短時(shí)鹽脅迫對(duì)紫花苜蓿葉片氣孔特征的影響

羅祺圓　許涵杰　郭鵬

摘 要：利用掃描電鏡技術(shù)，研究了紫花苜蓿在不同濃度（0，0.3%，0.9%，1.5%）NaCl溶液處理下氣孔的適應(yīng)性變化。通過(guò)對(duì)苜蓿葉片的氣孔長(zhǎng)度、氣孔寬度、氣孔開(kāi)度、氣孔密度及潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)等氣孔特征的觀察，探討氣孔特征與耐鹽性的關(guān)系。結(jié)果顯示：苜蓿葉片在鹽脅迫24 h后，除氣孔密度變化不明顯外，其他指標(biāo)均隨鹽濃度的增加而呈下降趨勢(shì)；鹽脅迫24 h后氣孔密度才開(kāi)始增加，而其他指標(biāo)則隨鹽濃度的不同出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)現(xiàn)象。這說(shuō)明在鹽脅迫下， 苜蓿葉片通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔大小及開(kāi)閉來(lái)減少水分蒸騰的同時(shí)，還通過(guò)增加氣孔數(shù)目來(lái)維持光合作用，增強(qiáng)其耐鹽性。

關(guān)鍵詞： 紫花苜蓿；氣孔；鹽脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)：S963.22+3.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.04.004

Abstract： The adaptive changes of stomata of alfalfa （Medicago sativa） under the stress of different NaCl concentration（0，0.3%，0.9% and1.5%） were studied by the technique of scanning electron microscope. The relationship between stomatal feature and salt tolerance were discussed by investigating these indices such as stomatal length， stomatal width， stomatal aperture， stomatal density， potential conductance index and so on. The main conclusions were that except for the change of stomatal density of alfalfa leaves were not very noticeable after the first day under salt stress， other indicators decreased with the increase of salt concentration and treat time. The increase in stomatal density did not begin until 24 hours later，while the other indicators recovered to different degrees under different NaCl stress. The research showed that leaves of alfalfa enhanced its salt tolerance by reducing transpiration through regulating the size and activity of stomata while improving photosynthesis through increasing the number of stomata.

Key words： alfalfa （Medicago sativa）； stomata； salt stress

土壤鹽漬化已成為一個(gè)全球性的問(wèn)題，據(jù)糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，世界各地的鹽漬地已超過(guò)8.0 × 109 hm2[1]。世界范圍內(nèi)至少20%的耕地正遭受著不同程度的鹽漬化危害，我國(guó)鹽堿化土地面積也近1億hm2[2]。隨著全球環(huán)境污染加劇，人口數(shù)量增多，水資源日趨匱乏，越來(lái)越多的回收水和其他二級(jí)水源被用于灌溉，這將會(huì)使更多的土地資源受到鹽害的威脅[3]。土壤鹽分對(duì)植物的傷害主要是過(guò)多的鹽離子打破了植物自身的離子和滲透平衡，造成離子毒害，影響植物的正常生存、生長(zhǎng)和繁殖[4]。此外，植物體內(nèi)產(chǎn)生和積累的活性氧（ROS）引起的氧化脅迫等帶來(lái)的次生脅迫，同樣對(duì)植物造成傷害[5]。因鹽堿地改造成本高，見(jiàn)效慢，培育耐鹽堿環(huán)境的作物新品種是鹽堿地利用的一個(gè)有效思路。

苜蓿（Medicago sativa） 在我國(guó)的栽培歷史已有2 000多年之久，在豆科牧草中的抗鹽性較強(qiáng)，而且生長(zhǎng)快，產(chǎn)量高，利用期長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)豐富，適口性好，還能夠培肥地力[6-7]。開(kāi)展苜蓿等植物的耐鹽機(jī)理研究對(duì)于有針對(duì)性的耐鹽育種具有重要意義。植物在鹽漬環(huán)境下，葉片的組織結(jié)構(gòu)對(duì)其反應(yīng)最為敏感[8]。鹽分由根系吸收，經(jīng)導(dǎo)管運(yùn)輸?shù)降厣喜糠帧Ｄ望}植物主要通過(guò)氣孔的開(kāi)閉來(lái)調(diào)節(jié)水分的蒸騰率以減少Na+隨蒸騰流進(jìn)入葉片組織[9]。近年來(lái)，在植物生理學(xué)、進(jìn)化論和全球生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域?qū)饪椎难芯慷紭O其重視。Heherington和Woodward也指出，氣孔孔隙面積雖只占葉片表面積的5%左右，但它的水分散失量卻相當(dāng)于一個(gè)沒(méi)有角質(zhì)層相似結(jié)構(gòu)的70%之多[10]。本研究以紫花苜蓿為試驗(yàn)材料，采用掃描電鏡技術(shù)，討論了短期鹽脅迫對(duì)紫花苜蓿氣孔的形態(tài)結(jié)構(gòu)、氣孔密度及氣孔大小的影響，旨在探討葉片氣孔特征與耐鹽性的關(guān)系，為提高植物抗鹽性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究材料

供試苜蓿為公農(nóng)一號(hào)紫花苜蓿種子（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草地研究所提供）。

1.2 研究方法

采用盆栽法，選取公農(nóng)一號(hào)紫花苜蓿種子，用0.5%次氯酸鈉消毒20 min，沖洗干凈后，將其均勻播種于放好基質(zhì)的小花盆里（播種基質(zhì)為輕質(zhì)的蛭石），之后用Hoagland培養(yǎng)液澆透。于室內(nèi)（25±1） ℃培養(yǎng)30 d后，用營(yíng)養(yǎng)液配制的0%，0.3%，0.9%，1.5%NaCl鹽溶液分別進(jìn)行處理。在處理后的0，1，2，3，24 h取新鮮葉片，用磷酸緩沖液（pH=7.2）洗凈葉表皮后，將葉片切成合適大小，在2.5%戊二醛中固定3～4 h，再用磷酸緩沖液清洗3～4次洗去多余的戊二醛，而后經(jīng)30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%（兩次）梯度乙醇逐級(jí)脫水，每次脫水時(shí)間15 min，最后用無(wú)水乙醇與醋酸異戊酯比例為2∶1，1∶1的溶液和純醋酸異戊酯置換乙醇，各15 min。干燥及金屬導(dǎo)電處理后使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察并照相。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

（1） 氣孔長(zhǎng)度、寬度的測(cè)定：氣孔長(zhǎng)度是啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度；氣孔寬度是垂直于啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞的最寬值。

（2） 氣孔開(kāi)度測(cè)定：氣孔的孔徑寬度。

（3） 氣孔密度：按每平方毫米的氣孔數(shù)計(jì)算氣孔密度。

（4） 潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)（Potential conductance index， PCI）：氣孔長(zhǎng)度的平方與氣孔密度乘積[11]。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件處理后，采用SPSS 13.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行相關(guān)性分析與顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)0.3%，0.9%，1.5%NaCl脅迫處理后，以?huà)呙桦婄R觀測(cè)苜蓿葉片氣孔的變化情況，對(duì)照及0.3%NaCl處理1，2，3，24 h后氣孔的形態(tài)如圖1（0～4）所示，0.9%NaCl處理1，2，3，24 h后氣孔的形態(tài)如圖1（5～8）所示，1.5%NaCl處理1，2，3，24 h后氣孔的形態(tài)如圖1（9～12）所示。

2.1 鹽脅迫下氣孔長(zhǎng)度、寬度的變化

不同濃度鹽處理對(duì)苜蓿葉片的氣孔長(zhǎng)度和寬度影響如表1和表2所示：氣孔長(zhǎng)度和寬度隨著鹽脅迫程度的增加呈下降趨勢(shì)，且對(duì)氣孔寬度的影響更為明顯。與對(duì)照相比，1.5%NaCl處理24 h后，氣孔長(zhǎng)度和寬度的下降幅度分別為25.19%和48.04%。鹽處理24 h后氣孔長(zhǎng)度與寬度有所恢復(fù)，0.3%，0.9%，1.5%鹽濃度的氣孔長(zhǎng)度分別恢復(fù)為原來(lái)的96.18%，89.31%，74.81%，而氣孔寬度也分別恢復(fù)為原來(lái)的81.37%，66.67%，51.96%。

2.2 鹽脅迫下氣孔開(kāi)度的變化

不同濃度鹽處理對(duì)苜蓿葉片的氣孔開(kāi)度的影響如表3所示。由表3可知，鹽脅迫可誘導(dǎo)苜蓿氣孔開(kāi)度快速減小，以避免水分的蒸騰，減少由鹽分帶來(lái)的水分脅迫并有效防止高滲溶液的進(jìn)入。鹽處理1 h 后即可觀察到不同NaCl濃度均可使氣孔有不同程度的關(guān)閉，處理3 h后，0.3%， 0.9%，1.5%NaCl可使氣孔開(kāi)度分別縮小至對(duì)照的79.31%，51.72%，31.03%，與對(duì)照有顯著性差異。在處理24 h后，0.3%和0.9%NaCl可使氣孔開(kāi)度恢復(fù)為對(duì)照的82.14%，53.57%。而1.5%NaCl處理后，氣孔開(kāi)度恢復(fù)很慢，到24 h時(shí)，僅為對(duì)照的32.14%。這說(shuō)明苜蓿在一定程度鹽脅迫下可快速產(chǎn)生自身調(diào)節(jié)機(jī)制，作出適應(yīng)性變化，顯示出較好的抗鹽性。

2.3 鹽脅迫下氣孔密度與潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)的變化

不同濃度鹽處理對(duì)苜蓿葉片的氣孔密度及潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)的影響如表4和表5所示。鹽處理后葉片的氣孔密度在3 h內(nèi)幾乎沒(méi)有變化，24 h后可以看出略有上升趨勢(shì)，1.5%NaCl處理氣孔密度達(dá)到最大，為217個(gè)·mm-2，與對(duì)照有顯著差異，是未經(jīng)處理的1.26倍。苜蓿這種氣孔密度變化的規(guī)律性可能是為了保證一定的光合氣孔面積，即在調(diào)節(jié)水分平衡的同時(shí)也維持光合作用的平衡。潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)的變化規(guī)律與氣孔開(kāi)度的變化相一致，即在前期持續(xù)下降后于24 h開(kāi)始隨不同鹽濃度出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)。

氣孔特征與鹽濃度及處理時(shí)間的相關(guān)性分析結(jié)果如表6所示。相關(guān)分析顯示，鹽濃度與氣孔密度未達(dá)到顯著相關(guān)，但與氣孔長(zhǎng)度、氣孔寬度、氣孔開(kāi)度及潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，即隨著NaCl濃度的增加，上述指標(biāo)逐漸減??；而脅迫時(shí)間與氣孔長(zhǎng)度、氣孔寬度、氣孔開(kāi)度及潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)均未達(dá)到顯著相關(guān)，但與氣孔密度呈顯著正相關(guān)：這說(shuō)明氣孔長(zhǎng)度、氣孔寬度、氣孔開(kāi)度及潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)在鹽處理后可快速做出適應(yīng)性反應(yīng)，只是隨鹽濃度的不同出現(xiàn)幅度的變化，而氣孔密度對(duì)鹽的響應(yīng)稍慢于上述指標(biāo)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)變化趨勢(shì)逐漸明顯。

3 結(jié)論與討論

植物生長(zhǎng)在復(fù)雜的自然界環(huán)境中，既接受周?chē)h(huán)境提供的生長(zhǎng)所需條件，同時(shí)也承受著不良因素的影響。鹽分對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有一定的抑制作用，但有些植物在鹽生環(huán)境中仍能生長(zhǎng)，這說(shuō)明植物為了適應(yīng)不良環(huán)境，會(huì)在生理及結(jié)構(gòu)上做出適應(yīng)性調(diào)整。研究表明：葉片在外界環(huán)境的影響下變異性和可塑性最大，即葉對(duì)生態(tài)條件的反映最為明顯[12]。在鹽脅迫后的葉片中，有3個(gè)指標(biāo)是公認(rèn)的衡量植物耐鹽性強(qiáng)弱的重要生理指標(biāo)：清除植物體內(nèi)活性氧，維持體內(nèi)代謝平衡的抗氧化酶活性，膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛的含量以及有機(jī)滲透調(diào)節(jié)劑脯氨酸的積累 [13-15]。近年來(lái)影響到這些生理功能變化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)逐漸成為植物抗逆研究中較為活躍的領(lǐng)域。氣孔通過(guò)保衛(wèi)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)控制著CO2的吸收以及水蒸氣的散失，即影響著植物生長(zhǎng)極其重要的光合和蒸騰作用兩大重要過(guò)程[16]。Downton等[17-18]在對(duì)菠菜和葡萄的研究中發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，植物的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度均下降，以減少Na+向葉片的運(yùn)輸，增強(qiáng)自身的抗鹽能力。此外，植物氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞還可以通過(guò)Na+、K+的選擇來(lái)維持離子平衡[19]。

為了分析鹽脅迫與氣孔開(kāi)度的關(guān)系，本研究利用掃描電鏡觀察了鹽脅迫下植物的葉片氣孔特征的適應(yīng)性變化規(guī)律，探討了葉片氣孔特征與耐鹽性的關(guān)系。從觀察結(jié)果看，鹽處理1 h后就可從掃描電鏡中觀察到在不同鹽濃度下氣孔的縮短與變窄的現(xiàn)象，且對(duì)寬度的抑制作用更為明顯。氣孔開(kāi)度也開(kāi)始下降，這說(shuō)明苜蓿葉片已經(jīng)快速地接受到外界鹽分濃度變化的信號(hào)，對(duì)自身結(jié)構(gòu)做出調(diào)整以進(jìn)行防御性保護(hù)，且氣孔開(kāi)度的下降隨鹽濃度的增加更加明顯（r =-0.582**）。但氣孔開(kāi)度的下降在減少水分蒸發(fā)、維持水分平衡的同時(shí)也降低了光合作用，所以筆者在處理24 h后發(fā)現(xiàn)不同濃度處理組都開(kāi)始出現(xiàn)了不同程度的恢復(fù)現(xiàn)象，0.3%鹽處理恢復(fù)到對(duì)照的82.14%，可能是對(duì)鹽分有了一定的適應(yīng)性。1.5%鹽處理也恢復(fù)到對(duì)照的32.14%，但開(kāi)始出現(xiàn)畸形氣孔。此外，氣孔密度也于處理24 h后出現(xiàn)明顯增加，這就在保證不損失過(guò)多水分的同時(shí)也增加了光合作用的氣孔面積。

本研究?jī)H從苜蓿耐鹽性和其葉片氣孔結(jié)構(gòu)特征之間的相關(guān)性入手做了一些初步的分析，希望能在此基礎(chǔ)之上利用相關(guān)技術(shù)對(duì)其耐鹽機(jī)理進(jìn)行更深入的研究，從而為植物的抗鹽選育提供新的理論依據(jù)。

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