過表達miR-486-5p的骨髓間充質干細胞通過外泌體來保護缺氧損傷心肌細胞

【摘要】目的" 探討過表達miR-486-5p小鼠骨髓間充質干細胞（BMSC）來源外泌體（Exo）對缺氧損傷心肌細胞的影響及機制。方法" 通過慢病毒轉染來構建過表達miR-486-5p的小鼠BMSC。提取轉染成功的BMSC所分泌的Exo，包括空載體BMSC分泌的Exo（Exo-NC）、miR-486-5p過表達BMSC分泌的Exo（Exo-miR-486）及未處理BMSC分泌的Exo（Exo-Control）。取12～18 d胎鼠原代心肌細胞，將其分為常氧培養(yǎng)組（Normoxia組）、缺氧培養(yǎng)組（Hypoxia組）、Hypoxia+Exo-NC組及Hypoxia＋Exo-miR-486組，并給予不同時間的缺氧處理來模擬心肌細胞缺氧狀態(tài)，檢測細胞增殖狀態(tài)、凋亡率，以及活性氧（ROS）、核苷酸結合結構域富含亮氨酸重復序列和含熱蛋白結構域受體3（NLRP3）和裂解的胱天蛋白酶-1（cleaved caspase-1）的表達水平。結果" Hypoxia組心肌細胞增殖能力低于Normoxia組，而凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1的表達水平均高于Normoxia組（P＜0.05）；Hypoxia＋Exo-NC組心肌細胞增殖能力高于Hypoxia組，凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1的表達水平低于Hypoxia組（P＜0.05）；Hypoxia＋Exo-miR-486組心肌細胞增殖能力高于Hypoxia＋Exo-NC組，凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1表達水平低于Hypoxia＋Exo-NC組（P＜0.05）。結論" 來自miR-486-5p過表達BMSC的Exo能減少缺氧導致的ROS的產生及其引起的心肌細胞凋亡，并改善缺氧引起的心肌細胞增殖緩慢的問題。

【關鍵詞】骨髓間充質干細胞；外泌體；心肌缺氧；miR-486-5p；凋亡

基金項目：國家自然科學基金（81970312）

通信作者：安松濤，E-mail：ansongtao2010@zzu.edu.cn

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.09.019

Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Overexpressing miR-486-5p Protect Hypoxic-Injured Cardiomyocytes via Exosomes

YAO Siyu1，ZHANG Tingting2，AN Songtao1

（1.Central China Fuwai Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450003，Henan，China； 2.Center for Clinical Single-Cell Biomedicine，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003，Henan，China）

【Abstract】Objective" To investigate the effects and mechanisms of exosomes （Exo） derived from bone marrow mesenchymal stem cell（BMSC） in mice overexpressing miR-486-5p on hypoxic-injured cardiomyocytes.Methods" Mouse BMSC overexpressing miR-486-5p was constructed by lentivirus transfection.Exo secreted by successfully transfected BMSC were extracted，including Exo secreted by empty carrier BMSC（Exo-NC），Exo secreted by BMSC overexpressing miR-486-5p （Exo-miR-486），and Exo secreted by untreated BMSC（Exo-Control）.Primary cardiomyocytes from 12～18 d fetal rats were divided into normal oxygen culture group（Normoxia group），hypoxia culture group（Hypoxia group），Hypoxia+Exo-NC group and Hypoxia+Exo-miR-486 group，and were given hypoxia treatments for different times to stimulate the hypoxic state of cardiomyocytes.Cell proliferation，apoptosis rate，and the expression levels of reactive oxygen species（ROS），

nucleotide-binding domain leucine-rich repeat and pyrin domain-containing receptor 3（NLRP3），and cleaved caspase-1 were examined.Results" The proliferation of cardiomyocytes in Hypoxia group was lower than that in Normoxia group，while the apoptosis rate and the expression levels of ROS，NLRP3 and cleaved caspase-1 in Hypoxia group were higher than those in Normoxia group（P＜0.05）；Myocardial cell proliferation capacity in Hypoxia+Exo-NC group was higher than that in Hypoxia group，the apoptosis rate and the expression levels of ROS，NLRP3 and cleaved caspase-1 were lower than those in Hypoxia group（P＜0.05）；The proliferation ability of myocardial cells in Hypoxia+Exo-miR-486 group was higher than that in Hypoxia+Exo-NC group，and the apoptosis rate and the expression levels of ROS，NLRP3 and cleaved caspase-1 were lower than those in Hypoxia+Exo-NC group（P＜0.05）.Conclusion" Exo from BMSC overexpressing with miR-486-5p can reduce hypoxic-induced ROS production and apoptosis of cardiomyocytes，and ameliorate hypoxic-induced slow proliferation of cardiomyocytes.

【Keywords】Bone marrow mesenchymal stem cell；Exosome；Myocardial hypoxia；miR-486-5p；Apoptosis

冠狀動脈性心臟病作為全球范圍內高發(fā)病率和高死亡率的主要疾病之一，迫切需創(chuàng)新的缺血后修復和再生的治療藥物。近年來，骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）迅速成為一種廣泛應用的實驗模型，以BMSC為基礎的治療正在成為一種修復缺血性心肌損傷的新方法［1］。盡管基于BMSC的研究已取得了一些進展，但該治療方法尚無法使心臟功能完全恢復到正常水平［2］。因此，進一步尋求提高BMSC治療效果的手段十分必要。BMSC參與缺血性心臟修復的部分機制可能是旁分泌效應。最近的研究［3］表明，BMSC可通過分泌外泌體（exosome，Exo）在體內和體外對心肌細胞產生抗凋亡作用，保護缺血缺氧誘發(fā)的心臟損傷。其中，微小RNA（microRNA，miRNA）在心肌缺血性損傷中扮演著重要的調控作用［4-8］。miR-486-5p是一種顯著富集于BMSC-Exo中的miRNA分子，可通過靶向調控血管生成、細胞的凋亡及炎癥反應，從而對心血管疾病發(fā)揮著重要調控作用［9］。然而，來自BMSC-Exo的miR-486-5p對心肌細胞的調控作用尚不清楚。因此，本研究構建了miR-486-5p慢病毒過表達載體轉染BMSC，收集其分泌的Exo并與缺氧損傷的原代心肌細胞共培養(yǎng)，以探討miR-486-5p聯合BMSC對缺血性心臟病的治療作用。

1" 材料與方法

1.1" 材料與試劑

miR-486-5p過表達慢病毒及其空載慢病毒均購自吉凱基因生物公司，miRNA引物由上海生工生物工程公司合成。主要實驗試劑和設備包括：TRIzol試劑盒（諾唯贊Q111-02/03）、CCK-8試劑盒（碧云天C0037）、細胞凋亡試劑盒（索萊寶CA1030-20T）、胎牛血清（Gibco 12484028）、胰蛋白酶（索萊寶T1350）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（索萊寶PC0020-50T）、BMSC培養(yǎng)基（STEM CELL Technologies 05514）、DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco A4192001）、互補DNA（complementary DNA，cDNA）合成試劑盒（諾唯贊R312-01/02）、無血清培養(yǎng)基（中喬新舟ZQ-1320）、β-actin一抗（碧云天 AF5003）、核苷酸結合結構域富含亮氨酸重復序列和含熱蛋白結構域受體3（nucleotide-binding domain leucine-rich repeat and pyrin domain-containing receptor 3，NLRP3）一抗（碧云天 AF2155）、裂解的胱天蛋白酶-1（cleaved caspase-1）一抗（碧云天 AF1681），以及熒光顯微鏡（Olympus）。

1.2" 實驗動物

選取8周齡無特定病原體級成年雄性C57BL/6J小鼠10只，雌性C57BL/6J孕鼠（孕12～18 d）3只，體重（20±3）g。小鼠均購于北京維通利華實驗動物中心，分籠飼養(yǎng)于鄭州大學實驗動物中心，并經鄭州大學動物倫理委員會審批通過（ZZU-LAC20200828［06］）。

1.3" BMSC的分離培養(yǎng)與鑒定

無菌條件下脫頸處死小鼠，分離后肢皮膚肌肉，取出股骨。剔除股骨附著肌肉及筋膜，剪去兩端干骺端，開放骨髓腔。200 μL槍頭剪短后置于1.5 mL的EP管內，股骨放入槍頭內，800×g離心5 min，得骨髓細胞沉淀。用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，合適濃度種入六孔板內，放入培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。細胞融合至80%以上進行傳代，傳代3次后的細胞用作轉染實驗。流式細胞術檢測第3代BMSC細胞表面標志物（CD29、CD44、CD105和Sca-1）的表達。而后參照已發(fā)表的研究方法［10］，完成小鼠BMSC成脂、成骨和成軟骨三系分化的檢測。

1.4" 慢病毒載體的構建

將構建成功的miR-486-5p基因插入慢病毒包裹質粒GV492中，元件順序為Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，克隆位點為BamHI/Agel，對照編號為CON335，病毒保存于-80 ℃冰箱。

1.5" 慢病毒轉染BMSC

取生長狀態(tài)良好的BMSC進行慢病毒轉染。細胞分為未轉染慢病毒的空白對照組（Control組）、轉染慢病毒空載體組（NC組）和轉染過表達miR-486-5p的慢病毒組（miR-486-5p組）。在慢病毒轉染BMSC 16 h后，更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，至72 h后，熒光顯微鏡觀察熒光表達情況。轉染成功后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達的細胞株。

1.6" Exo分離鑒定

對穩(wěn)定表達細胞株進行擴大培養(yǎng)，待細胞密度達80%以上時，更換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后搜集上清液用于Exo分離。采用常規(guī)超高速離心法分離Exo：首先2 000×g 10 min離心2次去除死細胞和細胞碎片，然后10 000×g離心10 min去除細胞器，100 000×g 離心60 min得到Exo。根據不同的細胞來源，Exo分為空載體BMSC分泌的Exo（Exo-NC）、miR-486-5p過表達BMSC分泌的Exo（Exo-miR-486）及未處理BMSC分泌的Exo（Exo-Control）。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定Exo蛋白濃度，透射電鏡來觀察Exo的形態(tài)，納米顆粒跟蹤分析技術檢測Exo粒徑。

1.7" 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測Exo中miR-486-5p的表達水平

使用TRIzol試劑并按照說明書提取各組BMSC所釋放Exo的總RNA，并將總RNA逆轉錄為cDNA，并以cDNA為模版進行實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應擴增。以U6作為內參，通過相對標準曲線法（2-ΔΔCt）來計算相對表達量。引物序列miR-486-5p正向引物5’-GCGCGCCGACGAGCGC-3’，反向引物5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’，U6正向引物5’- CT CGCTTGGCACA-3’，反向引物5’-AACGCTTCACGAA TTTGCGT-3’。

1.8" 心肌細胞分離與培養(yǎng)

從妊娠12～18 d C57BL/6J小鼠胚胎中取20～30顆胎鼠心臟，并用0.06%胰蛋白酶進行消化，加入相同體積培養(yǎng)基終止消化。消化后心臟勻漿通過100 μm的細胞濾網進行過濾。將過濾所得的液體放入離心機中，1 000 r/min離心5 min，離心完成后用DMEM培養(yǎng)基進行重懸，接種于細胞培養(yǎng)皿內，放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。30 min后成纖維細胞貼壁生長，而心肌細胞不貼壁，吸出尚未貼壁細胞懸液并重新鋪板。將合適濃度心肌細胞接種入24孔板中，處理組使用含有400 μg/mL Exo的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，24 h后細胞貼壁密度達到60%，置于缺氧小室內通氣（95%N2＋5%CO2）。

1.9" 心肌細胞實驗分組

對不同處理心肌細胞進行分組，包括常氧培養(yǎng)組（Normoxia組）、缺氧培養(yǎng)組（Hypoxia組）、缺氧＋空載體BMSC分泌的Exo組（Hypoxia＋Exo-NC組）及缺氧＋miR-486-5p過表達BMSC分泌的Exo組（Hypoxia＋Exo-miR-486組）。

1.10" CCK-8與Ki67染色檢測細胞增殖

將2×103個/孔接種在96孔板的心肌細胞分組后培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，分別在不同時間點（0、24、48和72 h）向不同組別的心肌細胞中加入100 μL CCK-8溶液處理2 h，并使用酶標儀在450 nm波長處測量吸光度。將培養(yǎng)至合適密度的心肌細胞用4%多聚甲醛進行固定，1%Triton X-100行細胞膜滲透，1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS）洗滌3次，每次5 min，用含5%的牛血清白蛋白溶液室溫下封閉30 min，Ki67抗體孵育，4 ℃過夜。PBS洗滌以除去未結合抗體。加入免疫熒光二抗，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗，細胞核染色劑進行核染色，最后熒光顯微鏡進行觀察。

1.11" 流式細胞術檢測心肌細胞凋亡

取不同組別的心肌細胞用胰酶消化處理后，收集細胞沉淀并用PBS洗滌，190 μL細胞懸液中加入5 μL 異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白V，在異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白V結合緩沖液中重懸，細胞懸液中加入5 μL碘化丙啶溶液。將細胞在室溫下避光孵育15 min，然后使用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.12" 活性氧檢測

使用無血清培養(yǎng)基稀釋2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯 （2’，7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA），使最終濃度為10 μmol/L。將稀釋好的DCFH-DA加入培養(yǎng)皿中，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育30 min。孵育完成后PBS進行洗滌，然后用細胞核染色劑染色細胞核，熒光顯微鏡進行觀察。

1.13" 蛋白表達量的檢測

取各組心肌細胞，使用組織蛋白裂解液進行細胞裂解，并提取細胞總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳使不同分子量的蛋白質分離。分離完成后進行轉膜，脫脂奶粉封閉、而后進行β-actin、NLRP3和cleaved caspase-1一抗4 ℃孵育過夜。一抗孵育完成，二抗孵育1 h。最后使用凝膠成像系統進行拍照，對蛋白質表達水平進行定量分析。

1.14" 統計學方法

所有數據采用SPSS 24.0統計軟件包進行統計學分析，均進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，各組間總的趨勢比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗法，以±s表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1" BMSC的分離與鑒定

倒置顯微鏡觀察BMSC形態(tài)發(fā)現，BMSC貼壁生長，細胞大小均勻，呈魚群狀生長（圖1A）。流式細胞術檢測結果表明，幾乎所有的細胞均表達CD29、CD44、CD105和Sca-1，但幾乎沒有細胞表達CD34、CD45和CD11b（圖1B）。多向分化結果表明，BMSC具有成骨、成脂和成軟骨的分化能力（圖1C）。

2.2" miR-486-5p過表達慢病毒轉染效率驗證

與Control組相比，NC組和miR-486-5p組出現明顯綠色熒光，表明轉染成功（圖2）。

2.3" BMSC上清液Exo鑒定

從BMSC培養(yǎng)的上清液中分離Exo，并通過透射電鏡觀察到，Exo以圓形顆粒的形式均勻地分布于視野中，并呈雙層囊泡結構，見圖3A。納米顆粒跟蹤分析了Exo的直徑大小為50～100 nm，符合Exo特征，表明上清液Exo提取成功，見圖3B。通過實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應來驗證Exo內miR-486-5p表達情況，結果發(fā)現，與Exo-Control和Exo-NC組相比，Exo-miR-486-5p組中miR-486-5p表達顯著升高（P＜0.05），表明miR-486-5p過表達模型構建成功，見圖3C。

2.4" miR-486-5p過表達促進缺氧處理后心肌細胞的增殖

與Normoxia組相比，缺氧24、48和72 h后，Hypoxia組心肌細胞增殖活性均顯著下降（P＜0.05）；與Hypoxia+Exo-NC組相比，缺氧24、48和72 h后，Hypoxia+Exo-miR-486組心肌細胞增殖活性均明顯升高（P＜0.05），見表1。通過對缺氧24 h心肌細胞進行Ki67熒光染色同樣驗證了與其他組相比，過表達miRNA-486-5p的BMSC所分泌的Exo能更有效地促進缺氧狀態(tài)下心肌細胞的增殖（P＜0.05），見表2。

2.5" miR-486-5p過表達減少缺氧處理后心肌細胞活性氧的產生及細胞的凋亡

與Normoxia組相比，Hypoxia組心肌細胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）的表達量及細胞的凋亡率顯著增加（P＜0.05），而Exo可顯著減少細胞ROS的產生及細胞的凋亡，而與Hypoxia+Exo-NC組比較，Hypoxia+Exo-miR-486組效果更佳（Plt;0.05），見表2。

2.6" miR-486-5p過表達對缺氧心肌細胞中NLRP3/cleaved caspase-1通路的影響

與Normoxia組相比，Hypoxia組心肌細胞NLRP3和cleaved caspase-1的表達水平顯著增高（P＜0.05）；與Hypoxia組相比，Hypoxia+Exo-NC組心肌細胞NLRP3和cleaved caspase-1的表達水平降低（P＜0.05）；與Hypoxia+Exo-NC組比較，Hypoxia+Exo-miR-486組心肌細胞NLRP3和cleaved caspase-1的表達水平降低（P＜0.05）。見圖4。

3" 討論

冠狀動脈性心臟病是全球范圍內最常見的疾病之一，也是導致死亡的主要原因之一［11］。冠狀動脈供血不足會導致心肌缺氧，進而引發(fā)一系列的病理生理改變，最終可能導致心肌細胞死亡，嚴重影響心臟功能。目前，臨床上常用的治療手段包括藥物治療、冠狀動脈介入治療等。然而以上方案僅起到延緩心力衰竭的作用，并不能從根本上防治心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。因此，尋找一種更有效的治療方法來保護缺血心肌細胞、改善其不良預后具有重要的臨床意義。

BMSC是一種起源于骨髓的成體干細胞，因其具有自我更新能力及多向分化的潛能，成為干細胞治療心肌損傷的最佳“種子細胞”。近年來的研究［12-14］表明，BMSC所釋放的Exo對多種疾病具有保護作用，包括缺氧缺血性腦病、腫瘤性疾病、順鉑誘導的耳毒性及慢性腎臟病的血管鈣化等。在冠狀動脈性心臟病中，BMSC-Exo在誘導心肌細胞增殖、增強毛細血管密度、抑制心肌纖維化等方面表現出色［15］。在Exo所包含的多種分子中，miRNA因其對體內的細胞生物學過程具有廣泛的調節(jié)作用而備受關注［16］。作為細胞通信的中介分子，Exo來源的miRNA可降低心肌缺血再灌注損傷程度，改善心力衰竭后的心臟功能，并調節(jié)心肌梗死后的炎癥反應，從而發(fā)揮其心臟保護作用［17］。

miR-486-5p被認為是在細胞存活中扮演重要角色的miRNA。研究［9］表明，含有miR-486-5p的Exo可促進小鼠心肌梗死后血管的形成。此外，miR-486-5p還可通過p53介導的Bcl-2相關線粒體凋亡通路來調控心肌細胞凋亡［18］。這一發(fā)現提供了miR-486-5p作為潛在心臟疾病治療靶點的新線索，也為深入研究miR-486-5p在心臟健康和疾病中的作用機制提供了重要的啟示。在本研究中，通過慢病毒轉染構建miR-486-5p過表達的BMSC，提取分泌的Exo來驗證缺氧條件下不同來源Exo對損傷心肌的修復作用。

在缺氧條件下，心肌細胞內能量代謝紊亂、線粒體功能受損、ATP合成減少，導致細胞增殖所需的能量供應不足。此外，缺氧會導致細胞核DNA損傷，影響細胞DNA合成和修復，細胞周期調控受阻，特別是在G1/S和G2/M期的轉變受到影響，從而影響細胞的增殖［19］。本研究同樣證實了在缺氧條件下，心肌細胞的增殖受到了顯著的抑制，而Exo的治療可顯著改善這一現象，尤其是Exo-miR-486效果更為顯著。

缺氧狀態(tài)下細胞內氧化應激反應增加，大量的自由基和氧化物質的堆積將顯著影響細胞正常功能，細胞內一系列信號通路會被激活，包括線粒體途徑、細胞凋亡受體途徑和內質網應激等。這些信號通路會引發(fā)一系列凋亡相關蛋白的表達和活化，并最終導致細胞凋亡與壞死［20］。其中，ROS已被確定為心臟疾病中重要的NLRP3炎性小體激活劑，ROS過量產生可在心臟毒性中通過NLRP3炎性小體引起大量心肌細胞凋亡［21-22］。本研究結果顯示，在缺氧條件下心肌細胞ROS水平增加，這與先前的研究［23］結果相一致。

NLRP3炎癥小體是由固有免疫受體蛋白NLRP3、銜接蛋白和炎癥蛋白酶cleaved caspase-1組成的胞質多蛋白復合體，能對微生物感染、內源性危險信號和環(huán)境刺激做出反應［24-25］。既往與NLRP3炎癥小體相關的研究主要集中在免疫反應，近年來，越來越多的證據發(fā)現NLRP3炎癥小體在心血管疾病中發(fā)揮關鍵作用［26］。研究［27-28］表明，NLRP3炎癥小體在心臟缺血再灌注損傷、心肌梗死和動脈粥樣硬化的病理過程中發(fā)揮重要作用。異丙酚可通過PPARγ/HMGB1/NLRP3軸抑制炎癥和凋亡，改善內毒素誘導的心肌細胞損傷［29］。糖原合成酶激酶-3β可介導NLRP3炎癥小體激活，導致大鼠心肌細胞和成纖維細胞發(fā)生凋亡［30］。這些研究都表明NLRP3/cleaved caspase-1通路在心肌細胞的凋亡中具有重要的作用。在本研究中，通過蛋白質印跡法檢測各組心肌細胞中NLRP3和cleaved caspase-1的表達量，流式細胞儀觀察心肌細胞的凋亡。結果表明，Exo-miR-486干預可顯著減少缺氧心肌細胞中NLRP3和cleaved caspase-1的表達，這與其可減少心肌細胞中的ROS相對應，并可能通過該途徑減少心肌細胞的凋亡。

綜上所述，過表達miR-486-5p的BMSC所釋放的Exo可促進心肌細胞的增殖，并抑制心肌細胞ROS的產生，其中NLRP3/cleaved caspase-1通路在心肌細胞生理和病理過程中起著重要調節(jié)作用。

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收稿日期：2024-01-15