基于二維鈷基納米酶的比率型比色傳感器檢測亞硝酸鹽

摘要 基于二維鈷基納米酶（D-ZIF-67）的類氧化酶活性開發(fā)了一種比率型比色傳感器用于亞硝酸鹽的靈敏檢測。采用一步沉淀法制得D-ZIF-67，利用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）等方法對其結(jié)構(gòu)及形貌進行了表征。D-ZIF-67 可將無色的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）催化氧化為藍色氧化產(chǎn)物（oxTMB），在652 nm 處有明顯的吸收峰；當亞硝酸鹽存在時， oxTMB 被進一步氧化和重氮化，呈現(xiàn)黃色，導(dǎo)致溶液在652 nm處的吸光度（A652）降低， 450 nm處的吸光度（A450）增大，其比率信號（A652/450）與亞硝酸鹽濃度的對數(shù)值呈線性關(guān)系，基于此實現(xiàn)了亞硝酸鹽的靈敏檢測。在最優(yōu)條件下，亞硝酸鹽的線性檢測范圍為3～300 μmol/L，檢出限（S/N=3）為0.08 μmol/L。與傳統(tǒng)單信號方法相比，比率型比色模式具有更好的抗干擾性。將本方法應(yīng)用于香腸和咸鴨蛋中亞硝酸鹽的檢測，加標回收率為97.7%～104.1%。

關(guān)鍵詞 硝酸鈷；比色檢測；納米酶；類氧化物酶；亞硝酸鹽

亞硝酸鹽（Nitrite）作為一種食品添加劑可改善肉制品的顏色和風味[1]，并抑制肉毒桿菌等微生物的生長[2-3]。然而，人體攝入過量的亞硝酸鹽會導(dǎo)致NO2?與血紅蛋白結(jié)合引發(fā)高鐵血紅蛋白血癥[4]，在胃酸環(huán)境下亞硝酸鹽還可與食品中的仲胺和酰胺反應(yīng)生成致癌物亞硝胺，從而引發(fā)食道癌和胃癌等多種癌癥[5-6]。食品添加劑聯(lián)合專家委員會（JECFA）建議亞硝酸鹽的每日可接受攝入量（ADI）為0.07 mg/kg[7]；我國食品添加劑使用標準規(guī)定在肉灌腸類和醬鹵肉制品等食品中亞硝酸鹽的最大添加量不超過1.5 g/kg，最大殘留量不超過30 mg/kg[8]。因此，開發(fā)簡單、快速和準確的亞硝酸鹽檢測方法具有重要意義。

亞硝酸鹽的傳統(tǒng)檢測方法有色譜法[9]、毛細管電泳法[10]、電化學法[11]和熒光法[12]等，這些檢測方法需要精密的儀器、專業(yè)的操作人員和復(fù)雜耗時的操作流程，難以應(yīng)用于亞硝酸鹽的現(xiàn)場快速檢測。比色法通過比較有色物質(zhì)溶液顏色深度確定待測組分含量，具有簡便、快速、成本低、靈敏度高和可視化等優(yōu)點[13-14]。比率型比色傳感器能夠克服實際檢測過程中樣品基質(zhì)和檢測環(huán)境的干擾[15]，確保檢測結(jié)果的準確性，是亞硝酸鹽現(xiàn)場檢測的理想選擇。

納米酶是具有類酶活性的納米材料[16-17]，基于納米酶構(gòu)建的生物傳感器[18]已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學[19]、環(huán)境監(jiān)測[20]和食品安全[21]等領(lǐng)域。鈷基納米酶具有獨特的催化活性[22]和穩(wěn)定性，在光學分析[23]、電催化和生物催化[24]等領(lǐng)域備受關(guān)注。二維鈷基納米酶（D-ZIF-67）具有獨特的二維結(jié)構(gòu)，其金屬活性位點大量分散在表面，因此具有高于常見納米酶的類氧化酶活性[25]。同時， D-ZIF-67 具有合成簡便和催化活性穩(wěn)定等優(yōu)點，適用于食品中有害物質(zhì)的快速檢測。盡管D-ZIF-67 的類氧化酶活性已被證實，但基于D-ZIF-67 的類氧化酶活性構(gòu)建的亞硝酸鹽比色傳感檢測平臺尚未見報道。

本研究以硝酸鈷和二甲基咪唑為前驅(qū)體，采用一步沉淀法制備了具有二維結(jié)構(gòu)的D-ZIF-67，并基于D-ZIF-67 的類氧化酶活性建立了亞硝酸鹽的比率型比色檢測方法（圖1）。D-ZIF-67 可催化氧化3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）生成藍色的氧化產(chǎn)物（oxTMB），在652 nm 處產(chǎn)生吸收峰；當亞硝酸鹽存在時，oxTMB 被重氮化而呈現(xiàn)黃色，使溶液在652 nm 處的吸光度（A652）降低，并在450 nm 處出現(xiàn)新吸收峰。隨著亞硝酸鹽濃度增加，溶液的A652 降低而450 nm 處吸光度（A450）增大，導(dǎo)致652 nm 和450 nm 處吸光度的比率信號（A652/450）降低，基于A652/450 與亞硝酸鹽濃度的線性關(guān)系，實現(xiàn)了亞硝酸鹽的精準檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-2700 型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；Nicolet6700 傅里葉變換紅外光譜儀（美國尼高力公司）；Thermo escalab 250XI X 射線光電子能譜儀（美國熱電公司）；SU8020 場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；JEM 2100 場發(fā)射透射電子顯微鏡（日本JEOL 公司）；TG16 高速離心機（上海盧湘儀離心機有限公司）；Smart-S15UVF 純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）。

TMB 和二甲基咪唑購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸鈉、抗壞血酸和亞硝酸鈉購于上海麥克林生化科技有限公司；Co（NO3）2·6H2O 購于上海易恩化學技術(shù)有限公司；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和乙酸購于天津市永大化學試劑有限公司。實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 二維納米片鈷基金屬有機框架（D-ZIF-67）的合成

參考文獻[26]的方法并稍作修改制備D-ZIF-67。稱取0.328 g二甲基咪唑和0.291 g Co（NO3）2·6H2O，分別溶解在30 mL 50%（V/V）DMF 溶液中。兩種溶液超聲30 min 后，將Co（NO3）2·6H2O 溶液快速加入二甲基咪唑溶液中混合。將混合物劇烈攪拌1 min，然后在室溫下靜置陳化12 h。收集沉淀，用DMF 和超純水洗滌沉淀3 次，并在60 ℃烘箱中干燥過夜，得到D-ZIF-67。

1.2.2 D-ZIF-67 的類氧化酶活性測定

以TMB 為底物對D-ZIF-67 的類氧化酶活性進行研究。在885 μL 0.2 mol/L 的NaAc-HAc 緩沖溶液（pH 4.0）中加入15 μL 2 mg/mL 的D-ZIF-67 分散液和100 μL 1 mmol/L 的TMB 溶液，混合均勻，在室溫下孵育5 min，采用紫外可見分光光度計進行檢測，比較反應(yīng)體系在652 nm 處的吸光度。

1.2.3 D-ZIF-67 的穩(wěn)態(tài)動力學分析

采用TMB 作為D-ZIF-67 動力學分析的底物。在885 μL 的NaAc-HAC 緩沖液中加入15 μL 2 mg/mL的D-ZIF-67 分散液和100 μL 不同濃度的TMB 溶液，采用紫外可見分光光度計檢測反應(yīng)前60 s 混合物在652 nm 處的吸光度變化，并根據(jù)Michaelis-Menten 方程計算催化反應(yīng)的動力學參數(shù)：

1/V0 = Km/Vmax（1/[S] + 1/Km） （1）

其中， V0 為初始反應(yīng)速度， Km 為米氏常數(shù)， Vmax 為最大反應(yīng)速度，[S]為底物濃度。

1.2.4 亞硝酸鹽的檢測

在835 μL NaAc-HAc 緩沖液中加入15 μL 2 mg/mL 的D-ZIF-67 分散液和100 μL 1 mmol/L TMB，將混合液在室溫下孵育10 min。加入50 μL 不同濃度的亞硝酸鹽標準溶液，在室溫下再孵育30 min，采用紫外可見分光光度計進行測定，計算不同濃度亞硝酸鹽存在時體系的A652/450 值。

1.2.5 實際樣品處理

香腸和咸鴨蛋購買于當?shù)厥袌?。將樣品切分? g 的小塊，加入8 mL 超純水并超聲處理2 h；離心，取上層清液，加入亞鐵氰化鉀溶液，混勻；靜置30 min 后加入醋酸鋅溶液，并攪拌30 min，將溶液用活性碳脫色；離心，使用0.45 和0.22 μm 濾膜去除雜質(zhì)和剩余脂肪，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 D-ZIF-67 材料的表征

不同的溶劑會影響金屬有機框架化合物的成核和生長[26]，通過掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM）對D-ZIF-67 的形貌進行表征，考察溶劑對金屬有機框架ZIF-67 的影響。由圖2A 可見，相較于甲醇溶液合成的正十二面體的ZIF-67，采用DMF 和超純水混合溶液合成的D-ZIF-67 呈現(xiàn)出二維納米花的結(jié)構(gòu)，TEM 結(jié)果（圖2B）進一步驗證了D-ZIF-67 的結(jié)構(gòu)為多層納米片堆疊，并且最終呈現(xiàn)出納米花的形態(tài)。這種二維結(jié)構(gòu)表明D-ZIF-67 具有更大的可負載底物的比表面積和更易接近的催化活性位點，從而賦予其優(yōu)異的類酶活性。

通過X-射線光電子能譜（XPS）進一步分析D-ZIF-67的元素組成及價態(tài)（圖2C），結(jié)果表明， D-ZIF-67包含C、N、O和Co等元素。對Co進行分峰處理， Co 2p軌道的XPS圖譜如圖2D所示，材料中的Co元素以Co2+和Co3+兩種價態(tài)共存，其中， 780.79 和796.57 eV 處的結(jié)合能峰分別對應(yīng)Co3+的Co 2p3/2 和Co 2p1/2，783.04 和798.83 eV 處的結(jié)合能峰分別對應(yīng)Co2+的Co 2p3/2 和Co 2p1/2。這表明帶有正電荷的D-ZIF-67有利于納米酶和催化底物的結(jié)合，同時多價態(tài)的金屬元素共存可以有效提高納米酶的電子轉(zhuǎn)移能力，提高納米酶的催化能力[27]。

采用紅外（FT-IR）光譜驗證了D-ZIF-67 表面官能團和配位聚合物的形成（圖2E），通過與二甲基咪唑的FT-IR 光譜對比發(fā)現(xiàn)，在2922 cm?1 處屬于咪唑脂肪族的C—H 和1846 cm?1 處的N—H 伸縮振動峰消失，這表明D-ZIF-67 配合物是由金屬鈷離子和二甲基咪唑配體配位形成。

2.2 D-ZIF-67 的類氧化酶活性研究

以TMB 為顯色底物，考察了D-ZIF-67 的類氧化酶活性。如圖3A 所示，單一的TMB 和D-ZIF-67 溶液體系的A625 值并沒有明顯變化，只有當TMB 和D-ZIF-67 同時存在時，混合溶液從無色變?yōu)樗{色，并且在652 nm 處有明顯的吸收峰，這表明制備的D-ZIF-67 具有優(yōu)異的類氧化酶活性。

氮氣實驗證明D-ZIF-67 在反應(yīng)體系中作為催化劑催化溶液中的溶解氧，而并非作為氧化劑直接氧化TMB。如圖3B 所示，經(jīng)過氮氣預(yù)處理的溶液的吸光度遠低于空氣飽和的混合溶液，表明催化過程依賴于溶液中的游離氧。為了進一步研究D-ZIF-67 類氧化酶活性的機理，以對苯醌（PBQ）、組氨酸（His）和硫脲（TU）作為·O2–、1O2 和·OH–自由基清除劑研究其對納米酶催化的影響。結(jié)果如圖3C 所示， PBQ 和TU 對納米酶的活性有明顯的抑制作用，而His 的抑制效果較差，這表明D-ZIF-67 在催化溶液中的游離氧時產(chǎn)生了·O2?自由基和·OH?自由基。

2.3 D-ZIF-67 的穩(wěn)態(tài)動力學研究

進一步探究了D-ZIF-67 的類氧化物酶活性，以TMB 為底物對D-ZIF-67 進行了穩(wěn)態(tài)動力學研究。保持其它反應(yīng)條件不變，通過改變底物TMB 的濃度，記錄不同濃度時體系在652 nm 處的吸光度變化。由圖4A 可知，隨著TMB 濃度逐漸上升，初始反應(yīng)速度逐漸增大，最后達到平臺期，趨勢符合Michaelis-Menten 的動力學模型，由圖4B 所示的雙倒數(shù)圖得出D-ZIF-67 作為類氧化酶催化TMB 時的Km 值。Km 是酶對底物的親和力指標， Km 值越低，表明該酶對底物的親和力越高。如表1 所示， D-ZIF-67 對TMB 的Km=0.03 mmol/L，明顯小于天然辣根過氧化物酶（HRP， Km=0.434 mmol/L）；同時， D-ZIF-67 的底物親和力也明顯高于其它同類納米酶。因為D-ZIF-67 具有大比表面積的二維結(jié)構(gòu)，使得大量的活性位點暴露，優(yōu)于大多數(shù)活性位點包埋在立體結(jié)構(gòu)中的3D 結(jié)構(gòu)。

2.4 比率型比色傳感器的檢測原理

將亞硝酸鹽加入到D-ZIF-67 和TMB 的反應(yīng)體系中，會使體系的A652 降低、A450 升高，溶液顏色由藍色變?yōu)榫G色（圖5A）。溶液顏色的變化是亞硝酸鹽與TMB 在酸性緩沖液中反應(yīng)的結(jié)果（圖5B）。在酸性環(huán)境中亞硝酸鹽是良好的氧化劑，能夠氧化TMB 分子；還可與TMB 絡(luò)合物中的伯胺基團發(fā)生重氮化反應(yīng)，生成重氮鹽。生成的重氮鹽不與其它試劑反應(yīng)形成偶氮復(fù)合物，而是在水性環(huán)境中進一步分解成重氮化的TMB 分子，重氮化的TMB 分子在溶液中呈現(xiàn)黃色，使溶液發(fā)生顏色變化，并在450 nm 處產(chǎn)生吸收峰[32]。向反應(yīng)體系中進一步加入抗壞血酸（AA）時，溶液由綠色變?yōu)辄S色，并且在652 nm 處的吸收峰消失， A450 略降（圖5C）。采用AA 作為還原劑，可將oxTMB 還原為無色的TMB。添加AA 后，體系在450 nm 處的吸收峰并未完全消失，表明過氧化的TMB 已經(jīng)被還原，而剩余的吸光度則歸因于TMB 和亞硝酸鹽發(fā)生的重氮化反應(yīng)。此實驗結(jié)果證明亞硝酸鹽和oxTMB 在酸性環(huán)境下發(fā)生重氮化反應(yīng)，可以提高檢測的靈敏度和選擇性，為亞硝酸鹽檢測提供了良好的方向。因此，采用D-ZIF-67 和TMB 的反應(yīng)體系可以建立用于亞硝酸鹽檢測的比率型比色傳感器，傳感器的紫外可見吸收光譜在652 和450 mn 處產(chǎn)生相反的變化，與單一信號相比，選擇A652/450 作為亞硝酸鹽的檢測信號可有效避免實際檢測過程中多種因素的干擾，提高傳感器的特異性、穩(wěn)定性和準確性。

2.5 檢測條件的優(yōu)化

為了提高D-ZIF-67 傳感器對亞硝酸鹽的靈敏度，對實驗條件進行了優(yōu)化，以存在和不存在亞硝酸鹽時傳感器A652/450 的差值（ΔA652/450）為指標，考察實驗條件的影響。如圖6A 所示， TMB 的濃度會影響傳感器的靈敏度， ΔA652/450 隨著TMB 濃度增加而逐漸增大，直到TMB 的濃度達到1 mmol/L 時， ΔA652/450 的增速變緩，因此選擇1.0 mmol/L 作為TMB 的最佳濃度。D-ZIF-67 濃度的影響如圖6B 所示， D-ZIF-67 濃度在0.02～0.03 mg/mL 范圍時， ΔA652/450 最大，因此選擇0.02 mg/mL 作為最佳D-ZIF-67 濃度。pH 值對傳感器的影響如圖6C 所示， ΔA652/450 在pH=3.6 時達到最大，這可能歸因于D-ZIF-67 在酸性條件下的催化活性較強且亞硝酸鹽在酸性條件下更易與TMB 發(fā)生重氮化反應(yīng)，因此選擇pH=3.6 為最佳pH 值。圖6D 和6E 展示了孵育時間對傳感器響應(yīng)的影響，最終選擇D-ZIF-67 和TMB 的最佳孵育時間為10 min，亞硝酸鹽和TMB 的最佳孵育時間為40 min。

2.6 比率型比色傳感器對亞硝酸鹽的傳感性能

在優(yōu)化的實驗條件下，考察了比率型比色傳感器的線性范圍和靈敏度。如圖7A 所示，在自然光下，當亞硝酸鹽的濃度由0 μmol/L 增至300 μmol/L 時，溶液顏色明顯地從藍色變?yōu)榫G色，然后變?yōu)辄S色；隨著亞硝酸鹽濃度增加，傳感器的A652 逐漸減小， A450 逐漸增大。在3～150 μmol/L 濃度范圍內(nèi)， A652/450 與亞硝酸鹽濃度的對數(shù)值具有良好的線性關(guān)系（圖7B），線性回歸方程為y= ?2.44x+5.7913 （R2=0.996），檢出限為0.08 μmol/L（S/N=3）。與已報道的亞硝酸鹽檢測方法相比（表2），本方法的靈敏度更高且檢出限相對較低。

2.7 傳感器的選擇性

在檢測體系中加入實際樣品中可能存在的干擾物質(zhì)，考察傳感器的選擇性。如圖8 所示，相較于空白對照，干擾物質(zhì)Na+、K+、Mg+、Ca2+、NO3?、Cl?、SO4?和CO3 2?對A652/450 沒有明顯的影響，表明本傳感器對常見的干擾離子具有良好的選擇性。

2.8 實際樣品分析

為考察本方法在實際樣品中的檢測能力，采用本方法測定了香腸和咸鴨蛋中的亞硝酸鹽含量，并與國標中的離子色譜法測定結(jié)果進行了對比，結(jié)果見表3。亞硝酸鹽的加標回收率為97.7%～104.1%，與離子色譜法的加標回收率相近，相對標準偏差（RSD）≤5.21%。上述結(jié)果表明，本方法可準確測定實際樣品中亞硝酸鹽的含量，具有良好的實用性。

3 結(jié)論

采用一步沉淀法制備的D-ZIF-67 具有優(yōu)異的類氧化酶活性，并基于D-ZIF-67 的類氧化酶活性構(gòu)建了用于亞硝酸鹽檢測的比率型比色傳感器。此傳感器對亞硝酸鹽的線性檢測范圍為3～260 μmol/L，檢出限為0.08 μmol/L。實際樣品中亞硝酸鹽的加標回收率為97.7%～104.1%，表明構(gòu)建的比率型比色傳感器在亞硝酸鹽檢測方面具有潛在的實際應(yīng)用價值，為未來構(gòu)建智能化便攜式的亞硝酸鹽檢測傳感設(shè)備提供了理論基礎(chǔ)。

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河北省重點研發(fā)計劃項目（No. 22325501D）資助。