22個(gè)［11］、水稻12個(gè)［12］、黑果枸杞［13］、玉米15個(gè)［14］、馬鈴薯12個(gè)［15］、谷子18個(gè)［16］。紫花苜蓿（Medicago sativa）是多年生豆科植物，紫花苜蓿富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，是一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要飼料作物［17，18］。然而，由于紫花苜蓿的遺傳復(fù)雜性和對(duì)環(huán)境脅迫的不耐受性，尤其是干旱脅迫，導(dǎo)致苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)不穩(wěn)定［19］。研究紫花苜蓿發(fā)育過程和逆境耐受機(jī)制，對(duì)于培育優(yōu)質(zhì)苜蓿種質(zhì)資源至關(guān)重要。本研究對(duì)紫花苜蓿GRF基因家族進(jìn)行了全基因組分析，表征了GRF的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)及順式作用元件，檢測(cè)了不同GRF成員響應(yīng)干旱的轉(zhuǎn)錄譜，研究結(jié)果有助于揭示紫花苜蓿的耐旱機(jī)制以及為未來紫花苜蓿的基因工程改良提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和培養(yǎng)方法

試驗(yàn)2023年2—5月于河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院植物培養(yǎng)室中進(jìn)行。供試紫花苜蓿（Medicago sativa）品種為勁能5020，購自河南合博草業(yè)有限公司。

1.2 紫花苜蓿GRF基因的全基因組分析

1.2.1 紫花苜蓿GRF基因家族成員的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）、大豆（Glycine max，Gm）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，Mt）和水稻（Oryza sativa，Os）的GRF通過搜索NCBI的基因數(shù)據(jù)庫下載。為了鑒定紫花苜蓿中潛在的GRF蛋白序列，在Figshare數(shù)據(jù)庫（https：//figshare.com/articles/dataset/）中下載得到所有的紫花苜蓿GRF，并設(shè)置為隱馬爾可夫模型文件。并基于上述作物的GRF蛋白序列進(jìn)行BLAST搜索，使用簡(jiǎn)單模塊化架構(gòu)研究工具數(shù)據(jù)庫（http：//smart.embl-heidelberg.de/）檢查候選序列以鑒定包含WRC結(jié)構(gòu)域（PF08879）和QLQ結(jié)構(gòu)域（PF08880）的GRF蛋白序列，然后使用HMMER v3.03對(duì)HMM進(jìn)行搜索和檢索序列，并采用SMART4（http：//smart.embl.de/）和Batch-CDD （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）重復(fù)篩選以去除GRF保守結(jié)構(gòu)域不完整的蛋白質(zhì)，從而獲得非冗余序列，并命名為MsGRF。

1.2.2 MsGRF的理化性質(zhì)表征與系統(tǒng)發(fā)育分析

采用ExPASy工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析推定MsGRF蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、分子量（Mw）及等電點(diǎn)（PI）；采用NCBI的開放閱讀框（ORF）工具（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html）確定ORF的長(zhǎng)度。隨后，采用Clustal W6進(jìn)行多序列比對(duì)，并導(dǎo)入所有AtGRF、GmGRF、OsGRF、MtGRF、MsGRF蛋白序列，使用MEGA 7.0在線軟件（https：//www. megasoftware.net/）中的鄰接法生成系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)置為1 000，其余參數(shù)為默認(rèn)值［20］。

1.2.3 MsGRF染色體定位、基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子順式元件分析

紫花苜蓿GRF基因的染色體位置從基因組組裝平臺(tái)（https：//figshare.com/projects/whole_genome_sequencing_and_assembly_of_Medicago_sativa/）獲取，并采用TBtools（shttps：//github.com/CJ-Chen/TBtools）繪制染色體分布圖。采用基因結(jié)構(gòu)顯示服務(wù)器（GSDS）（http：//gsds.gao-lab .org/）以獲得紫花苜蓿GRF家族成員的內(nèi)含子-外顯子特征。利用MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對(duì)保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用PlantCARE 10預(yù)測(cè)MsGRF啟動(dòng)子上游2 000 bp序列中的順式作用元件，并采用TBtools可視化順式作用元件。

1.3 MsGRF基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲取與表達(dá)分析

利用MsGRF家族成員的基因序列在紫花苜蓿參考轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（https：//figshare.com/projects/）進(jìn)行blast比對(duì)，下載獲得的默認(rèn)格式文件轉(zhuǎn)換為 .fastq 格式，再將fastq通過.Trim Galore軟件（http：//bioinformatics.babraham.ac.uk/）進(jìn)行質(zhì)控。質(zhì)控后的高質(zhì)量序列采用利用RNA-Seq數(shù)據(jù)量化軟件kallisto軟件（0.43.1版本）進(jìn)行定量，定量獲取的數(shù)值以TPM表示，通過TBtools進(jìn)行熱圖可視化［21］。

1.4 相關(guān)MsGRF的篩選及qRT-PCR分析

1.4.1 供試紫花苜蓿植物的培養(yǎng)方法

挑選飽滿尺寸一致的種子在0.8%次氯酸鈉中消毒3 min，以流動(dòng)蒸餾水沖洗5次；采用豆科植物育苗基質(zhì)將紫花苜蓿種子在人工氣候室中培養(yǎng)28 d，土壤含水率保持為80%～85%，干旱處理則加入15 mL 5%的甘露醇模擬干旱脅迫。在各時(shí)間點(diǎn)取樣時(shí)采用PBS緩沖液進(jìn)行快速?zèng)_洗并液氮速凍保存于-80 ℃環(huán)境以用于植株RNA提取。

1.4.2 紫花苜蓿RNA的提取及RT-qPCR分析

將紫花苜蓿樣品（250 mg）采用液氮快速研磨，按照RN38EASYspin Plus植物提取試劑盒相關(guān)說明提取樣品總RNA，采用使用Thermo Scientific的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA。采用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表1），以Actin作為內(nèi)參基因。PCR體系、擴(kuò)增條件及熱循環(huán)程序參照蘇倩等的方法［22］，使用Thermo Scientific Stepone plus 6x熒光定量PCR儀的實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用DPS 14.0進(jìn)行單因素方差分析，采用相應(yīng)在線繪圖工具、R軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsGRF家族的理化性質(zhì)特征分析

同源性搜索在紫花苜?；蚪M中獲得了22個(gè)推定的GRF蛋白序列，在去除不完整QLQ、WRC結(jié)構(gòu)域序列后，根據(jù)Figshare數(shù)據(jù)庫中蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）和NCBI數(shù)據(jù)庫中擬南芥（Arabidopsis thaliana）的分類，采用遞次命名法從紫花苜?；蚪M識(shí)別出8個(gè)完整的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子成員MsGRF1～MsGRF8?；贓xPASy檢測(cè)相關(guān)MsGRF物理和化學(xué)特性可知，紫花苜蓿GRF基因家族蛋白質(zhì)長(zhǎng)度224～516 aa，分子量在25.38～56.22 ku，等電點(diǎn)為6.28～10.25，其中僅MsGRF6為酸性蛋白（等電點(diǎn)gt;7.0），其他均為堿性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，紫花苜蓿MsGRF3、MsGRF5位于細(xì)胞質(zhì)中，其他6個(gè)MsGRF成員均位于細(xì)胞核中；且所有蛋白親水指數(shù)均為正值，表示成員均為疏水蛋白（表2）。

2.2 MsGRF家族成員鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

為了系統(tǒng)地揭示紫花苜蓿生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子蛋白（MsGRF）、擬南芥生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子蛋白（AtGRF）、大豆生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子蛋白（GmGRF）、蒺藜苜蓿生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子蛋白（MtGRF）、水稻生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子蛋白（OsGRF）成員的進(jìn)化關(guān)系，基于氨基酸序列的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。通過對(duì)MsGRF與上述不同植物蛋白質(zhì)序列的同源比較分析，8個(gè)MsGRF、9個(gè)AtGRF、20個(gè)GmGRF、8個(gè)MtGRF、12個(gè)OsGRF，共67個(gè)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子蛋白可分為5個(gè)不同的亞家族。其中，C組是數(shù)量最少的亞家族，包含2個(gè)成員，A組是數(shù)量最多的亞家族，包含18個(gè)成員。對(duì)MsGRF進(jìn)行分組，結(jié)果顯示A、B、D、E亞家族分別包含3、1、3、1個(gè)成員。

2.3 MsGRF基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析

由圖2-A可知，基因結(jié)構(gòu)顯示服務(wù)器（GSDS）預(yù)測(cè)MsGRF的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)以深入了解紫花苜蓿在基因進(jìn)化過程中的變異情況，結(jié)果表明，MsGRF1擁有最多的內(nèi)含子（10個(gè)），其他MsGRF成員外顯子數(shù)量在3～7個(gè)，且內(nèi)含子長(zhǎng)度可達(dá) 2.8 kb；而所有的MsGRF成員皆含有5個(gè)或6個(gè)外顯子。

為了更好地了解GRF蛋白序列的特征，對(duì)覆蓋QLQ和WRC結(jié)構(gòu)域的最保守區(qū)域進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，8個(gè)MsGRF蛋白都具有相同的QLQ和WRC氨基酸序列，并且這2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的序列高度保守，而TQL結(jié)構(gòu)域僅存在于一些與擬南芥GRF成員相似的MsGRF成員（MsGRF1、MsGRF3）C端（圖2-B）。

2.4 MsGRF啟動(dòng)子中的順式元件分析

使用PlantCARE數(shù)據(jù)庫分析了8個(gè)MsGRF基因的上游序列，分析結(jié)果表明，紫花苜蓿GRF啟動(dòng)子區(qū)域包含光照響應(yīng)、MYB轉(zhuǎn)錄因子、植物激素元件（ABA、GA、SA、Me-JA）以及厭氧誘導(dǎo)元件等一系列元件（圖3），這些順式元素是響應(yīng)非生物應(yīng)激反應(yīng)的重要組成部分。例如，MsGRF7、MsGRF8含有與冷脅迫相關(guān)的順式元件，而MsGRF8、MsGRF6、MsGRF2、MsGRF1含有脫落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（Me-JA）、水楊酸（SA）及赤霉素（GA）等激素反應(yīng)元件；MsGRF3、MsGRF4、MsGRF5的啟動(dòng)子特異地含有1個(gè)與分生組織表達(dá)相關(guān)的元件，表明這些GRF基因可能與分生組織的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。

2.5 MsGRF的染色體定位分析

為確定紫花苜蓿生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因在染色體上的位置和相關(guān)基因擴(kuò)增片段區(qū)域，以97%序列相似性為標(biāo)準(zhǔn)將MsGRF映射到相應(yīng)染色體錨定支架上，TBtools可視化顯示8個(gè)MsGRF均可被定位到7條染色體上（圖4），且不均勻地分布于不同染色體臂的遠(yuǎn)端區(qū)域。其中7號(hào)染色體擁有最多的MsGRF（MsGRF3、MsGRF4），其他染色體上均包含1個(gè)MsGRF。

2.6 MsGRF基因在不同組織中的RNA-seq表達(dá)譜分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了紫花苜蓿的6種組織，包括根瘤、花序、分枝莖、幼嫩莖、主莖、根系；其中，MsGRF1在多種組織中表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，尤其是在根系和幼嫩莖中。3個(gè)基因（MsGRF2、MsGRF3、MsGRF4）在所有組織中均具有相對(duì)較低的表達(dá)水平。MsGRF7基因在根瘤中的表達(dá)水平高于其他基因。MsGRF5、MsGRF6和MsGRF8在幼嫩莖和花序中的表達(dá)量比在其他組織中要高（圖5-A）。通過qPCR分析，發(fā)現(xiàn)MsGRF4在花中表現(xiàn)出最高的表達(dá)水平，這與圖5-A的結(jié)果大體一致。分析表明，MsGRF1基因在根系和花序中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于主莖和葉片，同時(shí)亦高于所有其他MsGRF基因（圖5-B）。

2.7 干旱脅迫下MsGRF基因的RT-qPCR分析

綜合圖5可知，MsGRF在根系的表達(dá)水平較高，因此以根系為主要測(cè)定對(duì)象，探索了干旱脅迫下各基因的實(shí)時(shí)表達(dá)水平。由圖6可知，在不同時(shí)間點(diǎn)（0、2、4、8、12、24 h）下不同MsGRF表達(dá)模式存在明顯差異。其中，MsGRF2、MsGRF4全部時(shí)間點(diǎn)鐘中的表達(dá)水平皆較低。MsGRF3、MsGRF5、MsGRF6、MsGRF7、MsGRF8在干旱處理0 h時(shí)處于較高水平，而后略微增加，而在干旱處理24 h后皆具有最低水平。就MsGRF1表達(dá)水平而言，干旱處理0 h時(shí)，表達(dá)水平較低，而在處理2、4、8、12 h中均保持較高的相對(duì)表達(dá)量（58.0～83.1），在處理24 h后，相對(duì)表達(dá)量降低，但仍處于較高水平（45.8）。

3 討論與結(jié)論

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，可作用調(diào)節(jié)早期植物形態(tài)發(fā)生和根部發(fā)育，在作物產(chǎn)量和抗性遺傳改良中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［23］。本研究中，在紫花苜蓿中鑒定得到22個(gè)待定蛋白，多重序列比較進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)僅8個(gè)GRF成員（MsGRF）同時(shí)含有完整的QLQ結(jié)構(gòu)域和WRC基序。GRF的數(shù)量因植物而異，一般而言，植物中GRF成員的數(shù)量在8～27個(gè)之間［24］。以往的研究表明，大豆、水稻、番茄、玉米以及馬鈴薯中的GRF基因數(shù)量更多；植物物種間GRF基因數(shù)量的差異可能歸因于基因的串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制。ExPASy檢測(cè)表明，MsGRF蛋白質(zhì)長(zhǎng)度224～516 aa，分子量25.38～56.22 ku，所有的MsGRF成員均為疏水蛋白，且大多數(shù)成員呈堿性。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，除MsGRF3、MsGRF5位于細(xì)胞質(zhì)外，其余MsGRF成員均位于細(xì)胞核中。

基因的結(jié)構(gòu)和氨基酸結(jié)構(gòu)是決定其轉(zhuǎn)錄水平與表達(dá)強(qiáng)弱的重要條件，基因結(jié)構(gòu)已被確定為該基因可編輯性的重要特征之一［25］。本研究中，所有的MsGRF成員的QLQ結(jié)構(gòu)域和WRC基序皆存在于N末端（圖2-B）。這一觀察結(jié)果與水稻、擬南芥和大豆等模式植物［12-16］觀察到的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)QLQ和WRC的N末端結(jié)構(gòu)是MsGRF家族的基本構(gòu)架，但TQL結(jié)構(gòu)域的C端僅存在于少數(shù)MsGRF成員中，因此推測(cè) MsGRF蛋白的功能多樣性可能取決于C端結(jié)構(gòu)域的多樣性［5］。本研究中，基因結(jié)構(gòu)分析表明，不同MsGRF成員的外顯子數(shù)量差異較小，但內(nèi)含子數(shù)量差距較大（3～10個(gè)）；這與擬南芥的內(nèi)含子特征相似，表明MsGRF的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與其相應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)和保守基序具有密切關(guān)系［4］。內(nèi)含子特征與基因進(jìn)化有關(guān)，更多和更長(zhǎng)的內(nèi)含子往往存在于高表達(dá)的基因中，并可能導(dǎo)致基因的功能多樣化［26］。

基因表達(dá)受不同途徑的順式作用元件和反式作用因子的復(fù)雜相互作用調(diào)節(jié)［27］，之前的研究表明，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因可被不同的順式元件模塊誘導(dǎo)［6，13，28］。本研究結(jié)果表明，MsGRF基因的啟動(dòng)子包含各種應(yīng)激反應(yīng)元件，如冷反應(yīng)、光誘導(dǎo)及植物激素元件。部分MsGRF成員基因啟動(dòng)子中還具有防御和應(yīng)激反應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)以及植物激素（ABA、GA、SA、Me-JA）元件，這些結(jié)果表明MsGRF基因也可能通過介導(dǎo)活性氧代謝系統(tǒng)從而參與應(yīng)對(duì)非生物脅迫及植物生長(zhǎng)發(fā)育。據(jù)報(bào)道，與AtGRF7同源的基因可以結(jié)合DREB2A啟動(dòng)子并在非應(yīng)激條件下抑制其表達(dá)。然而，值得注意的是，非生物脅迫會(huì)抑制AtGRF7表達(dá)，從而激活滲透脅迫響應(yīng)基因［29］。本研究中，MsGRF1、MsGRF3、MsGRF4含有更多的ABA響應(yīng)元件（ABRE元素）并且可能可以有效地響應(yīng)滲透壓。因此，MsGRF1、MsGRF3、MsGRF4在調(diào)節(jié)苜蓿脅迫滲透壓方面可能與AtGRF7具有相似的功能。

水資源短缺造成的干旱脅迫是影響全球植物生長(zhǎng)的主要非生物脅迫類型［30］，因此提高植物（如紫花苜蓿）的干旱耐受性極其重要［31］。本研究中，通過RNA-seq技術(shù)，發(fā)現(xiàn)幼嫩莖和根系中的MsGRF轉(zhuǎn)錄水平高于其他組織，且qPCR分析表明MsGRF在根系的轉(zhuǎn)錄水平較高。這些發(fā)現(xiàn)表明苜蓿中的GRF可能主要在調(diào)節(jié)種子發(fā)芽和根系發(fā)育過程中發(fā)揮作用。先前的研究已證實(shí)GRF可通過調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的復(fù)雜過程和對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)來發(fā)揮作用［29］。例如，干旱脅迫下，OsGRF1可以調(diào)節(jié)赤霉酸（GA）誘導(dǎo)的莖伸長(zhǎng)和轉(zhuǎn)錄活性［32］。對(duì)于干旱脅迫，綜合而言根系比其他器官更敏感，因此基于實(shí)時(shí)熒光定量（RT-qPCR）分析了根系MsGRF對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。結(jié)果表明，8個(gè)MsGRF在干旱脅迫的不同時(shí)間點(diǎn)中均發(fā)生明顯變化，但不同MsGRF的表達(dá)模式存在一定差異，表明MsGRF成員在物種進(jìn)化過程中受到了不同程度的影響。其中在干旱處理0 h時(shí)，MsGRF1相對(duì)表達(dá)量較低，此后的24 h內(nèi)一直保持較高水平，表明MsGRF1在紫花苜蓿響應(yīng)干旱脅迫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果表明，從紫花苜蓿中共鑒定出8個(gè)MsGRF，可分為4個(gè)亞家族，分布于7條染色體上。這些MsGRF在氨基酸序列、基序組成方面表現(xiàn)出高度相似性，在基因結(jié)構(gòu)具有一定差異性。8個(gè)MsGRF蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度為224～516 aa，分子量為25.38～56.22 ku，絕大多數(shù)MsGRF為堿性蛋白且皆具有疏水性質(zhì)?；赗NA-seq、qPCR分析表明，MsGRF主要在幼嫩部位和根系中具有較高的表達(dá)活性。RT-qPCR分析表明，8個(gè)MsGRF基因中，2個(gè)（MsGRF2、MsGRF4）在干旱脅迫下無明顯變化，6個(gè)（MsGRF1、MsGRF3、MsGRF5、MsGRF6、MsGRF7、MsGRF8）在干旱處理0 h時(shí)較低，隨著干旱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，呈被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)而后降低；以MsGRF1表達(dá)水平最為顯著，表明MsGRF1可能是耐旱的關(guān)鍵候選基因。研究結(jié)果為揭示MsGRF的進(jìn)化和功能提供了理論依據(jù)，也為紫花苜蓿的育種改良提供了潛在靶點(diǎn)。

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收稿日期：2024-02-28

基金課題：河南省科技計(jì)劃（編號(hào)：182102110469）。

作者簡(jiǎn)介：孫龍飛（1985—），女，河南魯山人，碩士，講師，從事園林植物資源應(yīng)用方向研究。E-mail：Zjjin0726@163.com。

通信作者：黃 萍，碩士，副教授，從事從事園林植物資源應(yīng)用研究。E-mail：hhappy2000@163.com。