異葒草素對(duì)2型糖尿病肺小動(dòng)脈的作用及其機(jī)制

［摘要］ 目的 探討異葒草素（ISO）對(duì)2型糖尿?。═2DM）肺小動(dòng)脈的保護(hù)作用及其機(jī)制。

方法 將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組給予高脂飼料及鏈脲佐菌素干預(yù)建立T2DM小鼠模型，喂養(yǎng)2月后將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組及低、中、高ISO治療組，各10只。低、中、高ISO治療組小鼠每天分別腹腔注射10、20、40 mg/kg的ISO，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組腹腔注射等量5 g/L羧甲基纖維素鈉，期間觀察各組小鼠的一般情況、體質(zhì)量、血糖改變。注射8周后處死小鼠，取肺組織，分別應(yīng)用蘇木精-伊紅染色、Masson染色觀察肺組織及肺小動(dòng)脈改變，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定肺組織白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及血管緊張素受體2（ACE2）mRNA表達(dá)，ELISA法檢測(cè)晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）水平，Western Blot方法檢測(cè)c-Jun氨基末端激酶（JNK）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）及其磷酸化蛋白水平。

結(jié)果 與模型對(duì)照組相比，低、中、高ISO治療組小鼠空腹血糖降低（F=30.009，Plt;0.001），體質(zhì)量增加（F=63.149，Plt;0.001）；肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺小動(dòng)脈增厚、膠原纖維增多、小動(dòng)脈管腔變窄均明顯改善；肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)下降（H=26.791～30.254，Plt;0.001），AGEs含量減少（F=12.482，Plt;0.01）；血管內(nèi)皮損傷指標(biāo)VEGF、ET-1 mRNA表達(dá)下降，ACE2 mRNA表達(dá)升高（F=6.994～37.569，Plt;0.05）；JNK、ERK1/2磷酸化水平下降（F=3.890、6.518，Plt;0.01）。

結(jié)論 ISO可以通過降低血糖、抑制炎性反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抑制JNK和ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)抗T2DM肺小動(dòng)脈病變。

［關(guān)鍵詞］ 異葒草素；糖尿病，2型；肺動(dòng)脈

［中圖分類號(hào)］ R284；R587.1

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096-5532（2024）06-0791-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.196

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20250107.1910.006;2025-01-08 13：57：10

Protective effect of isoorientin on pulmonary arterioles in type 2 diabetes mellitus and its mechanism

HAN Lin， CHE Kui， CHI Jingwei， WANG Yangang

（Department of Endocrinology and Metabolism， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003，China）

［Abstract］ Objective To investigate the protective effect of isoorientin （ISO） on pulmonary arterioles in type 2 diabetes mellitus （T2DM） and its mechanism.

Methods "Mice were randomly divided into normal group and experimental group. The mice in the experimental group were given high-fat diet and streptozotocin to establish a mouse model of T2DM， and after 2 months of feeding， the mice were randomly divided into model control group and low-， middle-，and high-dose ISO treatment groups， with 10 mice in each group. The mice in the low-， middle-， and high-dose ISO treatment groups were given intraperitoneal injection of ISO at a dose of 10， 20， and 40 mg/kg， respectively， every day， while those in the normal group and the model control group were given intraperitoneal injection of an equal volume of 5 g/L sodium carboxymethyl cellulose， and the mice in all groups were observed in terms of the changes in general status， body weight and blood glucose. The mice were sacrificed after 8 weeks of injection， and lung tissue was collected; HE staining and Masson staining were used to observe the changes in lung tissue and pulmonary arterioles; quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， endothelin-1 （ET-1）， vascular endothelial growth factor （VEGF）， and angiotensin receptor 2 （ACE2） in lung tissue; ELISA was used to measure the levels of advanced glycation end products （AGEs）; Western Blot was used to measure the levels of c-Jun N-terminal kinase （JNK）， extracellular signal-regulated kinase 1/2 （ERK1/2）， and their phosphorylated proteins.

Results "Compared with the model control group， the low-， middle-， and high-dose ISO treatment groups had a significant reduction in fasting blood glucose （F=30.009，Plt;0.001）， a significant increase in body weight （F=63.149，Plt;0.001）， significant increases in pulmonary inflammatory infiltration， thickness of pulmonary arterioles， and collagen fibers， and a significant improvement in the narrowing of arterioles; there were also significant reductions in the mRNA expression levels of IL-1β， IL-6， and TNF-α in lung tissue （H=26.791-30.254，Plt;0.001） and a significant reduction in the content of AGEs （F=12.482，Plt;0.01）; as for the indicators for vascular endothelial injury， there were significant reductions in the mRNA expression levelsof VEGF and ET-1 and a significant increase in the mRNA expres-sion level of ACE2 （F=6.994-37.569，Plt;0.05）， as well as significant reductions in the phosphorylation levels of JNK and ERK1/2 （F=3.890，6.518;Plt;0.01）.

Conclusion ISO can exert a protective effect against pulmonary arteriole lesions by reducing blood glucose， inhibiting inflammatory response， alleviating oxidative stress and vascular endothelial cell damage， and inhi-biting the JNK and ERK1/2 signal transduction pathways.

［Key words］ isoorientin; diabetes mellitus， type 2; pulmonary artery

我國(guó)2型糖尿?。═2DM）患病率已經(jīng)上升至11.2%^[1]，目前對(duì)其研究集中于糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變、周圍神經(jīng)病變等，而對(duì)糖尿病靶器官肺的研究較少。2019年全球爆發(fā)了新型冠狀病毒肺炎，該病在糖尿病病人中發(fā)病率高、易轉(zhuǎn)為重癥、住院時(shí)間長(zhǎng)，且死亡風(fēng)險(xiǎn)高^[2]。僅僅將其原因考慮為糖尿病病人容易感染是片面的，探究糖尿病肺組織及血管改變的病理機(jī)制并進(jìn)行有效干預(yù)具有重要的意義。異葒草素（ISO）是一種黃酮類化合物，它具有改善糖尿病相關(guān)指標(biāo)、抑制炎性反應(yīng)、抵抗氧化應(yīng)激等作用^[3-4]。本研究建立T2DM小鼠模型，給予ISO干預(yù)，觀察其對(duì)T2DM小鼠肺組織及小動(dòng)脈病變的影響及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)4～5周雄性C57BL/6Cnc小鼠50只，體質(zhì)量（25±3）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。ISO（純度gt;98%），購(gòu)自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司；c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）、GAPDH抗體及兔二抗均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理

小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（10只）和實(shí)驗(yàn)組（40只），實(shí)驗(yàn)組小鼠使用高脂飼料喂養(yǎng)4周后，連續(xù)腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，30 mg/kg）5次，1周后測(cè)隨機(jī)血糖，隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L為小鼠T2DM模型造模成功^[5]。繼續(xù)喂養(yǎng)小鼠2月，將造模成功的糖尿病小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、ISO低劑量組（10 mg/kg）、ISO中劑量組（20 mg/kg）、ISO高劑量組（40 mg/kg），各10只。ISO各劑量組分別腹腔注射相應(yīng)劑量ISO，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組每天腹腔注射等量5 g/L羧甲基纖維素鈉。給藥8周后，處死小鼠，取出小鼠雙肺備用。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般情況及體質(zhì)量 每周觀察各組小鼠精

神是否飽滿，行為活動(dòng)是否敏捷，飲水、進(jìn)食、尿量等。各組小鼠排空小便，空腹，應(yīng)用電子分析天平稱體質(zhì)量。

1.3.2 空腹血糖（FBG） 應(yīng)用羅氏血糖儀檢測(cè)小鼠FBG。

1.3.3 蘇木精-伊紅（HE）染色 取小鼠右上肺，固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。

1.3.4 Masson染色 肺組織切片，依次行Weigert鐵蘇木素染色液染色、Masson藍(lán)化液返藍(lán)、麗春紅品紅染色液染色、磷鉬酸溶液弱酸處理、苯胺藍(lán)染色液染色，再經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，自然晾干，封片，顯微鏡下觀察。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測(cè)炎性因子及血管內(nèi)皮損傷指標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平 應(yīng)用TRIzol法提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用熒光定量PCR儀檢測(cè)各組肺組織白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及血管緊張素受體2（ACE2）mRNA水平，以管家基因（β-actin）為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，采用2^-△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物由華大基因公司合成。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。引物及其序列見表1。

1.3.6 ELISA方法檢測(cè)肺組織晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs） 取新鮮肺組織，超聲破碎，離心取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)AGEs濃度，根據(jù)說明書方法進(jìn)行操作。

1.3.7 Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 取小鼠肺組織約50 mg，剪碎，與RIPA蛋白裂解液混勻，超聲充分裂解、勻漿。低溫離心，取上清用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。以每孔30μL上樣，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯色等操作，應(yīng)用生物分子成像儀成像，以GAPDH蛋白條帶灰度值為參照，應(yīng)用Image J軟件分析JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以±s形式表示，若方差齊多組間比較采用單因素ANOVA檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD法；若方差不齊多組間比較應(yīng)用Kruskal Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonferroni法。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 各組一般情況及FBG、體質(zhì)量比較正常對(duì)照組小鼠飲水、進(jìn)食正常，精神良好，活動(dòng)敏捷，體質(zhì)量呈穩(wěn)定增長(zhǎng)；模型對(duì)照組小鼠注射STZ后出現(xiàn)明顯多尿、多飲癥狀，體質(zhì)量不增或下降，并伴有不同程度的精神萎靡、活動(dòng)量減少；ISO治療組小鼠一般情況介于正常對(duì)照組和模型對(duì)照組之間。5組小鼠FBG、體質(zhì)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.009、63.149，Plt;0.001）。兩兩比較結(jié)果顯示：模型對(duì)照組小鼠的FBG顯著高于正常對(duì)照組（Plt;0.001），ISO低、中、高劑量組小鼠FBG較模型對(duì)照組均顯著降低（Plt;0.001）；模型對(duì)照組體質(zhì)量明顯低于正常對(duì)照組（Plt;0.001），ISO低、中、高劑量組小鼠體質(zhì)量均高于模型對(duì)照組（Plt;0.01）。見表2。

2.2 各組肺組織及小動(dòng)脈變化比較

HE染色觀察顯示，正常對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡隔較??；模型對(duì)照組小鼠肺泡腔縮小，肺泡隔增厚，周圍有大量炎性細(xì)胞。Masson染色觀察顯示，模型對(duì)照組小鼠血管壁增厚，管腔變窄，藍(lán)色的膠原纖維明顯，周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。ISO低、中、高劑量治療組較模型對(duì)照組肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺小動(dòng)脈增厚、膠原纖維增多、小動(dòng)脈管腔變窄均明顯改善（圖1、2）。

2.3 各組肺組織炎性因子及血管內(nèi)皮損傷指標(biāo)mRNA表達(dá)比較

本文5組小鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=26.791～30.254，Plt;0.001）。兩兩比較顯示：模型對(duì)照組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組（Plt;0.01）；ISO低、中、高劑量組小鼠的IL-1β、IL-6 mRNA均低于模型對(duì)照組（Plt;0.05）；ISO低、中劑量組的TNF-α的mRNA低于模型對(duì)照組（Plt;0.05），ISO高劑量組與模型對(duì)照組對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.147）。5組小鼠肺組織的血管內(nèi)皮損傷指標(biāo)VEGF、ET-1、ACE2 mRNA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.994～37.569，Plt;0.05）。兩兩比較顯示：模型對(duì)照組小鼠肺組織中VEGF、ET-1的mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組高（Plt;0.05）；ISO低、中、高劑量組的VEGF、ET-1 mRNA表達(dá)低于模型對(duì)照組（Plt;0.05）；模型對(duì)照組的ACE2 mRNA表達(dá)低于正常對(duì)照組（Plt;0.05），ISO中劑量組、高劑量組高于模型對(duì)照組（Plt;0.05），ISO低劑量組與模型對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.134）。見表3、4。

2.4 各組肺組織AGEs含量比較

正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、ISO低劑量組、ISO中劑量組、ISO高劑量組小鼠肺組織中AGEs的含量分別為（2 570.294±890.348）、（8 139.142±2 449.857）、（4 115.741±2 268.536）、（4 641.408±2 091.336）、（3 707.224±1 176.283）μg/L，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.482，Plt;0.01），其中模型對(duì)照組較正常對(duì)照組高（Plt;0.01），ISO低、中、高劑量組低于模型對(duì)照組（Plt;0.01）。

2.5 各組JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2水平比較

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，各組小鼠肺組織中JNK、ERK1/2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.890、6.518，Plt;0.01），其中模型對(duì)照組較正常對(duì)照組高（Plt;0.05），ISO低、中、高劑量組低于模型對(duì)照組（Plt;0.05）。見圖3、表5。

3 討" 論

雖然越來越多的證據(jù)表明，糖尿病與肺部病變有關(guān)^[6]，但對(duì)肺小動(dòng)脈病變的研究較少。ISO對(duì)糖尿病腎病^[7]、糖尿病合并非酒精性脂肪肝^[8]均有改善作用。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建小鼠T2DM模型，觀察其肺小動(dòng)脈病變情況；應(yīng)用ISO干預(yù)，檢測(cè)FBG、IL-1β、IL-6、TNF-α、AGEs、ET-1、VEGF、ACE2、JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2等指標(biāo)變化。結(jié)果顯示，T2DM小鼠存在肺小動(dòng)脈病變，ISO通過降低血糖、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等途徑作用于JNK、ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而改善肺小動(dòng)脈病變。

高糖血癥是小動(dòng)脈病變的危險(xiǎn)因素，它可以直接或間接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，促使炎癥反應(yīng)的發(fā)生。此外，高糖血癥還會(huì)引起氧化應(yīng)激、AGEs生成增加等，進(jìn)一步誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡^[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T2DM模型小鼠肺小動(dòng)脈周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，F(xiàn)BG和肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)以及AGEs含量較高；ISO干預(yù)后，上述指標(biāo)均有改善。表明ISO可以降低T2DM模型小鼠血糖、減輕炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激。

ET-1是體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的特異性標(biāo)志物，VEGF能夠促進(jìn)新血管形成^[10]，ACE2通過降解Ang Ⅱ來保護(hù)血管^[11]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠VEGF、ET-1表達(dá)升高，ACE2表達(dá)下降，表明模型對(duì)照組小鼠肺小動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞受到了損傷；ISO干預(yù)后，上述指標(biāo)有所改善，提示ISO對(duì)T2DM小鼠肺小動(dòng)脈具有保護(hù)作用。

《2型糖尿病患者泛血管疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與管理中國(guó)專家共識(shí)（2022版）》指出，糖尿病微血管病變可能與MAPKs通路相關(guān)^[12]。JNK和ERK1/2作為MAPKs通路的兩個(gè)重要分支，分別在炎癥、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等過程中發(fā)揮重要作用。IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子增加，VEGF與受體結(jié)合，AGEs的堆積，均能激活JNK通路，使肺小動(dòng)脈產(chǎn)生系列應(yīng)答反應(yīng)，致使血管內(nèi)皮受損、重構(gòu)。AGEs累積及ET-1、VEGF與其受體結(jié)合均可激活ERK1/2通路，磷酸化的蛋白介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移，在小動(dòng)脈病變中起到重要作用^[13]。另外，ACE2不僅可以通過下調(diào)ERK1/2的磷酸化水平而抑制平滑肌增殖^[14]，還可以抑制氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)而改善血管內(nèi)皮功能障礙^[15]。所以，高糖環(huán)境下炎癥因子、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮血管損傷等因素并非獨(dú)立存在，而是相互影響、共同作用于JNK、ERK1/2信號(hào)通路，參與T2DM肺小動(dòng)脈的病變。

綜上所述，T2DM小鼠存在肺小動(dòng)脈病變，ISO可以對(duì)抗T2DM小鼠肺小動(dòng)脈病變的發(fā)生，其機(jī)制為降低血糖、抑制炎性反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激、減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及抑制JNK、ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活等。本文結(jié)果為T2DM肺小動(dòng)脈病變的防治提供了新思路。本實(shí)驗(yàn)中低、中、高劑量ISO對(duì)相關(guān)指標(biāo)的作用并不呈劑量依賴性，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）