過表達SLC7A5 基因?qū)Υ笫舐殉差w粒細胞凋亡的影響及其機制

［摘 要］ 目的：探討過表達溶質(zhì)載體家族7成員5（SLC7A5） 基因?qū)Υ笫舐殉差w粒細胞凋亡的影響，并闡明其相關(guān)機制。方法：4只3周齡SPF級SD雌性大鼠，提取原代大鼠卵巢顆粒細胞，分為陰性對照組（NC 組） 和促卵泡激素受體（FSHR） 染色組（FSHR 組）。免疫熒光染色法觀察大鼠卵巢顆粒細胞中FSHR 蛋白表達情況，鑒定原代大鼠卵巢顆粒細胞是否成功分離。將大鼠卵巢顆粒細胞分為對照組（轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒） 和OE-SLC7A5 組（轉(zhuǎn)染SLC7A5 過表達質(zhì)粒）， 采用實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法和Western blotting 法驗證細胞轉(zhuǎn)染效率。流式細胞術(shù)檢測2 組卵巢顆粒細胞凋亡率，流式細胞術(shù)檢測2 組不同細胞周期卵巢顆粒細胞百分率，RT-qPCR 法檢測2 組卵巢顆粒細胞中SLC7A5、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3、Caspase-8 和腫瘤壞死因子α （TNF-α） mRNA 表達水平，Western blotting法檢測2組卵巢顆粒細胞中SLC7A5、Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-8、cleaved Caspase-8和 TNF-α蛋白表達水平。結(jié)果：熒光顯微鏡下卵巢顆粒細胞呈長梭形或者不規(guī)則形，特異性表達FSHR，NC 組未見FSHR 綠色熒光表達，F(xiàn)SHR 組可見FSHR 綠色熒光表達，提示大鼠原代卵巢顆粒細胞成功分離。與對照組比較，OE-SLC7A5 組卵巢顆粒細胞中SLC7A5 mRNA 和蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05），提示SLC7A5 過表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染卵巢顆粒細胞。流式細胞術(shù)檢測，與對照組比較，OE-SLC7A5 組細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）。與對照組比較，OE-SLC7A5 組S 期卵巢顆粒細胞百分率明顯降低（Plt;0. 05）。RT-qPCR 法檢測，與對照組比較，OE-SLC7A5 組卵巢顆粒細胞中TNF- α、Caspase-3 和Caspase-8 mRNA 表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）。Westernblotting 法檢測，與對照組比較，OE-SLC7A5 組卵巢顆粒細胞中TNF-α、Caspase-8、cleaved Caspase-8、Caspase-3、cleaved Caspase-3和SLC7A5蛋白表達水平均明顯升高 （Plt;0. 05）。結(jié)論：SLC7A5蛋白表達增加能夠通過上調(diào)TNF-α、Caspase-8 和Caspase-3 凋亡通路表達，促進顆粒細胞凋亡。

［關(guān)鍵詞］ 溶質(zhì)載體家族7 成員5； 大鼠卵巢顆粒細胞； 細胞凋亡； 腫瘤壞死因子α； 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3； 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶8

［中圖分類號］ R711. 75 ［文獻標志碼］ A

溶質(zhì)載體家族7 成員5 （solute carrier family 7member 5，SLC7A5） 基因定位于人16 號染色體，其編碼產(chǎn)物為L 型氨基酸轉(zhuǎn)運體1 （L-type aminoacid transporter 1， LAT1）， 主要功能是轉(zhuǎn)運特定氨基酸，為細胞的生長提供原料［1-2］。不同組織和細胞中SLC7A5 蛋白表達水平不同，如在大腦、睪丸、卵巢和胎盤等組織中SLC7A5 蛋白高表達，而在肺、心臟和肝臟等組織中SLC7A5 蛋白表達水平較低［3］。研究［4］ 顯示： SLC7A5 蛋白在多種腫瘤細胞中高表達，提示其對腫瘤的快速生長和增殖可能起著重要的作用， 包括乳腺癌［5］、卵巢癌［6］ 和子宮內(nèi)膜癌［7］ 等女性常見的癌癥。SLC7A5 不僅與癌癥的預(yù)后不良有關(guān)， 還與化療耐藥有密切關(guān)聯(lián)。此外，SLC7A5 在胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也發(fā)揮重要作用［8］。本課題組前期研究［9］ 結(jié)果顯示： 來曲唑誘導的多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS） 模型大鼠卵巢組織中SLC7A5 mRNA 表達水平明顯升高， 提示SLC7A5 可能在PCOS 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。但SLC7A5 在卵巢組織中的功能尚未完全闡明。卵巢顆粒細胞作為卵巢內(nèi)重要的類固醇激素合成細胞，在卵泡的發(fā)育及成熟過程中發(fā)揮重要作用［10］。SLC7A5 在顆粒細胞中的功能尚未見報道。本研究探討SLC7A5 對大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響，并闡明其具體的作用機制，為研究SLC7A5 在PCOS中的病理機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、主要試劑和儀器 4只3周齡SPF級SD 雌性大鼠，體質(zhì)量約50 g，購于遼寧長生生物有限公司，飼養(yǎng)于吉林大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號： SYXK （吉） 2018-0001。血促性素購于寧波第二激素廠， DMEM/F12 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline， PBS） 和胎牛血清（fetal bovine serum， FBS） 均購于美國Hyclone 公 司，兔 抗 促 卵 泡 激 素 受 體（folliclestimulatinghormone receptor， FSHR） 多克隆抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanateisomer，F(xiàn)ITC） 標記山羊抗兔抗體、鼠抗甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH） 抗體、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase， Caspase）-3抗體和兔抗Caspase-8 抗體購于上海Bioworld 分公司，pcDNA3. 1 質(zhì)粒、SLC7A5 過表達質(zhì)粒和大腸桿菌菌株DH5A 購于生工生物工程（上海） 股份有限公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，F(xiàn)uGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑購于瑞士Roche 公司， 細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒和Annexin Ⅴ-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，兔抗SLC7A5抗體購于美國INVITROGEN 公司， 兔抗cleaved Caspase-8抗體購于美國Affinity Biosciences 公司， 兔抗cleaved Caspase-3 抗 體 購 于 美 國 Cell SignalingTechnology 公 司。 3500P 實 時 熒 光 定 量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR）儀（型號：MX3005P） 購于美國安捷倫科技有限公司， 微量紫外分光光度儀（型號： NANODROP2000） 購于美國Thermo 公司， 酶標儀（型號：EON） 購于美國BIOTEX 公司， 流式細胞分析儀（型號： CYTOFLEX LX） 購于美國BECKMAN公司。

1. 2 大鼠卵巢原代顆粒細胞分離和培養(yǎng) 4只3周齡SPF 級SD 雌性大鼠，體質(zhì)量約50 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，腹腔注射血促性素50 IU，48 h 后處死。采用75% 乙醇溶液徹底消毒， 后置于超凈臺， 逐層剪開大鼠腹部皮膚和腹膜，找到雙側(cè)卵巢，分離卵巢表面被覆筋膜及脂肪組織， PBS 緩沖液沖洗3 次，后置入DMEM/F12 培養(yǎng)基中。在顯微鏡下，使用1 mL 注射器針頭充分刺破卵泡， 加入適量0. 25% 胰蛋白酶，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中徹底消化，間隔10 min 從培養(yǎng)箱取出，用移液槍反復(fù)吹打。20 min 后利用顯微鏡觀察顆粒細胞形成單個細胞時， 加入含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)液終止消化。將上述組織細胞液通過100 μm 細胞篩過濾收集細胞懸液，離心后棄上清。加入含10% FBS 和1% 雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基，顯微鏡下計數(shù)細胞后接種于相應(yīng)的細胞培養(yǎng)板中［11］，用于后續(xù)實驗。

1. 3 免疫熒光染色法觀察大鼠卵巢顆粒細胞中FSHR蛋白表達情況 取大鼠卵巢顆粒細胞，分為陰性對照組（NC 組）和FSHR 染色組（FSHR 組）。將卵巢顆粒細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，于細胞生長密度為70%～80% 時，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。預(yù)冷的冰甲醇室溫固定20 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，隨后加入0. 1% TritonX-100，室溫放置10 min，PBS 緩沖液洗滌3 次。加入1% BSA， 室溫放置10 min， 棄去封閉液， 加入FSHR 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，棄去一抗，PBS 緩沖液洗滌3 次；加入FITC 標記山羊抗兔二抗，室溫避光孵育2 h；棄去二抗，PBS 緩沖液洗滌3 次；加入PI 避光放置10 min，PBS 緩沖液洗滌3 次；95% 甘油封片后，顯微鏡下觀察2 組大鼠卵巢顆粒細胞中FSHR蛋白表達情況并拍照。FSHR 蛋白為顆粒細胞的標志性蛋白，F(xiàn)SHR 陽性染色定位于細胞質(zhì)，呈綠色熒光，細胞核呈紅色熒光。顯微鏡下見FSHR 綠色熒光即成功分離大鼠原代卵巢顆粒細胞［12］。

1. 4 SLC7A5過表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴增 載體質(zhì)粒擴增：取1. 5 mL EP 管，加入30 mg·L－1質(zhì)粒2 μL，再加入50 μL 菌株，混勻置于冰上30 min。后置于42 ℃ 環(huán)境中90 s， 之后立即取出置于冰上2 min。加入1 mL LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min－1 震蕩1～2 h。10 000 g 離心5 min，棄上清，留約200 μL，吹打細菌，于超凈臺內(nèi)涂板，37 ℃正置培養(yǎng)1 h 后倒置過夜。次日，挑取單克隆菌落，放入5 mL 液體培養(yǎng)基中搖菌，之后再轉(zhuǎn)移至200 mL 培養(yǎng)基中搖菌過夜。

質(zhì)粒提?。?按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書進行操作。向吸附柱中加入2. 5 mL 平衡液，8 000 r·min－1 離心2 min，棄濾液。取200 mL 菌液于無菌的離心管中，4 ℃、8 000 r·min－1離心20 min，去上清。加入10 mL P1溶液，震蕩離心。加入10 mLP2 溶液，輕柔翻轉(zhuǎn)6～8 次，靜置5 min。加入10 mLP4 溶液， 翻轉(zhuǎn)6～8 次， 靜置10 min 后， 4 ℃ 、8 000 r·min－1 離心15 min。倒入過濾器中。50 mL離心管收集濾液，加入0. 3 倍體積的異丙醇，混勻后轉(zhuǎn)移到平衡后的吸附柱中。4 ℃、8 000 r·min-1多 次 離 心，每 次 2 min。加 入 10 mL 漂 洗 液，4 ℃ 、8 000 r·min-1離心2 min，棄濾液，重復(fù)1 次加入3 mL的無水乙醇，4 ℃、8 000 r·min-1離心2 min。棄濾液，將吸附柱放回收集管中，4 ℃、8 000 r·min-1離心5 min。吸附柱開蓋放置5 min。將吸附柱置于新的收集管中，加入1 mL ddH2O。室溫放置5 min，4 ℃、8 000 r·min-1 離心5 min，收集質(zhì)粒，檢測質(zhì)粒測濃度和純度，適量分裝，-20 ℃保存。

1. 5 細胞轉(zhuǎn)染和分組 實驗分為對照組 （轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒） 和SLC7A5 過表達質(zhì)粒組（OESLC7A5組， 轉(zhuǎn)染SLC7A5 過表達質(zhì)粒）。將顆粒細胞接種至適量完全培養(yǎng)基的6 孔細胞培養(yǎng)板中，使轉(zhuǎn)染時的細胞密度為50%～60%。每孔取120 μL的opti-MEM 培養(yǎng)基， 加入3 μg 質(zhì)粒， 輕輕混勻；向上述液體中加入每孔6 μL FuGENE 轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹打混勻，室溫靜置孵育10 min；再將上述混合液加入每孔含1 874 μL 無抗生素培養(yǎng)基的6 孔細胞培養(yǎng)板中，輕輕混勻。將細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。細胞轉(zhuǎn)染24～48 h 后，采用RT-qPCR 法和Western blotting 法驗證細胞轉(zhuǎn)染效率。

1. 6 流式細胞術(shù)檢測 2 組卵巢顆粒細胞凋亡率 按照Annexin Ⅴ-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，處理后， PBS 緩沖液沖洗細胞， 加入胰酶， 觀察細胞為單個細胞后終止消化。細胞懸液收集至離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入PBS 緩沖液重懸細胞；1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC 結(jié)合液、5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和10 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI） 染色液， 輕輕混勻； 室溫避光孵育15 min；隨后冰浴避光存放，1 h 內(nèi)放入流式細胞儀中檢測細胞凋亡率。FITC （+） 和PI （-） 為早期凋亡細胞；FITC （+） 和PI （+） 為晚期凋亡細胞。細胞凋亡率= （早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù)） /細胞總數(shù)×100%。

1. 7 流式細胞術(shù)檢測 2 組不同細胞周期卵巢顆粒細胞百分率 根據(jù)細胞周期檢測試劑盒說明書進行操作。卵巢顆粒細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中。處理后，PBS 緩沖液沖洗細胞，放入適量的胰酶，觀察細胞成單個細胞后終止消化，細胞懸液收集到離心管中，1 000 r·min-1 離心5 min，棄上清，加入PBS 緩沖液重懸細胞，重復(fù)1 次；加入預(yù)冷的70% 乙醇溶液吹打混勻， 4 ℃ 放置12～24 h ；1 000 r·min-1 離心5 min， 棄上清， 加入PBS 緩沖液重懸細胞， 重復(fù)1 次； 每管細胞中加入0. 5 mLPI 染色液，重懸細胞，37 ℃避光溫浴30 min。隨后冰浴避光存放。24 h 內(nèi)放入流式細胞儀中檢測2 組不同細胞周期卵巢顆粒細胞百分率。

1. 8 RT-qPCR 法 檢 測 2 組 卵 巢 顆 粒 細 胞 中SLC7A5、Caspase-3、Caspase-8 和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） mRNA表達水平 棄去原有培養(yǎng)液，加入TRIzol 裂解液，吹打后靜置5 min；細胞裂解液收集至RNases Free EP 管中，加入三氯甲烷充分振蕩，靜置2 min，12 000 g 離心3 min；收集上層的溶液至新的EP 管中，加入等體積96% 乙醇溶液， 混勻； 轉(zhuǎn)移至核酸吸附柱中，12 000 g 離心1 min； 棄濾液， 加入0. 4 mL 3M 乙酸鈉， 12 000 g 離心1 min； 棄濾液， 加入0. 4 mL75% 乙醇， 12 000 g 離心1 min ； 重復(fù)上步操作1 次；棄濾液，12 000 g 離心2 min；棄濾液，開蓋室溫干燥2 min；將核酸吸附柱放入新的RNases FreeEP 管 中，加 入30～50 μL DEPC 水，靜 置 2 min；12 000 g 離心2 min。采用微量紫外分光光度儀檢測RNA 濃度和純度。采用5X All-In-One RTMaster Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并檢測其濃度和完整性。RT-qPCR 反應(yīng)體系：SYBR Mix 10 μL， 10 μmol·L-1 上游引物0. 5 μL，10 μmol·L-1 下游引物0. 5 μL， RNase-Free H2O5 μL， cDNA 4 μL。置入熒光定量PCR 儀中， 按步驟設(shè)置程序。引物序列： GAPDH F 5'-CAAGTTCAACGGCACA-3'， GAPDH R 5'-CAGTAGACTCCACGACAT-3'； SLC7A5 F 5'-CTCTGCGTGCTACTACTC-3'， SLC7A5 R 5'-TTGTCCTATGTCCTTTCCC-3'； Caspase-3 F 5'-GCGATGACTCAGCACCTCCATG-3'， Caspase-3 R 5'-GCGATGACTCAGCACCTCCATG-3'； Caspase-8F 5'-ACTCGGCGACAGGTTACAGC-3'， Caspase-8R 5'-AGGGCAGCCAGTTCTTCGTT-3'； TNF- αF 5'-CCACCACGCTCTTCTGTCTACTG-3'，TNF- α R 5'-GGGCTACGGGCTTG TCACTC-3'。以GAPDH 為內(nèi)參， 采用2—ΔΔCt 法計算目的基因表達水平，實驗重復(fù)3 次。

1. 9 Western blotting法檢測 2組卵巢顆粒細胞中SLC7A5、Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-8、cleaved Caspase-8 和 TNF-α 蛋白表達水平 去除原有細胞培養(yǎng)基，加入胰酶消化，收集至EP 管中，2 000 r·min-1 離心5 min。棄上清， 加入細胞裂解液，振蕩混勻。4 ℃、靜置5 min，取出振蕩，重復(fù)3 次。4 ℃、12 000 g 離心15 min。采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品95 ℃變性10 min。加入SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)。電泳時，60 V 恒壓電泳40 min 后， 120 V、1. 5 h。采用半干轉(zhuǎn)膜儀恒壓轉(zhuǎn)膜，放入5% BSA 封閉液中，室溫封閉60～120 min 。分別采用抗TNF- α 抗體（1∶ 1 000）、抗Caspase-3 抗體（1∶ 2 000）、抗cleaved Caspase-3 抗體（1∶ 500）、抗Caspase-8 抗體（1∶ 2 000）、抗cleaved Caspase-8 （1∶ 1 000）和抗GAPDH 抗體（1∶ 5 000） 于4 ℃ 孵育過夜。TBST 溶液洗滌8 min，重復(fù)4 次。加入HRP 標記的羊抗兔或羊抗鼠抗體（1∶2 000） 室溫避光孵育60 min。TBST 溶液洗滌8 min， 重復(fù)4 次。使用Tanon 化學發(fā)光檢測儀進行蛋白檢測。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白表達水平，實驗重復(fù)3 次。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 10 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 23. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。2 組卵巢顆粒細胞凋亡率、S 期卵巢顆粒細胞百分率、卵巢顆粒細胞中細胞凋亡相關(guān)基因mRNA 表達水平和凋亡相關(guān)蛋白表達水平均符合正態(tài)分布且方差齊，以x±s 表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2. 1 原代大鼠卵巢顆粒細胞中 FSHR 蛋白表達情況 熒光顯微鏡下觀察，卵巢顆粒細胞鏡下呈長梭形或者不規(guī)則形，特異性表達FSHR，NC 組未見FSHR 綠色熒光表達，F(xiàn)SHR 組可見FSHR 綠色熒光表達，提示大鼠原代卵巢顆粒細胞成功分離。見圖1。

2. 2 SLC7A5過表達質(zhì)粒細胞轉(zhuǎn)染效率驗證 與對 照 組（1. 00 ± 0. 26 和 0. 51 ± 0. 24） 比 較，OE-SLC7A5 組卵巢顆粒細胞中SLC7A5 mRNA 和蛋白表達水平（361. 81±176. 30 和2. 16±1. 26）均明顯升高（Plt;0. 05）， 提示SLC7A5 過表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染卵巢顆粒細胞。見圖2。

2. 3 2 組 卵 巢 顆 粒 細 胞 凋 亡 率 與 對 照 組（16. 59%±1. 96%） 比較， OE-SLC7A5 組細胞凋亡率（50. 07%±6. 66%） 明顯升高（Plt;0. 05）。見圖3。

2. 4 2組不同細胞周期卵巢顆粒細胞百分率 與對照組（11. 94%±0. 02%） 比較，OE-SLC7A5 組S 期卵巢顆粒細胞百分率（10. 17%±0. 53%） 明顯降低（Plt;0. 05）。見圖4。

2. 5 2 組卵巢顆粒細胞中凋亡相關(guān)基因 mRNA表 達水平 與對照組比較，OE-SLC7A5 組卵巢顆粒細胞中凋亡相關(guān)基因TNF- α、Caspase-3 和Caspase-8 mRNA 表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）。見表1。

2. 6 2組卵巢顆粒細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達水平 與對照組比較，OE-SLC7A5 組卵巢顆粒細胞中凋 亡 相 關(guān) 蛋 白 TNF- α、 Caspase-8、 cleavedCaspase-8、Caspase-3、cleaved Caspase-3 和SLC7A5 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）。見圖5 和表2。

3 討 論

本課題組前期研究［13］ 結(jié)果顯示： 大鼠PCOS模型卵巢中SLC7A5 表達明顯增加，提示SLC7A5可能在PCOS 發(fā)生發(fā)展中具有重要作用， 然而SLC7A5 在卵巢中的相關(guān)作用尚未完全闡明。因此，本研究通過一系列體外實驗探討過表達SLC7A5 對卵巢顆粒細胞凋亡的影響。

細胞凋亡不僅參與調(diào)節(jié)和選擇人類原始卵泡池中的卵子，也被認為是卵泡閉鎖的機制和人卵巢中卵泡周期性生長及消退的基礎(chǔ)［14-15］。在卵泡發(fā)育的早期階段，閉鎖是由卵母細胞和周圍顆粒細胞凋亡共同引起的。而成熟卵泡的閉鎖則以顆粒細胞凋亡為主［16］。研究［17-18］ 顯示：顆粒細胞的異常凋亡可能是PCOS 中卵泡異常發(fā)育的原因之一。因此，本研究采用流式細胞術(shù)檢測過表達SLC7A5 對顆粒細胞凋亡及細胞周期的影響，結(jié)果顯示：過表達SLC7A5 能夠促進顆粒細胞凋亡。因此，SLC7A5可能通過影響顆粒細胞的凋亡，影響卵泡發(fā)育和成熟障礙，進而促進PCOS 的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示：過表達SLC7A5 后，顆粒細胞中凋亡相關(guān)基因TNF-α、Caspase-3 和Caspase-8mRNA 及蛋白表達水平均明顯升高。研究［19-20］ 顯示： TNF-α 參與調(diào)節(jié)卵巢的多種生理過程， 對細胞增殖、分化、卵泡成熟、類固醇生成和細胞凋亡均有一定的影響。一般情況下，細胞凋亡是通過死亡受體和線粒體2 種介導方式實現(xiàn)的［21］。研究［22-23］發(fā)現(xiàn)：TNF-α 可以通過死亡受體途徑促進細胞凋亡。當TNF-α 表達和生成增加時，TNF-α 受體與腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白結(jié)合， 激活下游的Caspase-8， 觸發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)， 進而激活其下游的凋亡因子Caspase-3［24-25］。激活的Caspase-3 能夠活化內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，阻礙細胞DNA 修復(fù)并啟動受損的DNA 降解， 誘導細胞凋亡［26］。因此，顆粒細胞過表達SLC7A5 可能通過激活TNF- α/Caspase-8/Caspase-3 凋亡通路促進顆粒細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示： cleaved Caspase-8 和 cleavedCaspase-3 蛋白表達水平均明顯升高，進一步證實了SLC7A5 通過激活Caspase-8 和Caspase-3 促進細胞凋亡。研究［27-28］ 顯示： Fas/Fas 配體/Caspase-8 通路在DHEA 誘導的PCOS 大鼠卵巢閉鎖卵泡內(nèi)的顆粒細胞凋亡中起關(guān)鍵作用。LIU 等［29］ 發(fā)現(xiàn)：PCOS患者顆粒細胞凋亡明顯增加，并伴有Caspase-3 表達增加，與本研究結(jié)果相似。

綜上所述，SLC7A5 蛋白表達增加可能通過上調(diào)TNF- α、Caspase-8 和Caspase-3 凋亡通路表達，促進顆粒細胞的凋亡， 本研究結(jié)果為SLC7A5 在PCOS 中病理機制的探討提供了新的理論依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：張京順參與實驗操作和論文撰寫，鄒穎剛參與數(shù)據(jù)整理和分析，鄭連文參與論文審閱和修改。

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