KLF4通過促進自噬減輕高糖濃度下巨噬細胞膽固醇沉積

摘要：目的 觀察Krüppel樣因子4（KLF4）對高糖處理的巨噬細胞膽固醇沉積的影響，并探討其作用機制是否與巨噬細胞自噬相關。方法 10只Balb/c小鼠隨機分為正常對照（NC）組和糖尿病（DM）組，每組5只。建立DM小鼠模型，給予高脂飲食后檢測小鼠主動脈KLF4蛋白表達水平。人白血病單核細胞THP-1誘導為巨噬細胞后分為LV-NC組、LV-KLF4組、si-NC組、si-KLF4組。觀察過表達或敲低KLF4表達后，THP-1巨噬細胞膽固醇含量、細胞凋亡、自噬相關蛋白及蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（AKT/mTOR）信號通路相關蛋白的表達變化。結果 DM組小鼠主動脈KLF4蛋白表達水平低于NC組（P＜0.05）。KLF4過表達可顯著降低高糖條件下的THP-1巨噬細胞膽固醇積累，增加芐氯素1（Beclin1）表達，降低P62表達，提高微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）熒光強度，減少細胞凋亡（P＜0.05），抑制AKT/mTOR信號通路相關蛋白表達（P＜0.05）。敲低KLF4表達后，結果反之。結論 KLF4通過促進自噬減輕高糖濃度下巨噬細胞膽固醇沉積。

關鍵詞：自噬；巨噬細胞；Krüppel樣因子4；高糖；膽固醇沉積

中圖分類號：R587.1 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240283

Krüppel-like factor 4 alleviated cholesterol deposition in macrophages by promoting

autophagy at high glucose concentration

ZHANG Rui， CHEN Sisi， WANG Tongdan， YU Pei△

Department of Blood Purifying Center， Chu Hsien-I Memorial Hospital and Tianjin Institute of Endocrinology，

Tianjin Medical University， NHC Key Laboratory of Hormones and Development，

Tianjin Key Laboratory of Metabolic Diseases， Tianjin 300134， China

△Corresponding Author E-mail： peiyu@tmu.edu.cn

Abstract： Objective To observe the effect of Krüppel-like factor 4 （KLF4） on cholesterol deposition in macrophages treated with high glucose， and to explore the mechanism related to macrophage autophagy. Methods Ten Balb/c mice were randomly divided into the normal control （NC， n=5） group and the DM group （n=5）. A diabetic mouse model was established， and the expression level of KLF4 protein in aorta was detected after high fat diet. After induction of THP-1 monocytes into macrophages， they were divided into the LV-NC group， the LV-KLF4 group， the si-NC group and the si-KLF4 group. Changes of cholesterol content， cell apoptosis and the expression level of autophagy related proteins and AKT/mTOR signaling pathway related proteins in THP-1 macrophages were observed after overexpression or knockout of KLF4. Results The expression level of KLF4 protein in aorta of diabetic mice was lower in the DM group than that of the NC group （P＜0.05）. Meanwhile， under high glucose concentration， overexpression of KLF4 in THP-1 macrophages significantly decreased cholesterol deposition， cell apoptosis and P62 expression， increased Beclin1 expression， LC3 fluorescence intensity and also inhibited AKT/mTOR signaling pathway related protein expression （P＜0.05）. After knocking down KLF4 expression， the results were reversed. Conclusion KLF4 alleviates cholesterol deposition in THP-1 macrophages by promoting autophagy under high glucose concentration.

Key words： autophagy; macrophages; Krüppel-like factor 4; high glucose; cholesterol deposition

以動脈粥樣硬化（AS）為特征的糖尿?。―M）大血管并發(fā)癥，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中、外周動脈疾病等是DM患者致殘和死亡的主要原因［1］。AS早期，內皮損傷引發(fā)炎癥反應，單核細胞被招募到內皮下，在多種細胞因子的作用下分化為巨噬細胞［2］。巨噬細胞吞噬脂質，特別是氧化低密度脂蛋白（oxLDL）形成泡沫細胞，這是AS斑塊形成和發(fā)展的重要步驟［3］。隨著斑塊進展，巨噬細胞聚集增多，導致巨噬細胞凋亡、炎癥和斑塊壞死，最終導致心腦血管事件［4］。因此，針對巨噬細胞源性泡沫細胞早期干預AS形成已成為預防AS的主要方向。Krüppel樣因子（Krüppel-like factors，KLFs）家族是一類調控基因轉錄的結合蛋白［5］。研究發(fā)現(xiàn)，家族成員KLF4與內皮細胞、巨噬細胞等炎性細胞及促炎因子密切相關，可以調節(jié)多種細胞活動，包括細胞代謝、細胞周期、凋亡和自噬［6］，但其在DM性AS中的作用機制尚不完全清楚?；诖耍狙芯恐荚谔接慘LF4對高糖狀態(tài)下巨噬細胞膽固醇沉積的影響及作用機制，為臨床防治DM性AS提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系與實驗動物 人白血病單核細胞THP-1購自天津科斯莫生物科技有限公司。10只8周齡SPF級野生Balb/c雌性小鼠購自北京藥康生物科技有限公司，體質量（16±2）g，動物生產許可證號：SCXK（京）2023-0008。小鼠在溫度（22±2）℃、相對濕度60%±5%，光照/黑暗交替12 h循環(huán)的溫控動物設施中飼養(yǎng)，自由進食和飲水，實驗動物使用許可證號：SYXK（津）2020-0001。所有動物實驗由天津醫(yī)科大學朱憲彝紀念醫(yī)院動物倫理與福利中心批準（批準號：dxbyyiacuc-2022056）。

1.1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清購自美國Gibco公司，青霉素/鏈霉素溶液、佛波酯（PMA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自上海碧云天生物技術有限公司。靶向KLF4的siRNA以及KLF4過表達pcDNA3.1慢病毒載體（Lenvirus，LV）均由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。細胞計數(shù)Kit-8（CCK-8）檢測試劑盒、油紅O、Triton X-100、鏈脲佐菌素（STZ）均購自北京索萊寶生物科技有限公司。膽固醇含量測定試劑盒、TUNEL凋亡試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。兔源微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）抗體、KLF4抗體、兔源蛋白激酶B（AKT）抗體、磷酸化AKT（p-AKT）抗體（磷酸化位點Ser473）均購自美國BIMAKE生物科技有限公司。兔源雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗體、磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體（磷酸化位點Ser2448）、芐氯素1（Beclin1）抗體均購自江蘇Affinity生物科技有限公司。兔源螯合體1（SQSTM1/P62）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Cell Signaling公司。兔源抗β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體購自英國Abcam公司。RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司。SYBR Premix試劑盒購自日本Takara公司。熒光顯微鏡、ABI 7500 PCR系統(tǒng)為日本Olympus公司產品；增強化學發(fā)光系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產品；酶標儀為瑞士Tecan公司產品。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 Balb/c小鼠采用隨機數(shù)字表法分為正常對照（NC）組和DM組，每組5只。DM組以課題組前期研究應用的高脂高糖飲食飼養(yǎng)［7］，8周后腹腔注射2% STZ 80 mg/kg，每日1次，連續(xù)3 d，3 d后測空腹血糖≥16.7 mmol/L則為造模成功。NC組注射枸櫞酸鈉緩沖液。造模4周時取尾靜脈血，檢測小鼠血糖、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）水平。并采用頸椎脫位法處死小鼠。從髂分叉處切開主動脈弓，去除外部脂肪沉積，收集主動脈用于體外實驗。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 在含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)基中以5×105個細胞/mL的密度培養(yǎng)THP-1細胞。所有實驗中，THP-1細胞經1×10-4 mmol/L PMA處理24 h后轉化為巨噬細胞。

1.2.3 細胞轉染 按照說明書分別將KLF4 siRNA、陰性對照siRNA（si-NC）以及過表達KLF4的LV、空載體（LV-NC）通過Lipofectamine 2000轉染到細胞中，終濃度為5×10-5 mmol/L，見表1。根據(jù)轉染情況，細胞分為LV-NC組、LV-KLF4組、si-NC組、si-KLF4組。

1.2.4 CCK-8測定細胞活力 將THP-1巨噬細胞暴露于不同濃度的葡萄糖（5.6、12.7、25.5、33 mmol/L）和不同時間（0、12、24、36 h）條件下，然后在96孔板的每孔中加入10 μL CCK-8溶液，置于黑暗中4 h，酶標儀于450 nm波長測定光密度（OD）值。所有實驗重復3次。

1.2.5 油紅O染色檢測細胞中脂質沉積 25.5 mmol/L葡萄糖處理細胞24 h后，用PBS沖洗，4%多聚甲醛固定30 min。將油紅O溶液按3∶2的比例在去離子水中稀釋，并在室溫下加入細胞10 min。用60%異丙醇清洗，去除多余染料。蘇木精染色5 min，并用PBS沖洗2次。用甘油明膠覆蓋載玻片，顯微鏡下觀察紅色脂滴。

1.2.6 細胞TC含量測定 25.5 mmol/L葡萄糖處理細胞24 h后，PBS沖洗細胞，收集細胞懸液，4 ℃、1 000×g離心10 min后收集細胞，按照細胞∶介質比例（1×106∶300 μL）加入勻漿介質，進行機械破碎，然后4 ℃、10 000×g離心10 min，取上清液置于冰上待測。參照說明書將空白孔、酶標板孔及樣本孔加入對應試劑。37 ℃孵育10 min，酶標儀測定510 nm波長處的OD值。TC含量（μmol/106）=（樣品OD值?空白OD值）/（標準品OD值?空白OD值）×標準品濃度/（106細胞的個數(shù)/異丙醇的體積）。

1.2.7 TUNEL法檢測細胞凋亡 PBS浸泡細胞5 min 3次。細胞核在室溫避光條件下用DAPI染色5 min。樣品在PBS中沖洗4次，然后在每個樣品中加入熒光淬滅劑。于激發(fā)波長450 nm、發(fā)射波長515～565 nm的條件下應用熒光顯微鏡觀察凋亡細胞。采用Image J pro plus軟件計算熒光強度進行分析，凋亡率=TUNEL陽性細胞數(shù)/DAPI陽性細胞數(shù)×100%。

1.2.8 免疫熒光染色檢測自噬活性 應用4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS沖洗3次。隨后，加入Triton X-100 10 min，并用胎牛血清在室溫下封閉1 h。之后，加入LC3或KLF4抗體，4 ℃孵育過夜。轉日，PBS清洗蓋片3次，加二抗后室溫孵育2 h。在熒光顯微鏡下觀察。采用Image J pro plus軟件計算平均熒光強度進行分析。每組3個樣本，每個樣本取5個視野。

1.2.9 Western blot檢測組織和細胞中KLF4及自噬相關蛋白表達 提取小鼠主動脈組織或巨噬細胞總蛋白，總蛋白經變性、定量、電泳、轉膜，用5%牛血清白蛋白將膜封閉2 h，加入一抗AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3、Beclin1、P62、KLF4抗體（稀釋比例均1∶1 000）、β-actin抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶2 000）繼續(xù)孵育4 h，加入顯色劑顯影后，Image J pro plus軟件檢測目的蛋白與內參β-actin蛋白條帶灰度值并計算相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用Prism GraphPad 8.0.2軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以[[x] ±s

]表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組小鼠糖脂代謝及主動脈KLF4蛋白表達水平比較 造模4周時，DM組小鼠血糖、TG、TC水平均高于NC組（P＜0.01），見表2。DM小鼠主動脈中KLF4的蛋白表達水平明顯低于NC組小鼠（0.74±0.06 vs. 1.00±0.11，n=5，t=3.594，P＜0.05），見圖1。

2.2 不同糖濃度及干預時間處理后細胞活力變化 5.6、12.7、25.5、33 mmol/L葡萄糖處理后細胞增殖活力（OD450）分別為0.70±0.01、0.82±0.02、0.98±0.04、1.02±0.07。隨著濃度升高，細胞活力增大（n=3，F(xiàn)=36.540，P＜0.01）。25.5 mmol/L和33 mmol/L葡萄糖處理后的細胞活力差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在25.5 mmol/L糖濃度條件下培養(yǎng)0、12、24、36 h，OD450值分別為0.57±0.03、0.75±0.04、1.02±0.08和1.11±0.06，隨著干預時間的延長逐漸升高（n=3，F(xiàn)=67.750，P＜0.01）。而24 h與36 h的OD450值差異無統(tǒng)計學意義，故選用25.5 mmol/L高糖濃度干預24 h進行體外實驗。

2.3 KLF4慢病毒和siRNA轉染效果驗證 Western blot結果顯示，LV-KLF4組KLF4表達水平明顯高于LV-NC組（2.60±0.04 vs. 1.01±0.01，n=3，t=35.730，P＜0.01），si-KLF4組KLF4表達水平低于si-NC組（0.66±0.05 vs. 1.01±0.03，n=3，t=9.941，P＜0.01），見圖2。

2.5 各組細胞中TC含量及細胞凋亡比較 si-KLF4組膽固醇含量較si-NC組增加（單位：μmol/106，2.37±0.10 vs. 1.69±0.05，n=3，t=10.620，P＜0.01），而LV-KLF4組膽固醇含量較LV-NC組下降（單位：μmol/106，0.65±0.05 vs. 1.62±0.08，n=3，t=17.380，P＜0.01）。TUNEL染色36 h時，si-KLF4組細胞凋亡率較si-NC組增加（單位：%，77.94±4.32 vs. 45.89±5.98，n=3，t=7.523，P＜0.01），而LV-KLF4組細胞凋亡率較LV-NC組減少（單位：%，13.39±4.69 vs. 41.11±5.39，n=3，t=6.715，P＜0.01），見圖4。

2.6 各組細胞自噬流以及自噬相關蛋白表達水平變化 si-KLF4組LC3熒光強度較si-NC組減弱（8.66±2.57 vs. 19.06±4.69，n=3，t=3.369，P＜0.05），LV-KLF4組LC3熒光強度較LV-NC組增強（34.29±4.57 vs. 17.76±5.27，n=3，t=4.110，P＜0.05），見圖5。與si-NC組相比，si-KLF4組Beclin1和LC3蛋白表達水平下降，P62、p-AKT、p-mTOR表達水平升高。相反，與LV-NC組相比，LV-KLF4組Beclin1和LC3蛋白表達水平增加，P62、p-AKT和p-mTOR的表達水平下降（P＜0.05），見圖6，表3。

3 討論

DM大血管并發(fā)癥的發(fā)病基礎主要為AS，AS可促進DM患者冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來，盡管對DM性AS的發(fā)病機制和治療方法的研究很多，但尚未發(fā)現(xiàn)特效治療方法。KLF4與內皮細胞、巨噬細胞等炎性細胞及促炎因子密切相關，本研究發(fā)現(xiàn)KLF4在DM小鼠主動脈的表達減少，可能參與DM性AS的發(fā)生發(fā)展。本研究將單核細胞THP-1誘導為巨噬細胞，模擬人巨噬細胞的動態(tài)變化。高糖可增強oxLDL的毒性作用，最終促進并引發(fā)AS的形成［8］，故經濃度篩選后選用25.5 mmol/L葡萄糖刺激細胞進行后續(xù)實驗。本研究結果顯示，KLF4敲減后，巨噬細胞凋亡增加，脂滴分泌增多，TC含量增加，推測KLF4影響高糖濃度下THP-1巨噬細胞對TC的攝取。當TC負荷超過細胞反應的閾值時，過量的TC不能從細胞中釋放，誘導炎性因子釋放、氧化應激和凋亡，導致細胞功能障礙［9］。TC和鞘磷脂之間的相互作用形成的脂筏可驅動線粒體-內質網串擾，調節(jié)多種特定細胞程序的信號轉導途徑，如凋亡、增殖、炎癥、自噬和衰老等［10］。此外，高糖會削弱對TC負荷的反應能力，導致TC積累增加［11］。

自噬對DM性AS發(fā)生機制中的脂質代謝過程具有不可忽視的影響［12］。P62蛋白可以直接結合LC3，然后被自噬降解，因此常被用作研究自噬通量的標志物。Sergin等［13］發(fā)現(xiàn)，AS小鼠主動脈和人動脈內膜斑塊中P62和多泛素化蛋白的豐度增加，這些蛋白與斑塊巨噬細胞共定位，表明P62增多是AS的特征。Swaminathan等［14］發(fā)現(xiàn)，頸動脈內膜切除術獲得的頸動脈斑塊中，與穩(wěn)定斑塊患者相比，不穩(wěn)定斑塊患者LC3-Ⅱ表達明顯降低，這種降低會使調亡細胞積聚在動脈壁上，并導致斑塊不穩(wěn)定。另有研究表明，血管平滑肌細胞中自噬相關基因7（autophagy-related gene 7，ATG7）缺失［15］或巨噬細胞特異性ATG 5缺失突變小鼠模型［13］可加重AS斑塊形成。在ATG 5缺失小鼠中，膽固醇晶體不會從斑塊中去除，并在巨噬細胞炎癥體過度活化后刺激產生白細胞介素1β［13］。KLF4還可作用于平滑肌細胞［16］和心肌細胞［17］，促進自噬。Salmon等［18］發(fā)現(xiàn)KLF4可分別與KLF2或鋅指蛋白148結合到Beclin1啟動子區(qū)，并通過增加人和小鼠平滑肌細胞的自噬水平來延緩主動脈瘤的形成。本研究結果顯示，KLF4過表達后細胞LC3熒光強度增強，Beclin1和LC3蛋白表達水平增加，P62表達水平減低，而KLF4敲減后結果反之，說明KLF4過表達后高糖干預下的巨噬細胞自噬水平增加，而敲減KLF4后巨噬細胞自噬水平減低，提示KLF4增加高糖條件下巨噬細胞的自噬功能。此外，有研究表明高糖處理的巨噬細胞外泌體可通過抑制足細胞自噬誘導對腎小球足細胞的損傷作用［19］，說明減少自噬可誘導細胞損傷，而其具體作用機制有待進一步探討。

研究報道雷帕霉素在體外和體內可誘導KLF4過表達，KLF4過表達抑血管平滑肌細胞mTOR及其下游通路4EBP-1和p70S6K的活性，阻止球囊損傷動脈內新內膜的形成［20］。雷帕霉素已被證明是一種有效的自噬誘導劑，具有抗真菌、免疫抑制、抗癌和神經保護特性［21］。而抑制mTOR表達已成為一種穩(wěn)定AS斑塊的新方法［22］。本研究結果顯示，KLF4通過AKT/mTOR途徑促進高糖濃度下THP-1巨噬細胞的自噬。而AKT可以通過直接磷酸化mTOR或滅活結節(jié)性硬化癥復合體2激活其底物mTOR，從而增強mTOR的激活水平［23］。選擇性抑制AKT/mTOR通路可有效誘導自噬，最終減少巨噬細胞在斑塊中的積累，促進斑塊穩(wěn)定，減少炎性因子分泌［24］。

綜上，KLF4通過AKT/mTOR途徑促進高糖濃度下THP-1巨噬細胞的自噬，減輕細胞內TC沉積，故推斷KLF4通過調節(jié)高糖濃度下巨噬細胞的自噬功能來調控AS進展。本研究從自噬角度揭示了DM性AS發(fā)病的可能機制，為DM大血管并發(fā)癥的防治提供了新的思路。

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（2024-03-08收稿 2024-04-21修回）

（本文編輯 胡小寧）

基金項目：天津市教委科研計劃項目（2019KJ193）

作者單位：天津醫(yī)科大學朱憲彝紀念醫(yī)院血液凈化中心、天津市內分泌研究所、國家衛(wèi)健委激素與發(fā)育重點實驗室、天津市代謝性疾病重點實驗室（郵編300134）

作者簡介：張睿（1986），女，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥、腎臟病、血液凈化相關方面研究。E-mail：zhangruiyes@163.com

△通信作者 E-mail：peiyu@tmu.edu.cn