基于16S rRNA測序的植茶溫室土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)研究

摘要：為了明確溫室栽培模式對茶園土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，找尋溫室栽培、露天栽培模式之間的差異指示種，以更科學(xué)地為管理溫室茶園提供理論依據(jù)。采用NovaSeq 6000高通量測序技術(shù)，以及主坐標(biāo)分析（PCoA）、置換多元方差分析（Adonis）及LEfSe等分析方法對不同栽培模式茶園土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，16S rRNA測序質(zhì)控后，土壤樣品總共獲得操作分類單元（OTU）數(shù)量為11 137個（497 556條有效序列）。3個處理間共同含有200個OTU，溫室間共同含有495個OTU。茶園土壤細(xì)菌主要優(yōu)勢菌門為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門等。ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)等α多樣性指數(shù)均以露天栽培模式極顯著高于溫室。PC1和PC2主成分貢獻(xiàn)率分別為65.10%、21.55%，共解釋了86.65%（R2=0.612，P=0.001）的信息。露天栽培處理差異指示種為酸桿菌門（Acidobacteriota）、Acidobacteriae等。溫室處理指示種為羅丹諾桿菌科（Rhodanobacteraceae）、黃單胞菌目（Xanthomonadales）、弗蘭克氏菌目（Frankiales）等。以上研究結(jié)果為從微生物水平上研究溫室栽培模式對茶園土壤生態(tài)質(zhì)量的影響提供了參考。

關(guān)鍵詞：溫室；茶園；土壤細(xì)菌；α多樣性；β多樣性；群落結(jié)構(gòu)；高通量測序

中圖分類號：S182；S571.106" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）13-0235-06

茶樹設(shè)施栽培技術(shù)為一種新型的可控性相對較高的茶樹栽培管理模式，可提早開采名優(yōu)綠茶的時間，降低茶樹免受霜凍、“倒春寒”等危害［1］。智能玻璃溫室為結(jié)合了現(xiàn)代計(jì)算機(jī)及傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)設(shè)施。細(xì)菌、真菌和放線菌等茶園土壤微生物是茶園生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。在數(shù)量上，茶園土壤的主要微生物為細(xì)菌。溫室栽培土壤與露天栽培土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯的差異，如孫曉東等曾在溫室土壤中分離得到3個我國新記錄種［2］。茶園土壤細(xì)菌數(shù)量受到多種因素的影響，包括植茶年限、種植模式、農(nóng)業(yè)管理方式以及季節(jié)變化等［3-13］。當(dāng)前，茶園土壤細(xì)菌群落的研究主要集中于不同土壤類型、不同農(nóng)業(yè)措施的影響等方面，尚未見玻璃溫室栽培對茶園細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性影響的報道［14-21］。土壤微生物可直接或間接影響土壤理化性質(zhì)以及生物特性［22］。探索土壤中微生物的多樣性、群落結(jié)構(gòu)，闡明農(nóng)作物基于不同農(nóng)業(yè)種植模式的土壤環(huán)境質(zhì)量以及功能結(jié)構(gòu)差異的發(fā)生機(jī)制已成為近年來的研究熱點(diǎn)。

本研究采用高通量測序技術(shù)，研究玻璃溫室下茶園土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)，闡明溫室栽培模式下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，旨在為溫室栽培茶園土壤生態(tài)環(huán)境改善和茶園施肥管理技術(shù)提供數(shù)據(jù)支撐以及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于福建省福安市社口鎮(zhèn)（119°57′E，22°22′N）。溫室坐北朝南，長、寬分別為21、18 m。溫室北端用隔斷隔開，并從東向西依次設(shè)立6個玻璃小室（3 m×3 m）；露天茶園位于溫室南端。溫室內(nèi)外種植茶樹品種為金牡丹，單行雙株條栽種植，行、株距分別為1.50、0.33 m，培肥管理一致。試驗(yàn)地屬于亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，海拔91 m，年均氣溫13.4～20.2 ℃，年均降水量1 250～2 350 mm，無霜期235～300 d。溫室外土壤有機(jī)質(zhì)含量1.20%，硝態(tài)氮含量27.42 mg/kg，銨態(tài)氮含量2.72 mg/kg。溫室內(nèi)土壤有機(jī)質(zhì)含量1.13 %，硝態(tài)氮含量377.60 mg/kg，銨態(tài)氮含量201.28 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及采樣方法

試驗(yàn)按露天A（X）、溫室B（18 m×18 m，Y）、溫室C（3 m×3 m，Y）栽培模式設(shè)置3個處理。2022年9月，取0～20 cm耕層土壤（五點(diǎn)采樣法），將土壤混勻剔雜，存于-80 ℃超低溫冰箱，重復(fù)3次，用于后續(xù)土壤 DNA的提取。

1.3 DNA提取及高通量測序

土壤總DNA采用試劑盒提取。PCR上游引物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；下游引物：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAATC-3′。 DNA及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)檢測量：1%、2%瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物回收質(zhì)檢后，采用Illumina NovaSeq 6000平臺進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 Trimmomatic v0.33、Cutadapt 1.9.1軟件及QIIME2 2020.6中的dada 2方法等對測序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、引物識別與去除、去噪。OTU聚類采用RDP classifier貝葉斯算法（97%相似水平），隨后對OTU的代表序列作物種注釋并計(jì)算相對豐度。α多樣性、β多樣性評估使用QIIME2 2020.6軟件。采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同栽培模式土壤OTU分布

測序質(zhì)控后，9個土壤樣品總共獲得497 556條有效序列（OTU數(shù)為11 137）。本研究中的3組處理覆蓋度為99.97%，稀疏曲線（圖 1）漸趨平緩，表明各樣本測序量充分，達(dá)到了較好的反映細(xì)菌群落的種類與數(shù)量的程度。

2.2 不同栽培模式土壤Venn圖

由圖2可知，露天A共有6 674個OTU，溫室B共有3 724個OTU，溫室C共有4 298個OTU。3個處理間共同含有200個OTU，溫室間共同含有495個OTU。露天栽培特有4 978個OTU，溫室B栽培特有2 432個OTU，溫室C特有2 886個OTU。

2.3 不同栽培模式土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

提取OTU代表序列（97%相似水平）進(jìn)行分類學(xué)分析（RDP classifier貝葉斯算法），結(jié)果（圖3）表明，不同栽培模式土壤細(xì)菌門水平主要優(yōu)勢菌群為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）等。酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）等在露天栽培茶園土壤中相對豐度較高；放線菌門（Actinobacteria）、髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）等在溫室栽培茶園土壤中相對豐度較高。在綱水平上，優(yōu)勢菌群為酸桿菌綱、放線菌綱、γ-變形菌綱等。

2.4 不同栽培模式的土壤細(xì)菌α多樣性分析

α多樣性指數(shù)（QIIME2 2020.6軟件）結(jié)果（表1）表明，不同栽培模式Chao1指數(shù)差異顯著，露天A極顯著最高（Plt;0.01），溫室B顯著最低（Plt;0.05），溫室間差異顯著。ACE指數(shù)與Chao1指數(shù)在不同處理間表現(xiàn)的趨勢一致，表明露天A的物種總數(shù)顯著最多。Simpson指數(shù)、Shannon 指數(shù)均以露天A極顯著高于溫室，溫室間差異不顯著。

2.5 不同栽培模式土壤細(xì)菌β多樣性分析

2.5.1 不同栽培模式土壤細(xì)菌群落的主坐標(biāo)分析

為探究不同栽培模式間土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，對土壤細(xì)菌群落進(jìn)行PCoA和Adonis分析（基于weighted_unifrac），結(jié)果（圖4）表明，PC1和PC2 2個主成分貢獻(xiàn)率分別為65.10%、21.55%，共解釋了86.65%（R2=0.612，P=0.001）的信息，3種栽培模式均在模式間能很好地聚在一起，且不同模式之間能較好地分開。露天A分布在PC1的負(fù)軸，溫室B、C均分布在PC1的正軸。溫室處理圍繞PC2軸完全分開，溫室B分布在PC2的負(fù)軸，溫室C分布在PC2的正軸，表明露天A、溫室間土壤細(xì)菌群落水平上有明顯差異。

2.5.2 組間差異顯著性LEfSe

對溫室與露天栽培茶園土壤進(jìn)行LEfSe（LDAgt;4.5、Plt;0.05），結(jié)果（圖5）表明，露天栽培處理差異指示種為酸桿菌門（Acidobacteriota）、Acidobacteriae。溫室栽培茶園土壤中差異指示種為羅丹諾桿菌科（Rhodanobacteraceae）、放線菌門（Actinobacteriota）、朱氏桿菌屬（Chujaibacter）、放線菌綱（Actinobacteria）、熱酸菌屬（Acidothermus）、黃單胞菌目（Xanthomonadales）、弗蘭克氏菌目（Frankiales）、未分類朱氏桿菌（unclassified Chujaibacter）、熱酸菌科（Acidothermaceae）等。上述物種均對溫室栽培茶園土壤和露天栽培茶園土壤之間群落結(jié)構(gòu)組成的差異產(chǎn)生重要的作用。

2.6 相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

斯皮爾曼（Spearman ）秩相關(guān)分析（Rgt;0.1，Plt;0.05）結(jié)果（圖6）表明，負(fù)相關(guān)的屬為硝化螺旋菌屬（Nitrospira）與朱氏桿菌屬（Chujaibacter）、赭黃嗜鹽囊菌屬（Haliangium）與乳桿菌屬（Lactobacillus）、潮濕桿菌屬（Humibacter）與鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等；正相關(guān)的屬為Nitrolancea與朱氏桿菌屬（Chujaibacter）、叢生放線菌屬（Actinospica），乳桿菌屬（Lactobacillus）與Jatrophihabitans等。

2.7 BugBase表型預(yù)測

利用BugBase對細(xì)菌群落進(jìn)行表型預(yù)測分析，得到不同表型細(xì)菌在不同樣本中的豐度比例與差異。露天革蘭氏陰性菌、氧化脅迫耐受菌豐度表現(xiàn)為明顯高于溫室，而生物膜形成、革蘭氏陽性菌、需氧菌明顯低于溫室（圖7）。

3 討論與結(jié)論

微生物區(qū)系的演變（數(shù)量、組成結(jié)構(gòu)）為重要的生物指標(biāo)，可以反映土壤環(huán)境質(zhì)量變化，其中土壤細(xì)菌為一種重要組分［23-26］。采用高通量測序技術(shù)對溫室茶園土壤和露天茶園土壤進(jìn)行了細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析。α多樣性分析結(jié)果表明，ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)均以露天栽培土壤高于溫室栽培土壤，說明溫室栽培降低了茶園細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。在對溫室茶園的栽培管理中可考慮增施有機(jī)肥、微生物菌肥等農(nóng)藝措施以增加其土壤微生物多樣性。不同栽培模式土壤細(xì)菌主要優(yōu)勢菌門為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門等。其中，露天栽培茶園土壤中的優(yōu)勢菌門為酸桿菌門、芽單胞菌門等，溫室栽培茶園土壤中的優(yōu)勢菌門為放線菌門、變形菌門以及厚壁菌門等。酸桿菌門能夠?qū)ψ魑餁報w多聚物進(jìn)行降解，并進(jìn)行一定的光合作用。酸桿菌門、芽單胞菌門等門的細(xì)菌可產(chǎn)生如抗生素、抗真菌劑、鐵載體等多種次級代謝產(chǎn)物，介導(dǎo)與其他生物體與其所在環(huán)境間的溝通、競爭以及相互作用。放線菌門可較好地吸收環(huán)境中的營養(yǎng)成分，并作為抗生素的來源（70%）；厚壁菌門通過產(chǎn)生芽孢，防御外界有害因子的闖入，從而具有較強(qiáng)的抗逆性［27］。變形菌門與能量代謝有關(guān)。固氮菌群主要分布于變形菌門、厚壁菌門和藍(lán)藻菌門，可見溫室栽培茶園土壤菌群具有較好的固氮能力［28］。

PCoA、Adonis及LEfSe結(jié)果表明，不同栽培方式茶園土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)存在差異，露天栽培處理差異指示種為酸桿菌門（Acidobacteriota）、Acidobacteriae。溫室栽培茶園土壤中差異指示種為羅丹諾桿菌科（Rhodanobacteraceae）、放線菌門（Actinobacteriota）、朱氏桿菌屬（Chujaibacter）、放線菌綱（Actinobacteria）、熱酸菌屬（Acidothermus）、黃單胞菌目（Xanthomonadales）、弗蘭克氏菌目（Frankiales）、未分類朱氏桿菌、熱酸菌科（Acidothermaceae）等。熱酸菌屬可起到分解有機(jī)質(zhì)、利用碳源的作用［29］。熱酸菌屬（從科到屬）為溫室栽培茶園土壤中的差異指示種，與杜思瑤等研究的有機(jī)設(shè)施種植土壤中熱酸菌屬相對豐度顯著較大［29］結(jié)論一致。通過BugBase表型預(yù)測發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性菌、氧化脅迫耐受菌豐度表現(xiàn)為露天明顯高于溫室，而生物膜形成、革蘭氏陽性菌、需氧菌則表現(xiàn)出相反的趨勢。

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