植物莖尖再生與遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究進展

摘要：植物莖尖的分裂和分化能力強，是良好的植物再生和遺傳轉(zhuǎn)化外植體。建立簡單高效的莖尖再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，在植物基因功能驗證、性狀改良、新品種培育等方面發(fā)揮重要作用，從而促進基因工程發(fā)展。本文介紹了莖尖分生組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并簡述了影響莖尖干細胞分化的調(diào)節(jié)因子及其在莖尖中的調(diào)控機制，以期加深人們對植物莖尖發(fā)育調(diào)控的認識，為植物莖尖再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供理論基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，本文綜述了外植體苗齡、莖尖處理方式、培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、溫度等因素對植物莖尖再生體系的影響，并重點討論和概述了當前影響植物莖尖遺傳轉(zhuǎn)化效率的主要原因，包括預(yù)培養(yǎng)、莖尖處理方式、侵染方式、菌液濃度及侵染時間、乙酰丁香酮（AS）濃度、共培養(yǎng)時間、篩選劑等因素。結(jié)果表明，對莖尖外植體進行適當預(yù)培養(yǎng)和處理、在侵染過程中輔助AS或超聲波、選擇合適的侵染菌液濃度和共培養(yǎng)時間有利于提高植物莖尖的遺傳轉(zhuǎn)化效率。在此基礎(chǔ)上，本文進一步探討了選擇合適的基因轉(zhuǎn)化方法、載體類型和優(yōu)化載體元件提高遺傳轉(zhuǎn)化效率的可行性，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化載體上添加發(fā)育調(diào)節(jié)因子是促進植物再生的一種有效策略，推測該方法在植物莖尖研究中具有應(yīng)用潛力。此外，本文簡述了基因編輯發(fā)展現(xiàn)狀，總結(jié)了目前發(fā)育調(diào)節(jié)因子在基因編輯中的應(yīng)用，并對目前遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)優(yōu)化和應(yīng)用的研究熱點進行了討論，對未來莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)化和應(yīng)用進行了展望。

關(guān)鍵詞：莖尖；再生；遺傳轉(zhuǎn)化；細胞分化；基因工程

中圖分類號：S184" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）13-0001-12

隨著人口數(shù)量的增長、社會經(jīng)濟的飛速發(fā)展、人民生活水平的提高以及生態(tài)環(huán)境氣候的變化，人們對植物的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性的要求日益提高。因此，快速開發(fā)和培育出更多新種質(zhì)植物以滿足生活、生產(chǎn)需求是解決這一問題的關(guān)鍵。然而，常規(guī)育種難以解決植物種質(zhì)資源貧乏、優(yōu)良品種退化、遠緣雜交困難、有益性狀結(jié)合困難等問題，無法滿足人們?nèi)粘Ｉ詈蜕a(chǎn)的需求?；蚬こ碳夹g(shù)為植物產(chǎn)量的提高、品質(zhì)的改良和抗性的增強開辟了一條全新路徑。高效的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系是植物基因工程的基礎(chǔ)和核心。實踐證明，從植物不同部位培養(yǎng)出的外植體材料已被嘗試用于建立高效的再生體系［1］。其中，莖尖外植體具有很強的分裂和分化能力，以其作為受體進行轉(zhuǎn)化容易獲得再生植株［2］。莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是以莖尖為轉(zhuǎn)化受體，經(jīng)愈傷組織誘導出不定芽，繼而形成完整轉(zhuǎn)化植株的技術(shù)，具有再生相對簡單、轉(zhuǎn)化周期短、無基因型限制等優(yōu)點［3］。目前，許多植物通過莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)均獲得了再生植株，如水稻、小麥、黑麥草、玉米、珍珠黍、高粱、矮牽牛、早熟禾、大豆、豌豆等［1，4-6］。農(nóng)桿菌介導法是莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的主要轉(zhuǎn)化途徑，其介導轉(zhuǎn)入的外源基因拷貝數(shù)低、片段完整性好、遺傳穩(wěn)定性優(yōu)良、易于育種利用，但該方法也受到農(nóng)桿菌宿主專一性、受體材料基因型等因素的限制，導致轉(zhuǎn)化效率較低［2，7］。為了建立高效的莖尖再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，促進基因工程的發(fā)展，對其進行相關(guān)研究迫在眉睫。

本文結(jié)合國內(nèi)外研究進展，對影響植物莖尖再生和農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化效率及植物遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素等進行綜述，旨在為進一步利用莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進行植物轉(zhuǎn)基因育種奠定基礎(chǔ)。

1 莖尖分生組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)與發(fā)育

分生組織是高等植物產(chǎn)生與分化各種器官的基礎(chǔ)［8］。分生組織在植物體內(nèi)可以分為頂端分生組織和側(cè)生分生組織，其中頂端分生組織中的莖尖分生組織（SAM）在植物胚發(fā)育時形成，是植物營養(yǎng)發(fā)育、器官分化的起點［9］。SAM的維持和分化涉及生長素、細胞分裂素和多肽的相互作用，例如不敏感受體激酶CLV3能夠協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄因子WUS基因的表達，CLV3肽會反過來抑制WUS基因的表達，從而形成一個反饋循環(huán)，有助于維持細胞功能［10］。根據(jù)原套-原體學說，從總體上看莖尖分生組織可以分為原套、原體2個部分，其中L1、L2層的細胞組建成了原套，原體則是由L3層及以下多層細胞構(gòu)成的。除了上述學說之外，又可以按照分區(qū)學說劃分為中央分生組織區(qū)（CZ）、肋狀分生組織區(qū)（RZ）和外緣分生組織區(qū)［11］（PZ）（圖1）。其中，CZ區(qū)由全能干細胞組成，處于未分化狀態(tài)，植物細胞分裂周期長，分裂頻率低，因此CZ區(qū)是進行莖尖組織培養(yǎng)的最佳選擇［12］。植物分生組織分化成成熟器官在一定程度上由發(fā)育調(diào)節(jié)因子決定，如在擬南芥中，這類調(diào)節(jié)因子包括WUS、端分生組織特異調(diào)控因子STM和CLV3［13］。WUS基因在維持植物干細胞群數(shù)量上具有關(guān)鍵的調(diào)控作用［14-15］。WUS對分生組織的功能至關(guān)重要，若WUS轉(zhuǎn)錄因子基因發(fā)生突變，則會導致SAM丟失。STM基因?qū)ηo端分生組織的建成與維持都具有非常重要的作用［16］。莖尖干細胞的增殖由CLV3控制［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，WUS和STM發(fā)生直接的相互作用，并能共同結(jié)合CLV3基因的啟動子以激活其表達，從而調(diào)控莖端分生組織干細胞活性［16］。

2 植物莖尖再生技術(shù)研究進展

大量國內(nèi)外研究報道證實，植株苗齡的選擇、莖尖處理方式、培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、溫度和光照均會影響莖尖的從頭再生。

2.1 植株苗齡的選擇

植株的苗齡是影響再生過程中的一個因素。選擇生長活躍、生理代謝旺盛的細胞或組織作為外植體，能較快獲得再生植株［18-19］，甘薯莖尖經(jīng)44 d培養(yǎng)后，得到無菌試管苗，而其他外植體（如莖段、葉片和葉柄）發(fā)生不同程度的黃化、褐化，枯萎等現(xiàn)象，再生率降低，污染率升高［20］。大多數(shù)植物在幼苗發(fā)育階段的外植體比成熟階段的外植體具有更強的形態(tài)發(fā)生能力。隨著植物的發(fā)育，器官的再生能力會逐漸減弱甚至完全消失［21］。Long等調(diào)查了不同苗齡的玉米幼苗莖尖的愈傷誘導率，發(fā)現(xiàn)2～6 cm 長的幼苗誘導愈傷率最高，大于6 cm、小于 2 cm 的幼苗褐變率較高，不利于植物再生。適當苗齡的植物細胞的生長活性最強，再生效果好，反之，再生效果則差［22］。胡有良等在構(gòu)建大麥莖尖再生體系時發(fā)現(xiàn)，3 d苗齡的大麥莖尖愈傷誘導率最高，10 d苗齡的莖尖愈傷未分化，其他苗齡（1、2、5、8 d）莖尖的誘導率均不理想［23］。

在植物中，常采用莖尖進行組織培養(yǎng)得到無菌苗。因此在選擇外植體植株苗齡時，要根據(jù)植物的種類、生長特性進行綜合考慮。

2.2 莖尖處理方式

莖尖處理方式也會影響愈傷誘導率，傷口過小時，不易于形成愈傷組織，傷口過大時，易造成污染和死亡。大多數(shù)禾本科植物取2～6 mm的莖尖接種到培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)便可成功建立再生體系，如谷子［24］、高粱［25］。為了明確大麥莖尖高頻再生體系的影響因素，胡有良等研究了大麥莖尖切段的大小對大麥莖尖愈傷誘導率和植物再生的影響，發(fā)現(xiàn)切取大麥莖尖頂端分生組織2 mm時的效果最好，莖尖愈傷誘導率、植株再生率分別為93.9%、311%［23］。將帶葉原基的莖尖縱向均分為2份時，芽增殖最多，去除葉原基直接接種則會在操作時耗損時間，相同時間內(nèi)產(chǎn)生的愈傷組織較少，芽分化率低［25］。莖尖的傷口適量增大有助于愈傷組織形成，對提高再生效率有一定的影響。

2.3 培養(yǎng)基

植物莖尖再生采用的基本培養(yǎng)基主要有MS、NBKNB、B5、N6培養(yǎng)基，可以通過添加不同種類及濃度的生長調(diào)節(jié)劑來進行愈傷組織、芽分化和生根的誘導，其中MS培養(yǎng)基具有普遍適用性，生根時多采用1/2MS作為基本培養(yǎng)基。在桂花莖尖的培養(yǎng)過程中，初代培養(yǎng)的最適基本培養(yǎng)基是B5培養(yǎng)基。與MS培養(yǎng)基相比，B5培養(yǎng)基中的銨鹽濃度更低，推測桂花更適合銨濃度較低的生長環(huán)境［26］。草莓莖尖愈傷誘導和繼代培養(yǎng)均使用MS培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基中含有較高濃度的無機鹽，可以充分滿足幼胚的正常生長。草莓幼苗的生根過程不需要太多營養(yǎng)物質(zhì)，且少量營養(yǎng)物質(zhì)有助于植物更好地適應(yīng)環(huán)境，使用1/2MS培養(yǎng)基的效果較好，成活率達96%［27］。綜上，MS培養(yǎng)基在植物莖尖誘導培養(yǎng)中使用得最多，1/2MS培養(yǎng)基則多應(yīng)用于不定芽的分化和生根。在實際組織培養(yǎng)過程中，要根據(jù)植物種類、培養(yǎng)階段來選擇合適的培養(yǎng)基，同時碳源、植物生長調(diào)劑和其他培養(yǎng)物的添加也十分重要。

此外，碳源是植物再生過程中的重要成分。葡萄糖、蔗糖和麥芽糖是植物莖尖再生培養(yǎng)基常用的碳源，可為植物再生提供能量，是調(diào)節(jié)滲透環(huán)境的主要因子。在植物體細胞胚胎發(fā)生期間，低蔗糖濃度有利于體細胞胚胎形成［22］。此外，適宜濃度的蔗糖對誘導愈傷組織有促進作用，但是過高的蔗糖濃度可能會導致愈傷組織在繼代培養(yǎng)中褐化甚至死亡［28］。在用谷子莖尖愈傷誘導體細胞胚時，需要提高糖濃度，且蔗糖相較于葡萄糖更適合愈傷的形成［24］，可能由于葡萄糖的滲透壓較高，易造成細胞失水，從而不利于莖尖再生培養(yǎng)。當銀杏莖尖再生在無蔗糖的培養(yǎng)基上時，無褐化情況，并且有明顯的生長趨勢。隨著蔗糖濃度的升高，銀杏莖尖的生長越弱，褐化現(xiàn)象越嚴重，更易污染［29］。在組織培養(yǎng)過程中去除糖后，增強了光合作用，減少了褐化，成活率得到提高。

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑及其他物質(zhì)

植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度配比是外植體的形態(tài)建成的關(guān)鍵。細胞分裂素、生長素類物質(zhì)是最常用的植物生長調(diào)節(jié)劑。細胞分裂素是培養(yǎng)過程中廣泛用于不定芽誘導的激素。常用的細胞分裂素包括6-芐基腺嘌呤（6-BA）、噻二唑苯基脲（TDZ）、激動素（KT）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）［30］。對長白落葉松莖尖進行再生研究發(fā)現(xiàn)，在 6-BA 與 2，4-D 組合配比處理下，愈傷增殖快，質(zhì)地疏松，適于后續(xù)分化培養(yǎng)［31］。此外，其他生長素也在促進組織培養(yǎng)、再生過程中發(fā)揮了重要作用。當6-BA和NAA濃度之比較高時，植物易出芽；當兩者濃度之比較低時，植物易生根。在草莓莖尖再生試驗中，用005 mg/L NAA+0.10 mg/L 6-BA作為培養(yǎng)基，莖尖誘導率達71.11%，當6-BA濃度為0.40 mg/L時，苗變短，若不添加6-BA，則幼苗長勢變?nèi)酰?7］。

生長素是再生過程中最重要的決定因素。外源生長素通過誘導乙烯合成的外源性前體的產(chǎn)生，從而促進外植體的愈傷組織的形成。2，4-D是一種合成生長素，廣泛用于多個物種的試驗中。2，4-D濃度會影響愈傷組織的形成，并且最佳濃度因不同物種或基因型而異。在谷子莖尖再生體系中，增加 2，4-D 濃度后，長生06、長農(nóng)35的愈傷誘導率上升，但是晉谷21的愈傷誘導率降低［24］。2，4-D也常與其他激素聯(lián)合使用。在高粱莖尖再生過程中，當KT濃度為0.25 mg/L時，愈傷組織產(chǎn)生大量根；當KT濃度大于0.5 mg/L時，則產(chǎn)生較多芽而不是愈傷組織；當2，4-D濃度小于0.5 mg/L時，植株的再生能力較差。因此可見，愈傷組織誘導出芽效率最高的激素組合是0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT［32］。

此外，在莖尖再生培養(yǎng)基上添加氨基酸類物質(zhì)能有效提高莖尖的再生效率。其中，添加甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）和酪蛋白水解物（AHC）能夠提高洋蔥莖尖的愈傷誘導率，從而進一步提高其再生效率［7］。在MS培養(yǎng)基中添加甘露醇或硝酸銀，能夠提高單倍體玉米莖尖愈傷組織的質(zhì)量［22］。在海南龍竹莖尖再生中添加谷氨酰胺（Gln）、脯氨酸（Pro）和酪蛋白水解物（AHC）后，對愈傷組織芽的誘導率達51.65%，可能是由于有機添加劑來源多樣化，提高了愈傷組織質(zhì)量，促進了芽的發(fā)生［33］。不同植物莖尖再生體系見表1。

2.5 溫度、光照等條件

植物莖尖的培養(yǎng)取決于植物自身的培養(yǎng)習性和植物莖尖生長狀態(tài)，在適宜的光照度、時間等作業(yè)條件下，有利于其再生。例如，將大麥莖尖在光照度為3 000 lx、光照時間為16 h/d的條件下進行培養(yǎng)，再生率最高［23］；將白芨莖尖在光照度為1 593 lx、光照時間為12 h/d的條件下進行培養(yǎng)，成活率高達90%［37］；當光照度為2 400～2 900 lx、光照時間為 14 h/d 時，草莓莖尖的再生率為96%［27］。若植物的光照度減弱，有可能會誘導參與酚類合成和氧化的酶活性增強，從而促進酚類物質(zhì)的合成或增強酚類物質(zhì)的氧化，使褐化現(xiàn)象嚴重。

3 植物莖尖遺傳轉(zhuǎn)化研究進展

莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系用Ti或Ri質(zhì)粒將1段DNA片段通過感染植物莖尖傷口轉(zhuǎn)入到宿主細胞中，然后通過減數(shù)分裂，將其傳遞至下一代，實現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)化，具有不受季節(jié)限制、轉(zhuǎn)化周期短的優(yōu)點［3］。常規(guī)育種工作量大、周期長、效率低，因此采用莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進行種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良對于農(nóng)作物或園藝植物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義［49-50］。

3.1 莖尖預(yù)培養(yǎng)

對植物莖尖在農(nóng)桿菌浸染前進行預(yù)培養(yǎng)，有助于提高其轉(zhuǎn)化效率。在用農(nóng)桿菌對虎杖莖尖進行侵染前進行預(yù)培養(yǎng)，可以提高莖尖的再生分化率，但是當預(yù)培養(yǎng)時間過長或過短時，莖尖死亡率上升，轉(zhuǎn)化率下降，因此適當?shù)念A(yù)培養(yǎng)時間對于遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立有促進作用［5］。將黃麻莖尖置于含有篩選劑的培養(yǎng)基中進行預(yù)培養(yǎng)，隨著預(yù)培養(yǎng)時間的延長，再生率下降。當預(yù)培養(yǎng)時間為1 d時，轉(zhuǎn)化效果最佳；當預(yù)培養(yǎng)2 d以上進行侵染時，莖尖的再生率顯著下降［51］。預(yù)培養(yǎng)有利于外植體在切口處形成微愈傷，改變其生理生化狀態(tài)，促進植物組織細胞結(jié)合并連接外源基因，提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化率。

3.2 莖尖處理方式

不同的莖尖處理方式對侵染效率的影響不同，若傷口過大，則莖尖易死亡；若傷口過小，則莖尖侵染程度很低。一般直接用操作刀造成傷口，如從離體植物中解剖出3 mm長的莖尖，并放置在培養(yǎng)基上［52］。在黃麻莖尖培養(yǎng)過程中，將莖尖縱切成大小不等分的兩半，并且只培養(yǎng)較大的一半進行轉(zhuǎn)化，成功獲得轉(zhuǎn)化苗［51］。在高速渦旋過程中添加玻璃粉，可以在一定程度上對莖尖分生組織造成不可逆的傷害。在添加0.2 g玻璃粉后對84個棉花莖尖進行侵染，轉(zhuǎn)化和成苗率最高，而添加大于0.4 g玻璃粉處理80個莖尖，莖尖分生組織受到的創(chuàng)傷比較嚴重，造成嚴重褐化，少數(shù)莖尖出現(xiàn)農(nóng)桿菌污染，使轉(zhuǎn)化和成苗率下降［53］。

3.3 莖尖的侵染方式

農(nóng)桿菌的侵染方式一般是利用菌液對創(chuàng)傷細胞進行浸泡浸染。Sarkar等用直接侵泡法侵染植物表面，當菌液D600 nm為0.8、侵染時長為1 h時，木豆轉(zhuǎn)化率達到6.66%［54］。超聲波處理和真空滲透輔助的農(nóng)桿菌介導法能夠促進農(nóng)桿菌的吸附，提高轉(zhuǎn)化效率。超聲波具有空化作用，會使愈傷組織表面產(chǎn)生微孔，促進農(nóng)桿菌菌液滲透到愈傷組織中［55］，從而加速農(nóng)桿菌對植物細胞的侵染，提高轉(zhuǎn)化效率。對小麥莖尖進行超聲波處理發(fā)現(xiàn)，當時間為 20 s、頻率為5 kHz時，轉(zhuǎn)化效率顯著提高，獲得了轉(zhuǎn)基因植株［56］。此外，超聲波具有熱化作用，但是在超聲過程中會使介質(zhì)溫度升高，從而對外植體造成不可逆的傷害。因此，對于莖尖分生組織較為脆弱的外植體而言，要選擇最適宜的超頻波段和時長，從而減少外植體的損傷，提高效率［57-59］。在農(nóng)桿菌侵染莖尖愈傷的過程中輔助一定時間的真空滲入處理，可以有效提高莖尖愈傷的瞬時轉(zhuǎn)化率?？赡苡捎谠谡婵窄h(huán)境下，外界壓力能夠使農(nóng)桿菌更容易進入到愈傷組織里面，而且負壓能夠使受體材料形成更多的小傷口，從而提高侵染的機會［60］。適宜的真空滲透時間對莖尖轉(zhuǎn)化效率有促進作用，對谷子進行真空滲透處理10 min時最有利于基因的轉(zhuǎn)化，并且隨著滲透時間的延長，對莖尖的傷害越大，莖尖存活率越低，當真空滲透處理時間超過 15 min 后，存活率低于20%［61］。當對大麥真空處理5 min時，瞬時表達效率最高，其他處理時間（0、2.5、7.5、10 min）的瞬時表達效率較低［1］。真空滲透處理對提高轉(zhuǎn)化效率有一定作用，但傷害較大，因此使用該方法時，要注意外植體的質(zhì)量。

3.4 菌株濃度及侵染時間

在根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化試驗中，適當?shù)木簼舛仁寝D(zhuǎn)化成敗的關(guān)鍵因素之一，當菌液濃度過低時，會由于根癌農(nóng)桿菌數(shù)量不足而達不到侵染的目的；當菌液濃度過高時，又會因營養(yǎng)不足使菌液中的死菌數(shù)量增多，從而降低感染率（表2）。適當提高菌液濃度可提高虎杖莖尖的轉(zhuǎn)化率，當菌液的D600 nm=0.6時，轉(zhuǎn)化率是D600 nm=0.2時的2倍，但當菌液D600 nm=0.8時，轉(zhuǎn)化效率顯著降低［5］。當菌液D600 nm=0.6時，用其侵染谷子莖尖，轉(zhuǎn)化效果最佳；當菌液D600 nm=0.4或0.8時，用其侵染谷子莖尖，GUS瞬時表達效率均低于D600 nm=0.6的菌液［24］。適宜的菌液濃度對遺傳轉(zhuǎn)化效率有直接影響。用D值法檢測細菌細胞密度時，既有活菌，也有死菌，不能代表農(nóng)桿菌的真實生存能力［58］。因此，最佳菌液濃度仍需進行進一步的研究。

適宜的菌液侵染時間對植物莖尖的遺傳轉(zhuǎn)化具有重要的調(diào)控作用?；⒄惹o尖的最佳侵染時間為 10 min，轉(zhuǎn)化率達5.3%，當侵染時間為25 min時，轉(zhuǎn)化率極低且再生芽生長狀態(tài)弱，當侵染時間為 5 min 時，轉(zhuǎn)化率較差［5］。對小麥莖尖進行轉(zhuǎn)化時，農(nóng)桿菌菌液D600 nm為0.6、侵染時間為30 min為最佳轉(zhuǎn)化條件，侵染時間過長，則會產(chǎn)生死亡或者褐化現(xiàn)象，當侵染時間為40 min時，愈傷出現(xiàn)部分死亡［56］。

3.5 AS濃度

在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物材料的過程中，需要酚類化合物誘導完成，因此，外源添加酚類化合物能夠促進農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率。酚類化合物乙酰丁香酮（AS）可誘發(fā)農(nóng)桿菌內(nèi)Ti或Ri質(zhì)粒DNA上Vir區(qū)基因的活化和高效表達，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化中。

有研究發(fā)現(xiàn)，AS的有效使用濃度一般為50～400 μmol/L，適當濃度的AS在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基及共培養(yǎng)基中有促進作用［66］。在其他植物培養(yǎng)過程中，使用適宜該作物的AS含量可提高轉(zhuǎn)化效率，在玉米莖尖培養(yǎng)過程中，加入AS后，抗性愈傷誘導率顯著提高，在農(nóng)桿菌懸浮液中，當AS添加濃度達60 mg/L時，產(chǎn)生抗性植株，當AS添加濃度大于 60 mg/L 時，隨著添加AS濃度的升高，抗性植株數(shù)量迅速減少，且當AS濃度為120 mg/L時，不再產(chǎn)生抗性植株。在農(nóng)桿菌侵染后的傷口處滴加濃度為0～150 μmol/L AS發(fā)現(xiàn)，隨AS濃度升高，抗性植株增多，轉(zhuǎn)化效率提高，當?shù)渭拥腁S濃度超過 150 μmol/L 時，抗性植株數(shù)量減少［67］。在穇莖尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，當AS為100 μmol/L時，轉(zhuǎn)化效率達11.8%，而當未添加AS時，無轉(zhuǎn)化植株，此外，添加較低濃度（50 μmol/L）和較高濃度（150、200 μmol/L）AS的轉(zhuǎn)化效率均較低［63］。

3.6 共培養(yǎng)

共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌侵染外植體傷口細胞、實現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。共培養(yǎng)為農(nóng)桿菌提供適合生存的環(huán)境，促進外植體與農(nóng)桿菌接觸，使目的基因與受體基因組整合。當共培養(yǎng)時間太短時，T-DNA 轉(zhuǎn)移不能完成，使得外源基因很難整合到植物基因組中，導致轉(zhuǎn)化效率降低；當共培養(yǎng)時間太長時，農(nóng)桿菌大量增殖，導致外植體過度感染而褐化死亡［32，68-70］。適當增加共培養(yǎng)時間，對虎杖莖尖分化有促進作用，當共培養(yǎng)時間達到3 d時，分化率達到最高［5］。在木豆莖尖培養(yǎng)過程中，延長共培養(yǎng)時間會導致農(nóng)桿菌過度生長，從而影響其再生和轉(zhuǎn)化效率［54］。在黃麻莖尖培養(yǎng)過程中，設(shè)置共培養(yǎng)時間為1、2、3 d，當共培養(yǎng)時間達到3 d時，得到的GUS陽性莖尖數(shù)量最多，從而證實，適當延長共培養(yǎng)時間能夠提高轉(zhuǎn)化效率［51］。

3.7 篩選劑的選擇

在植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中，使用篩選劑可篩選抗性組織。但培養(yǎng)基中篩選劑的選擇會在一定程度上影響外植體的生理狀態(tài)［68，71］。因此，選擇合適的篩選劑對于提高陽性率有促進作用。

篩選劑需要根據(jù)導入表達載體標記基因的不同而選擇相應(yīng)的抗生素。目前，植物莖尖遺傳轉(zhuǎn)化中常用的主要篩選劑有卡那霉素（Kan）、潮霉素（Hyg）等。當小麥莖尖篩選劑Kan的濃度大于 10 mg/L 時，分化率低；當篩選時間為21 d、濃度為 5 mg/L 時，分化率最高［56］。只有選擇適宜的篩選濃度，才能產(chǎn)生較好的篩選效果。Saha等在黃麻莖尖中添加Hyg（2、4、6、10 mg/L）進行篩選，發(fā)現(xiàn)當Hyg濃度為2 mg/L時，篩選效果不明顯；當Hyg濃度為6 mg/L時，篩選效果明顯；當Hyg濃度達 10 mg/L 時，褐化現(xiàn)象嚴重，存活率降至2.22%［51］。因此，篩選劑濃度的選擇應(yīng)在篩選效果和植物再生之間取得平衡。另外，進行篩選培養(yǎng)前，根據(jù)外植體的生理狀態(tài)進行無篩選劑培養(yǎng)也是提高再生率的一個選擇。新切的莖尖十分敏感且易發(fā)生壞死，在黃麻莖尖進行普通培養(yǎng)7 d后再進行篩選培養(yǎng) 14 d，易得到狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)基因組培苗［51］。適宜的篩選時間和篩選時長可以提高轉(zhuǎn)化效率和再生效率。

4 植物遺傳轉(zhuǎn)化研究進展和優(yōu)化

4.1 遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究進展

遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是探究基因功能和開展遺傳育種的重要手段。植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可以突破不同物種間的生殖隔離，且靶標性極高［72］。人類通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，定向改良植物的遺傳性狀，獲得了新品種作物。自從人們1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因植物以來，植物基因工程的研究開始得到蓬勃發(fā)展［73］。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法具有高效、簡便、可重復性強等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于植物基因工程領(lǐng)域。基因槍法是1987年由Sanford等最先提出的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，是繼農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法后又一應(yīng)用廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)［74］。但是目前此方法只能轉(zhuǎn)移小于10" kb的DNA片段，較大的DNA片段在轟擊過程中易斷裂，導致DNA整合混亂［75］。DNA修復技術(shù)可解決DNA整合混亂。采用基因槍法將GUS基因轉(zhuǎn)化至水稻未成熟的胚中，水稻的轉(zhuǎn)化效率能提高到7692%［76］。與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法相比，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化迅速且高度穩(wěn)定［77］，但受體種類受限，且最終產(chǎn)物翻譯不準確［78］。脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)化可以通過質(zhì)膜融合或原生質(zhì)體內(nèi)吞作用將外源DNA引入原生質(zhì)體［79］，目前還沒有脂質(zhì)體介導的遺傳轉(zhuǎn)化成功的例子［78］。1992年，研究者首次利用碳化硅纖維將含有目的基因的質(zhì)粒傳遞至煙草細胞中［80］。2008年，研究者利用碳化硅纖維介導轉(zhuǎn)化法獲得抗鹽棉花［81］。但是，碳化硅晶體介導的處理由于會損傷細胞，從降低細胞的再生能力，導致轉(zhuǎn)化效率低下。碳化硅纖維有致癌風險，操作過程中需謹慎進行［82］。為了解決細胞損傷、轉(zhuǎn)化效率低及DNA整合混亂等問題，納米顆粒介導的基因傳遞法誕生，該方法可以在不使用外部作用力的情況下，將生物分子傳遞到完整的植物細胞中［83］，包括納米磁性顆粒、肽納米顆粒、層狀雙氫氧化物納米片、DNA納米結(jié)構(gòu)和碳納米管。例如，目前人們已經(jīng)利用磁性納米顆粒介導的基因傳遞法將Bt基因轉(zhuǎn)入棉花花粉中，從而成功獲得抗蟲植株［84］。

4.2 轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)化方案

植物遺傳轉(zhuǎn)化可以通過賦予作物理想的遺傳特性來提高作物產(chǎn)量和對非生物或生物脅迫的耐受性［85］。然而，目前高效率的遺傳轉(zhuǎn)化仍然是許多作物遺傳轉(zhuǎn)化工作面臨的挑戰(zhàn)［78］，建立簡單高效的再生體系、轉(zhuǎn)化體系對于通過分子技術(shù)手段實現(xiàn)植物品質(zhì)的改良至關(guān)重要。采用適宜的遺傳轉(zhuǎn)化方法、基因傳遞載體和選擇標記基因及應(yīng)用植物生長因子等是提高植物遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要途徑。

植物遺傳轉(zhuǎn)化常用的轉(zhuǎn)基因方法有農(nóng)桿菌介導法［86］、基因槍法［87］等。根癌農(nóng)桿菌介導法是一種通用的植物轉(zhuǎn)化方法，此方法簡單易行、轉(zhuǎn)化率髙，且不需要特殊的儀器設(shè)備，已成為應(yīng)用最為廣泛的植物轉(zhuǎn)化方法。目前，影響農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化率的因素除了前文所描述的再生系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)外，還包括基因傳遞載體的選擇和載體元件（如啟動子、報告基因）的優(yōu)化。在通常情況下，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時使用雙元表達載體（pGA482GG［88］、pCAMBIA2301s［89］和pBI121［90］等）。在試驗過程中，最好針對不同的轉(zhuǎn)化受體篩選合適的載體，以提高轉(zhuǎn)化效率。在黨參中，使用pCAMBIA1301載體的轉(zhuǎn)化效率可達91.07%［91］，而采用載體pDONR-207或過表達載體pEarleyGate202的轉(zhuǎn)化效率遠低于90.00%［92］。啟動子作為最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對調(diào)控靶基因的表達模式起著至關(guān)重要的作用。在大麥中，應(yīng)用Glub1啟動子的相對表達量是應(yīng)用Ubi-i啟動子的3～25倍［93］。雙元載體骨架上的驅(qū)動篩選標記的啟動子對轉(zhuǎn)化效率有較大影響。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，雙孢蘑菇GPD啟動子、構(gòu)巢曲霉trpC啟動子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率分別為15%、1%［94］。另外，報告基因能夠確保從非修飾細胞中快速準確地選擇修飾細胞，從而節(jié)約篩選時間和提高轉(zhuǎn)化效率［95-96］。β-葡糖醛酸酶（GUS）是被廣泛使用的報告基因系統(tǒng)之一，目前已有上千種轉(zhuǎn)基因植物利用GUS作為報告基因，如小麥［97］、白楊［98］、大麥［99］和茶［100］。目前常用的報告基因有綠色熒光蛋白基因（GFP［101-102］、SGFP［103］、EGFP［104］）和紅色熒光蛋白基因（DsRed［105］）。通過使用GFP或者DsRed標記對轉(zhuǎn)基因植株進行篩選，已成功獲得了農(nóng)桿菌介導的小麥、水稻、黃瓜和玉米轉(zhuǎn)基因陽性植株［101-104］。花青素可以作為一種無創(chuàng)報告基因，其中RUBY系統(tǒng)作為報告基因具有廣闊的應(yīng)用前景。在水稻中，利用RUBY產(chǎn)生的顏色可區(qū)分轉(zhuǎn)基因（紅色）和非轉(zhuǎn)基因組織（淡黃色）［106］。除雙元表達載體外，近些年來，以細胞穿透肽（CPP）為媒介的肽基基因傳遞系統(tǒng)被認為是一種高效、穩(wěn)定的非病毒的轉(zhuǎn)基因工具［107］。CPP通過二硫鍵連接DNA負載物，并經(jīng)內(nèi)吞進入受體細胞。受體細胞內(nèi)谷胱甘肽促使二硫鍵斷裂釋放DNA負載物，在植物中實現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移［108］。基因槍法也是遺傳轉(zhuǎn)化的常用方法之一。Klein等首次使用包裹煙草花葉病毒 RNA的金屬鎢顆粒轟擊洋蔥細胞并得到遺傳表達，證明該法可行［109］。影響基因槍轉(zhuǎn)化效率的因素主要包括轉(zhuǎn)化參數(shù)的選擇、受體類型和基因型等。其中，基因槍參數(shù)的選擇最為關(guān)鍵，在實際操作中，需要根據(jù)不同物種和受體及基因槍型號來選擇最佳參數(shù)，再配合相應(yīng)的培養(yǎng)和篩選條件，達到最高的轉(zhuǎn)化效率［110］。在對煙草進行轟擊時，壓強參數(shù)已經(jīng)從1 550 Pa優(yōu)化至1 350 Pa，效果最佳的為1 μm的金粒子，效率可以達到鎢粒子的2.5 ～ 54倍［110］。當農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法不能在單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化中使用時，基因槍法解決了這一難題［111］。1988年，Rhodes等通過基因槍法首次得到轉(zhuǎn)基因玉米［112］，3年后（1991年）Gould等才通過農(nóng)桿菌介導法得到玉米轉(zhuǎn)基因植株［113］。另外，簡化載體主干及通過構(gòu)建只包括基因啟動子、編碼區(qū)及終止子的表達盒這種簡單的整合方式來提高基因槍轟擊法的轉(zhuǎn)化效率已被證實有效［114］。目前，研究者已經(jīng)利用最小基因盒對葡萄胚性細胞懸液進行粒子轟擊，并得到裂葉葡萄植株［114］。此外，已經(jīng)有研究者利用基因槍法在煙草［115］、玉米［116］、棉花［117］等植物上建立了成熟的基因槍轉(zhuǎn)化體系，并得到了抗病［118］、抗逆［119］和品質(zhì)優(yōu)良［120］的植株。

轉(zhuǎn)化植物再生困難還受植物基因型的限制［120］。發(fā)育調(diào)節(jié)因子的過表達可能是打破基因型限制、促進植物再生的一種有效策略。調(diào)控植物生長發(fā)育相關(guān)基因BABY BOOM（BBM）、WUS、Growth-regulating factor （GRF）的異位表達是解決轉(zhuǎn)化后再生率低問題的有效途徑［14-15，121］。WUS基因最初被認為是在擬南芥莖尖分生組織中維持多能干細胞池的必要條件［122］，現(xiàn)已證明其在體細胞胚胎發(fā)生中有促進作用。轉(zhuǎn)化含有WUS基因的過表達載體后，其再生效率優(yōu)于對照材料［123］。在白樺中過表達WUS基因后，轉(zhuǎn)基因系植物分化的不定芽明顯多于對照組，再生效率也比對照組高［124］。WUS、BBM是體細胞胚形成的正向作用因子，它們的表達可促進體細胞向胚性細胞轉(zhuǎn)變［125］。在玉米遺傳轉(zhuǎn)化過程中，同時過表達WUS、 BBM后，轉(zhuǎn)化效率可以獲得顯著提高，有研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌介導的BBM和WUS的超表達轉(zhuǎn)基因體系也適用于高粱、秈稻的遺傳轉(zhuǎn)化［126］。在玉米幼胚轉(zhuǎn)化時，過表達WUS、BBM，可將轉(zhuǎn)化效率提升至15%［127］。但是，WUS是影響植物細胞分化的重要基因之一，過表達WUS后容易造成植物器官發(fā)育異常。在小麥細胞中過表達WUS類似基因后，會造成莖縱向伸長不足，從而影響包穗，使產(chǎn)量下降［128］。隨著農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法研究的不斷深入，轉(zhuǎn)化體系逐漸得到完善，轉(zhuǎn)化效率的提升成為進一步發(fā)展的重點。一些植物品種本身的遺傳轉(zhuǎn)化效率低，若用其表達一些特定基因，則有可能提高轉(zhuǎn)化效率。有研究發(fā)現(xiàn)，表達BBM、WUS2可促進高粱、甘蔗未熟胚胎的轉(zhuǎn)化，從而提高轉(zhuǎn)化效率［127］。發(fā)育調(diào)節(jié)因子雖然是一種促進再生的有效因素，但在其表達時也會出現(xiàn)負反饋。為了解決這種負反饋，應(yīng)用生長調(diào)節(jié)因子（GRF）、轉(zhuǎn)錄輔助因子（GIF）相互作用并形成功能性轉(zhuǎn)錄復合體。在該復合體中，GIF負責將基因重新整合，GRF則使基因表達或者抑制。GRF-GIF調(diào)節(jié)干細胞及其快速分裂，進而促進了植物再生［129］。目前，許多植物通過GRF-GIF復合體獲得再生植株，包括大豆［130］、玉米［131］和柑橘［132］。相關(guān)GRF-GIF復合體應(yīng)用至遺傳轉(zhuǎn)化研究中，具有良好的表現(xiàn)，推測其在植物莖尖研究中具有應(yīng)用潛力。

5 植物基因編輯技術(shù)研究進展

基因編輯是一項對生物體基因進行靶向修飾的新技術(shù)，包含巨型核酸酶（MegNs）、鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）和規(guī)律性重復短回文序列簇（CRISPR/Cas）［133］。20世紀80年代后期發(fā)現(xiàn)的巨型核酸酶是一種脫氧核糖核酸內(nèi)切酶，可以識別12～40 bp的DNA序列，但是受到酶體巨大、特定長序列限制，其應(yīng)用較難［134］?；赯FNs的基因編輯技術(shù)則主要受限于ZFNs對細胞有毒性和脫靶效應(yīng)［135］。2009年，為了解決ZFN技術(shù)的局限性，TALEN技術(shù)誕生［136］。CRISPR/Cas系統(tǒng)是繼ZFN、TALEN技術(shù)后最新發(fā)現(xiàn)的基因編輯技術(shù)，更簡單有效。其中，CRISPR/Cas9技術(shù)的建立和完善，為育種工作提供了有力的工具，極大地推動了作物品質(zhì)改良的研究［137］。BnaEOD3基因在不同作物的種子大小控制中起著關(guān)鍵作用，油菜中能夠有效產(chǎn)生BnaEOD3基因的靶向突變，并穩(wěn)定傳遞到T1、T2代中，從而提高油菜籽重量，為油菜籽育種提供了寶貴資源［138］。Jeong等通過CRISPR/Cas9技術(shù)獲得不依賴春化的早開花表型大白菜，實現(xiàn)了對植物的生長發(fā)育調(diào)節(jié)［139］。在對植物進行基因編輯、促進植物適應(yīng)復雜生態(tài)環(huán)境的同時，可以進一步提高植物的遺傳效率，實現(xiàn)精準調(diào)控。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻進行定點編輯，能夠迅速獲得溫敏雄性核不育的高產(chǎn)水稻［140］。發(fā)育調(diào)節(jié)因子和基因編輯技術(shù)結(jié)合，能夠使無性植物外植體誘導出分生組織，再得到基因編輯植株，并且將這些突變傳遞給下一代，從而消除了無菌培養(yǎng)的必要，提高了基因編輯效率［141］?；蚓庉嫼蟮姆阎?，成功嵌入了CLV、WUS基因，提高了番茄的轉(zhuǎn)基因效率和產(chǎn)量［142］。GRF-GIF復合體可作為一種植物再生助推器，從而提高植物的陽性再生率，還能進一步應(yīng)用至基因編輯中得到新品種［143］，因此，該復合體為進一步提高基因編輯效率提供了良好的轉(zhuǎn)化工具。雖然CRISPR/Cas9技術(shù)為基因組定向修飾帶來了新突破，但是該技術(shù)研究時間尚短，如小概率的脫靶現(xiàn)象仍存在，因此該技術(shù)仍需繼續(xù)探索。目前，全球生物公司正在競相開發(fā)具有理想性狀的基因編輯作物，并將其推向國際市場，例如日本具有降血壓功效的番茄已經(jīng)上市［144］，但是未來這項技術(shù)的發(fā)展仍取決于各國如何監(jiān)管基因編輯作物。2023年4月28日，中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了中國首個基因編輯生物安全證書，標志著編輯產(chǎn)品已經(jīng)可以用于育種及生產(chǎn)環(huán)節(jié)?；蚓庉嫾夹g(shù)在保障糧食生產(chǎn)、可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展、應(yīng)對氣候變化等方面的作用更加凸顯。但據(jù)我們所知，莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)未應(yīng)用到基因編輯研究中，若將該技術(shù)與莖尖結(jié)合，再加大發(fā)育調(diào)節(jié)因子的研究與應(yīng)用，推測可提高轉(zhuǎn)化再生效率。此外，對靶基因進行改進有望突破基因編輯瓶頸。

6 研究展望

多年來，植物莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的開發(fā)及優(yōu)化，為植物基因功能解析、優(yōu)良品種培育作出了重要貢獻。隨著主要農(nóng)作物重要功能基因的挖掘及轉(zhuǎn)基因新品種培育的展開，發(fā)展并優(yōu)化莖尖遺傳轉(zhuǎn)化的安全高轉(zhuǎn)基因技術(shù)始終是中國轉(zhuǎn)基因植物研發(fā)的重點方向之一。

近年來，研究者雖然在莖尖再生和遺傳轉(zhuǎn)化方法上獲得了一定成果，但轉(zhuǎn)化再生體系仍不完善，轉(zhuǎn)化效率依舊處于較低階段。隨著再生體系的不斷優(yōu)化和轉(zhuǎn)化效率的不斷提高，轉(zhuǎn)基因研究遭遇的瓶頸問題在今后的研究中將逐步被攻克。在提高再生效率方面，需就外植體類型、培養(yǎng)基類型和植物生長調(diào)節(jié)劑等因素進行綜合優(yōu)化；在促進外源基因?qū)敕矫妫枰夭煌秩痉椒?、篩選合適的農(nóng)桿菌菌株以及侵染條件，以利于轉(zhuǎn)化效率的提高。選擇適合的雙元載體、CPP工具或納米顆粒，對基因轉(zhuǎn)移效率提升也有幫助。外源基因表達量不足往往是得不到理想轉(zhuǎn)基因植物的重要原因，在載體構(gòu)建過程中，通常需要根據(jù)試驗的特定需求對載體進行適當改造，如更換適合的啟動子、插入增強子、合理使用生長調(diào)節(jié)因子或者插入特定的功能基因，可提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。近年來，隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展及其在園藝作物領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，作物新種質(zhì)相繼問世，如白色豌豆［145］、晚抽薹白菜［146］及高產(chǎn)、直鏈淀粉的小麥［147］等。借助莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進行基因編輯，可以高效、精準地創(chuàng)制優(yōu)良轉(zhuǎn)基因種質(zhì)，從而培養(yǎng)出更多優(yōu)異的轉(zhuǎn)基因新品種。

參考文獻：

［1］胡有良. 鹽生草HgNHX1對大麥的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因大麥抗逆性分析［D］. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2017.

［2］劉明月，左開井. 農(nóng)桿菌介導棉花莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化［J］. 上海交通大學學報（農(nóng)業(yè)科學版），2011，29（2）：25-31.

［3］肖 榮. 棉花莖尖轉(zhuǎn)化法優(yōu)化的探索［D］. 烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學，2022.

［4］張明洲，崔海瑞，舒慶堯，等. 高粱莖尖再生體系及其遺傳轉(zhuǎn)化影響因子的研究［J］. 核農(nóng)學報，2006，20（1）：23-26，5.

［5］柳忠玉，趙樹進. 根癌農(nóng)桿菌介導的虎杖莖尖轉(zhuǎn)化研究［J］. 生物技術(shù)通報，2014（2）：79-84.

［6］黎冬華，廖玉才，李和平. 根癌農(nóng)桿菌介導的大麥莖尖轉(zhuǎn)化研究［J］. 麥類作物學報，2012，32（1）：44-47.

［7］Ramakrishnan M，Ceasar S A，Duraipandiyan V，et al. Efficacious somatic embryogenesis and fertile plant recovery from shoot apex explants of onion （Allium cepa L.）［J］. In Vitro Cellular amp; Developmental Biology-Plant，2013，49（3）：285-293.

［8］許智宏，張憲省，蘇英華，等. 植物細胞全能性和再生［J］. 中國科學（生命科學），2019，49（10）：1282-1300.

［9］史 勇，董永彬，王 晨，等. 玉米頂端分生組織發(fā)育的研究進展［J］. 分子植物育種，2023，21（3）：896-905.

［10］Wang B，Smith S M，Li J Y. Genetic regulation of shoot architecture［J］. Annual Review of Plant Biology，2018，69：437-468.

［11］張煥凱. 生長素響應(yīng)因子ARF3通過組蛋白乙?；揎椪{(diào)控擬南芥頂端分生組織干細胞的維持［D］. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2020.

［12］胡慶毅，陳本佳，楊立凡，等. 植物激素調(diào)控頂端分生組織發(fā)育的研究進展［J］. 湖南農(nóng)業(yè)科學，2022（1）：105-110.

［13］Barton M K. Twenty years on：the inner workings of the shoot apical meristem，a developmental dynamo［J］. Developmental Biology，2010，341（1）：95-113.

［14］Boutilier K，Offringa R，Sharma V K，et al. Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth［J］. The Plant Cell，2002，14（8）：1737-1749.

［15］Shivani，Awasthi P，Sharma V，et al. Genome-wide analysis of transcription factors during somatic embryogenesis in banana （Musa spp.） cv.Grand Naine［J］. PLoS One，2017，12（8）：e0182242.

［16］周 超. 擬南芥STM、WUS和CLV3相互作用調(diào)控莖端分生組織干細胞活性的研究［D］. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2015.

［17］Kwon C T，Tang L L，Wang X G，et al. Dynamic evolution of small signalling peptide compensation in plant stem cell control［J］. Nature Plants，2022，8：346-355.

［18］Ikenganyia E E，Anikwe M A N，Omeje" T E，et al. Plant tissue culture regeneration and aseptic techniques［J］. Asian Journal of Biotechnology and Bioresource Technology，2017，1（3）：1-6.

［19］王忠穎，百 靈，呂廣超，等. 禾本科植物組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進展［J］. 內(nèi)蒙古民族大學學報（自然科學版），2023，38（1）：62-69.

［20］雷 艷，吳光輝，左小義，等. 浙紫薯1號及其突變體新栗再生體系的初步建立［J］. 園藝與種苗，2022，42（12）：1-3，6.

［21］Lee M H，Lee J，Jie E Y，et al. Temporal and spatial expression analysis of shoot-regeneration regulatory genes during the adventitious shoot formation in hypocotyl and Cotyledon explants of tomato （cv. Micro-Tom）［J］. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（15）：5309.

［22］Long Y，Yang Y，Ge F，et al. Establishment of a maize callus regeneration system from haploid shoot tips［J］. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2020，141（3）：583-592.

［23］胡有良，汪軍成，司二靜，等. 大麥莖尖愈傷組織的誘導和植株高頻再生［J］. 麥類作物學報，2017，37（5）：601-608.

［24］王寒玉. 谷子愈傷誘導優(yōu)化及轉(zhuǎn)化影響因素分析［D］. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學，2012.

［25］Sai N K，Visarada K，Lakshmi Y A，et al. In vitro culture methods in sorghum with shoot tip as the explant material［J］. Plant Cell Reports，2006，25（3）：174-182.

［26］陳 思，黃 洲，楊夢婷，等. 桂花組織培養(yǎng)及基因工程研究進展［J］. 杭州師范大學學報（自然科學版），2018，17（6）：617-623，636.

［27］楚宗麗，李亮杰，詹 妞，等." ‘寧玉’草莓單莖尖培養(yǎng)技術(shù)研究［J］. 中國南方果樹，2022，51（4）：146-150.

［28］劉 嫻，徐 旭，李良俊. 幾種水生蔬菜組織培養(yǎng)研究進展［J］. 長江蔬菜，2017（18）：55-61.

［29］喻 娜，羅開秀，向 丹，等. 銀杏莖尖無菌接種條件的優(yōu)化［J］. 分子植物育種，2018，16（11）：3661-3665.

［30］Pérez-Jiménez M，López-Soto M B，Cos-Terrer J. In vitro callus induction from adult tissues of peach （Prunus persica L. Batsch）［J］. In Vitro Cellular amp; Developmental Biology-Plant，2013，49（1）：79-84.

［31］Liu X L，Zhao Y C，Chen X Y，et al. Establishment of callus induction system，histological evaluation and taxifolin production of larch［J］. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2021，147（3）：467-475.

［32］Maheswari M，Jyothi Lakshmi N，Yadav S K，et al. Efficient plant regeneration from shoot apices of sorghum［J］. Biologia Plantarum，2006，50（4）：741-744.

［33］Zang Q L，Zhou L，Zhuge F，et al. Callus induction and regeneration via shoot tips of Dendrocalamus hamiltonii［J］. SpringerPlus，2016，5（1）：1799.

［34］王 玉，楊占南，羅世瓊，等." 黃花蒿組織培養(yǎng)再生體系的建立［J］. 分子植物育種，2023，494（7）：1-17.

［35］吳偉文，黃 晶，潘 軍，等. 蘆蒿莖尖組織培養(yǎng)體系建立的研究［J］. 現(xiàn)代園藝，2022，45（19）：51-53，55.

［36］徐雨生，袁定陽，陳思揚，等." 白芨莖尖再生組織培養(yǎng)體系的建立［J］. 分子植物育種，2022，474（9）：1-9.

［37］Xi Y K，Huang H Y.Basal stem cluster bud induction and efficient regeneration for the Tibetan endemic medicinal plant Swertia conaensis［J］. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca，2021，49（2）：12152.

［38］Tyub S，Ahmad Dar S，Maqbool Lone I，et al. A robust in vitro protocol for shoot multiplication of Echinacea angustifolia［J］. Current Plant Biology，2021，28：100221.

［39］Zou L J，Hu J Y，Luo M H，et al. In vitro propagation of the Chinese traditional and medicinal plant Heracleum scabridum Franch［J］. Bangladesh Journal of Botany，2019，48（3）：575-581.

［40］李艷霞. 樹莓品種‘波魯?shù)隆o尖離體培養(yǎng)體系的建立［J］. 中國果樹，2018（5）：36-38，42.

［41］托 亞，白玉娥. 香茶藨子莖尖愈傷組織誘導及植株再生［J］. 分子植物育種，2018，16（7）：2255-2259.

［42］王 玲，唐 彪，曹 柏，等. 玉蟬花愈傷組織的誘導及植株再生研究［J］. 種子，2018，37（6）：35-39.

［43］張 微，王良群，劉 勇，等. 玉米不同部位愈傷組織誘導及植株再生的比較研究［J］. 核農(nóng)學報，2017，31（11）：2135-2144.

［44］丁久玲，鄭 凱. 矮生沿階草莖尖離體培養(yǎng)及其植株再生［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（20）：173-175.

［45］吳高殷，田有亮，何炎紅，等. 山杏莖尖和莖段組織培養(yǎng)體系的建立［J］. 經(jīng)濟林研究，2017，35（2）：151-156.

［46］趙 彥，陳雪英，云錦鳳，等. 蒙古冰草莖尖愈傷組織及其再生植株誘導［J］. 北方農(nóng)業(yè)學報，2016，44（2）：18-22.

［47］陶 煉，潘翠萍，謝紅江，等. 三倍體枇杷莖尖培養(yǎng)與植株再生［J］. 熱帶作物學報，2014，35（11）：2249-2254.

［48］Ahmed A B A，Pallela R，Rao A S，et al. Optimized conditions for callus induction，plant regeneration and alkaloids accumulation in stem and shoot tip explants of Phyla nodiflora［J］. Spanish Journal of Agricultural Research，2011，9（4）：1262-1270.

［49］高俊山，許 磊，陳 文，等. 農(nóng)桿菌介導陸地棉棕彩選1號莖尖遺傳轉(zhuǎn)化［J］. 核農(nóng)學報，2017，31（10）：1881-1888.

［50］金仁龍，朱 姝，張邊江. 不同培養(yǎng)條件對蘇棉12號莖尖組織培養(yǎng)的影響［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2011，38（3）：38-39.

［51］Saha P，Datta K，Majumder S，et al. Agrobacterium mediated genetic transformation of commercial jute cultivar Corchorus capsularis cv.JRC 321 using shoot tip explants［J］. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2014，118（2）：313-326.

［52］Guan X，Zhao H Q，Xu Y，et al. Studies on gene transfer of shoot apical meristems by Agrobacterium-mediated genetic transformation in a progeny of chinese wild Vitis pseudoreticulata［J］. Vitis，2013，52（4）：185-192.

［53］尹 秀，游義霞，張 維，等. 玻璃粉創(chuàng)傷棉花莖尖分生組織遺傳轉(zhuǎn)化的研究［J］. 石河子大學學報（自然科學版），2013，31（6）：736-741.

［54］Sarkar S，Roy S，Ghosh S K，et al. Application of lateral branching to overcome the recalcitrance of in vitro regeneration of Agrobacterium-infected pigeonpea （Cajanus cajan L.）［J］. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2019，137（1）：23-32.

［55］葉興國，王新敏，王 軻，等. 提高植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率輔助策略研究進展［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學，2012，45（15）：3007-3019.

［56］雷玉婷.小麥莖尖再生體系的優(yōu)化與CL5227基因的遺傳轉(zhuǎn)化［D］. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2017.

［57］Gurusaravanan P，Vinoth S，Jayabalan N. An improved Agrobacterium-mediated transformation method for cotton （Gossypium hirsutum L.‘KC3’） assisted by microinjection and sonication［J］. In Vitro Cellular amp; Developmental Biology-Plant，2020，56（1）：111-121.

［58］Matheka J，Tripathi J N，Merga I，et al. A simple and rapid protocol for the genetic transformation of Ensete ventricosum［J］. Plant Methods，2019，15：130.

［59］劉文欣. 農(nóng)桿菌介導單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化研究進展［J］. 種業(yè)導報，2022（6）：11-16.

［60］萬麗麗，王轉(zhuǎn)茸，湯 謐，等. 甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)化及DRs類基因的應(yīng)用［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2023，51（7）：49-58.

［61］賀美林.谷子成熟胚再生體系建立及EPSPS基因遺傳轉(zhuǎn)化研究［D］. 太谷：山西農(nóng)業(yè)大學，2018.

［62］張 園，劉正杰，林 春，等. 蘆筍莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與優(yōu)化［J］. 西北農(nóng)業(yè)學報，2020，29（1）：109-116.

［63］Satish L，Ceasar S A，Ramesh M. Improved Agrobacterium-mediated transformation and direct plant regeneration in four cultivars of finger millet ［Eleusine coracana （L.） Gaertn.］［J］. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2017，131（3）：547-565.

［64］孫 威，王欽美，王玉章，等. 玉米轉(zhuǎn)錄因子Pl表達載體的構(gòu)建及大花君子蘭遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立［J］. 分子植物育種，2017，15（7）：2636-2641.

［65］Mekala G K，Juturu V N，Mallikarjuna G，et al. Optimization of Agrobacterium-mediated genetic transformation of shoot tip explants of green gram ［Vigna radiata （L.） Wilczek］［J］. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2016，127（3）：651-663.

［66］張 佳.農(nóng)桿菌介導的秈稻9311和華占遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究［D］. 宜昌：三峽大學，2022.

［67］郭新梅，車昕明，裴玉賀，等. 乙酰丁香酮對不同糯玉米受體系統(tǒng)遺傳轉(zhuǎn)化的影響［J］. 西南農(nóng)業(yè)學報，2013，26（3）：899-902.

［68］Boutigny A L，Dohin N，Pornin D，et al. Overview and detectability of the genetic modifications in ornamental plants［J］. Horticulture Research，2020，7：11.

［69］Kumar S，Tiwari R，Chandra A，et al. In vitro direct plant regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of lucerne （Medicago sativa L.）［J］. Grass and Forage Science，2013，68（3）：459-468.

［70］趙小強，牛曉偉，范 敏. 農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化西瓜的影響因素及應(yīng)用研究進展［J］. 浙江農(nóng)業(yè)學報，2016，28（1）：171-178.

［71］王敬東，馬洪文，樊云芳，等. 鹽稻8號遺傳轉(zhuǎn)化體系中不同抗生素種類與濃度的抑菌效果研究［J］. 作物雜志，2016（5）：61-66.

［72］張璽麗，殷學仁，李 方，等. MrMYB1-MrbHLH1：一個有潛力的園藝植物轉(zhuǎn)基因可視化報告基因［J］. 園藝學報，2017，44（12）：2296-2304.

［73］張慧穎，王 穎，韓成貴. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在中國主要糧食作物改良中的研究進展［J］. 農(nóng)學學報，2022，12（10）：44-50.

［74］Sanford J C，Klein T M，Wolf E D，et al. Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process［J］. Particulate Science and Technology，1987，5（1）：27-37.

［75］Dong O X，Ronald P C. Targeted DNA insertion in plants［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2021，118（22）：e2004834117.

［76］Li L C，Qu R D，de Kochko A，et al. An improved rice transformation system using the biolistic method［J］. Plant Cell Reports，1993，12（5）：250-255.

［77］Kar S，Loganathan M，Dey K，et al. Single-cell electroporation：current trends，applications and future prospects［J］. Journal of Micromechanics and Microengineering，2018，28（12）：123002.

［79］Gad A E，Rosenberg N，Altman A. Liposome-mediated gene delivery into plant cells［J］. Physiologia Plantarum，1990，79（1）：177-183.

［80］Kaeppler H F，Somers D A，Rines H W，et al. Silicon carbide fiber-mediated stable transformation of plant cells［J］. Theoretical and Applied Genetics，1992，84（5）：560-566.

［81］Asad S，Mukhtar Z，Nazir F，et al. Silicon carbide whisker-mediated embryogenic callus transformation of cotton （Gossypium hirsutum L.） and regeneration of salt tolerant plants［J］. Molecular Biotechnology，2008，40（2）：161-169.

［82］Anwar S，Shiwali S，Saeed A S. Biotechnological strategies for the conservation of medicinal and ornamental climbers［M］. Cham：Springer International Publishing，2016.

［83］Lv Z Y，Jiang R，Chen J F，et al. Nanoparticle-mediated gene transformation strategies for plant genetic engineering［J］. The Plant Journal，2020，104（4）：880-891.

［84］Zhao X，Meng Z G，Wang Y，et al. Pollen magnetofection for genetic modification with magnetic nanoparticles as gene carriers［J］. Nature Plants，2017，3：956-964.

［85］Cunningham F J，Goh N S，Demirer G S，et al. Nanoparticle-mediated delivery towards advancing plant genetic engineering［J］. Trends in Biotechnology，2018，36（9）：882-897.

［86］Ramkumar T R，Lenka S K，Arya S S，et al. A short history and perspectives on plant genetic transformation［J］. Methods in Molecular Biology，2020，2124：39-68.

［87］朱 莉，郎志宏，李桂英，等. 高粱遺傳轉(zhuǎn)化研究進展［J］. 生物技術(shù)通報，2011（1）：1-7，13.

［88］Kose E，Ko N K. Agrobacterium-mediated" transformation of cucumber （Cucumis sativus L.） and plant regeneration［J］. Biotechnology amp; Biotechnological Equipment，2003，17（2）：56-62.

［89］陳露倩，賴夢霞，柴里昂，等. 黃瓜PIP2；4基因生物信息學及干旱脅迫下的誘導表達分析［J］. 四川農(nóng)業(yè)大學學報，2020，38（5）：538-544.

［90］Faisal S M，Haque M S，Nasiruddin K M. Agrobacterium-mediated genetic transformation in cucumber （var.shital） as influenced by explant，inoculation time and co-cultivation period［J］. Universal Journal of Plant Science，2015，3（2）：25-31.

［91］Liu Z Y，Ji J J，Jiang F，et al. Establishment of a genetic transformation system for Codonopsis pilosula callus［J］. Plant Biotechnology，2022，39（3）：251-257.

［92］劉喆宇.黨參CpMYB14轉(zhuǎn)錄因子與Cp1-SST基因互作負調(diào)控黨參多糖積累的分子機制［D］. 太原：山西醫(yī)科大學，2022.

［93］Eskelin K，Ritala A，Suntio T，et al. Production of a recombinant full-length collagen type I alpha-1 and of a 45-ku collagen type Ⅰ alpha-1 fragment in barley seeds［J］. Plant Biotechnology Journal，2009，7（7）：657-672.

［94］查麗燕，周偉堅，王 越，等. 根癌農(nóng)桿菌介導的食用菌遺傳轉(zhuǎn)化研究進展［J］. 食用菌學報，2020，27（1）：105-118.

［95］Butiuc-Keul A，Coste A. Biotechnologies and strategies for grapevine improvement［J］. Horticulturae，2023，9（1）：62.

［96］He Y B，Zhang T，Sun H，et al. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation［J］. Horticulture Research，2020，7：152.

［97］Hayta S，Smedley M A，Clarke M，et al. An efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for hexaploid and tetraploid wheat［J］. Current Protocols，2021，1（3）：e58.

［98］Song C W，Lu L，Guo Y Y，et al. Efficient Agrobacterium-mediated transformation of the commercial hybrid poplar Populus alba×Populus glandulosa Uyeki［J］. International Journal of Molecular Sciences，2019，20（10）：2594.

［99］Harwood W A.A protocol for high-throughput Agrobacterium-mediated barley transformation［J］. Methods in Molecular Biology，2014，1099：251-260.

［100］Lv Q R，Chen C S，Xu Y J，et al. Optimization of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation systems in tea plant （Camellia sinensis）［J］. Horticultural Plant Journal，2017，3（3）：105-109.

［101］Hensel G，Marthe C，Kumlehn J. Agrobacterium-mediated transformation of wheat using immature embryos［J］. Methods in Molecular Biology，2017，1679：129-139.

［102］馮路路，王雪艷，夏 磊，等. 利用GFP基因的黃瓜T-DNA插入突變體構(gòu)建與快速鑒定［J］. 核農(nóng)學報，2021，35（7）：1540-1547.

［103］Shimizu-Sato S，Tsuda K，Nosaka-Takahashi M，et al. Agrobacterium-mediated genetic transformation of wild Oryza species using immature embryos［J］. Rice，2020，13（1）：33.

［104］McLean T，F(xiàn)ourie P H，McLeod A.Reporter gene transformation of the trunk disease pathogen Phaeomoniella chlamydospora and biological control agent Trichoderma harzianum［J］. Australasian Plant Pathology，2009，38（2）：153-167.

［105］Liu S N，Shi Y L，Liu F，et al. LaCl3 treatment improves Agrobacterium-mediated immature embryo genetic transformation frequency of maize［J］. Plant Cell Reports，2022，41（6）：1439-1448.

［106］Guo B Y，Itami J，Oikawa K，et al. Native protein delivery into rice callus using ionic complexes of protein and cell-penetrating peptides［J］. PLoS One，2019，14（7）：e0214033.

［107］Chuah J A，Numata K.Stimulus-responsive peptide for effective delivery and release of DNA in plants［J］. Biomacromolecules，2018，19（4）：1154-1163.

［108］Klein T M，Gradziel T，F(xiàn)romm M E，et al. Factors influencing gene delivery into Zea mays cells by high-velocity microprojectiles［J］. Bioresource Technology，1988，6：559-563.

［109］黃惻隱，李 林，聞偉鍔，等. 遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在藥用植物研究中的應(yīng)用［J］. 遵義醫(yī)科大學學報，2022，45（3）：407-412.

［110］Davlekamova A A，Zubritsky A V，Timofeeva T A，et al. Optimization of biolistic transformation parameters for Nicotiana tabacum［J］. Applied Biochemistry and Microbiology，2023，59（3）：368-372.

［111］王 軍，付愛根，徐 敏，等. 基因槍法在遺傳轉(zhuǎn)化中的研究進展［J］. 基因組學與應(yīng)用生物學，2018，37（1）：459-468.

［112］Rhodes C A，Pierce D A，Mettler I J，et al. Genetically transformed maize plants from protoplasts［J］. Science，1988，240（4849）：204-207.

［113］Gould J，Devey M，Hasegawa O，et al. Transformation of Zea mays L. using Agrobacterium tumefaciens and the shoot apex［J］. Plant Physiology，1991，95（2）：426-434.

［114］Vidal J R，Kikkert J R，Donzelli B D，et al. Biolistic transformation of grapevine using minimal gene cassette technology［J］. Plant Cell Reports，2006，25（8）：807-814.

［115］Mattozzi M D，Voges M J，Silver P A，et al. Transient gene expression in tobacco using Gibson assembly and the Gene Gun［J］. Journal of Visualized Experiments，2014（86）：51234.

［116］Brettschneider R，Becker D，Lrz H. Efficient transformation of scutellar tissue of immature maize embryos［J］. Theoretical and Applied Genetics，1997，94（6）：737-748.

［117］Chlan C A，Lin J M，Cary J W，et al. A procedure for biolistic transformation and regeneration of transgenic cotton from meristematic tissue［J］. Plant Molecular Biology Reporter，1995，13（1）：31-37.

［118］Shin S，MacKintosh C A，Lewis J，et al. Transgenic wheat expressing a barley class Ⅱ chitinase gene has enhanced resistance against Fusarium graminearum［J］. Journal of Experimental Botany，2008，59（9）：2371-2378.

［119］Thang X N. Barley HVA1 gene confers drought and salt tolerance in transgenic maize Zea mays L.［J］. Advances in Crop Science and Technology，2013，1（1）：1-8.

［120］耿立格，孫 娟，郄彥敏，等. 海陸棉遺傳重組技術(shù)和應(yīng)用研究進展［J］. 華北農(nóng)學報，2022，37（增刊1）：59-65.

［121］Su W B，Xu M Y，Radani Y，et al. Technological development and application of plant genetic transformation［J］. International Journal of Molecular Sciences，2023，24（13）：10646.

［122］Mayer K F，Schoof H，Haecker A，et al. Role of WUSCHEL in regulating stem cell fate in the Arabidopsis shoot meristem［J］. Cell，1998，95（6）：805-815.

［123］顏世萍. 蘋果MdWUS基因的克隆及功能分析［D］. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學，2020.

［124］楊琳琳. 白樺WUS基因的克隆及其功能分析［D］. 哈爾濱：東北林業(yè)大學，2022.

［125］王詩雨，蔣瑩瑩，徐 恒，等. 從水稻再生的研究進展看秈稻遺傳轉(zhuǎn)化的未來［J］. 植物生理學報，2021，57（11）：2069-2076.

［126］許潔婷，劉相國，金敏亮，等. 不依賴基因型的高效玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立［J］. 作物學報，2022，48（12）：2987-2993.

［127］Lowe K，Wu E，Wang N，et al. Morphogenic regulators baby boom and Wuschel improve monocot transformation［J］. The Plant Cell，2016，28（9）：1998-2015.

［128］司雪梅.小麥產(chǎn)量相關(guān)基因TaWUS-like的功能和調(diào)控機制解析［D］. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2022.

［129］Luo G B，Palmgren M. GRF-GIF chimeras boost plant regeneration［J］. Trends in Plant Science，2021，26（3）：201-204.

［130］Kong J X，Martin-Ortigosa S，F(xiàn)iner J，et al. Overexpression of the transcription factor GROWTH-REGULATING FACTOR5 improves transformation of dicot and monocot species［J］. Frontiers in Plant Science，2020，11：572319.

［131］Wu L，Zhang D F，Xue M，et al. Overexpression of the maize GRF10，an endogenous truncated growth-regulating factor protein，leads to reduction in leaf size and plant height［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2014，56（11）：1053-1063.

［132］Debernardi J M，Tricoli D M，Ercoli M F，et al. A GRF-GIF chimeric protein improves the regeneration efficiency of transgenic plants［J］. Nature Biotechnology，2020，38：1274-1279.

［133］高 珊.基因編輯技術(shù)在植物育種中的應(yīng)用［J］. 特種經(jīng)濟動植物，2022，25（9）：177-178，194.

［134］Silva G，Poirot L，Galetto R，et al. Meganucleases and other tools for targeted genome engineering：perspectives and challenges for gene therapy［J］. Current Gene Therapy，2011，11（1）：11-27.

［135］李 想，崔文濤，李 奎.基因編輯技術(shù)及其應(yīng)用的研究進展［J］. 中國畜牧獸醫(yī)，2017，44（8）：2241-2247.

［136］Boch J，Scholze H，Schornack S，et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type Ⅲ effectors［J］. Science，2009，326（5959）：1509-1512.

［137］Lino C A，Harper J C，Carney J P，et al. Delivering CRISPR：a review of the challenges and approaches［J］. Drug Delivery，2018，25（1）：1234-1257.

［138］Khan M H U，Hu L M，Zhu M S，et al. Targeted mutagenesis of EOD3 gene in Brassica napus L. regulates seed production［J］. Journal of Cellular Physiology，2021，236（3）：1996-2007.

［139］JeongSY，AhnH，RyuJ，etal. Generation of early-flowering

Chinese cabbage （Brassica rapa spp. pekinensis） through CRISPR/Cas9-mediated genome editing［J］. Plant Biotechnology Reports，2019，13（5）：491-499.

［140］覃玉芬，廖山岳，郭新穎，等. 利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制新型水稻溫敏雄性核不育系［J］. 分子植物育種，2023，21（5）：1551-1561.

［141］Maher M F，Nasti R A，Vollbrecht M，et al. Plant gene editing through de novo induction of meristems［J］. Nature Biotechnology，2020，38：84-89.

［142］Rehman F，Gong H G，Bao Y F，et al. CRISPR gene editing of major domestication traits accelerating breeding for Solanaceae crops improvement［J］. Plant Molecular Biology，2022，108（3）：157-173.

［143］Feng Q，Xiao L，He Y Z，et al. Highly efficient，genotype-independent transformation and gene editing in watermelon （Citrullus lanatus） using a chimeric ClGRF4-GIF1 gene［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2021，63（12）：2038-2042.

［144］Ezura H. Letter to the editor：the worlds first CRISPR tomato launched to a Japanese market：the social-economic impact of its implementation on crop genome editing［J］. Plant and Cell Physiology，2022，63（6）：731-733.

［145］Li G，Liu R，Xu R F，et al. Development of an Agrobacterium-mediated CRISPR/Cas9 system in pea （Pisum sativum L.）［J］. The Crop Journal，2023，11（1）：132-139.

［146］Shin Y H，Park Y D.CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of BrLEAFY delays the bolting time in Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）［J］. International Journal of Molecular Sciences，2022，24（1）：541.

［147］Li J Y，Jiao G A，Sun Y W，et al. Modification of starch composition，structure and properties through editing of TaSBEIIa in both winter and spring wheat varieties by CRISPR/Cas9［J］. Plant Biotechnology Journal，2021，19（5）：937-951.