基于雙重信號放大策略的生物傳感器用于汞離子的靈敏可視化檢測

摘要 重金屬汞對人類的生活環(huán)境和身體健康構成了嚴重威脅，因此，構建簡單靈敏的汞離子（Hg2+）檢測方法尤為重要。本研究結合催化發(fā)夾自組裝（CHA）和滾環(huán)擴增（RCA）兩種高效信號放大技術，構建了具有雙重信號放大功能的生物傳感器，用于Hg2+的高靈敏和高選擇性定量檢測。當目標物Hg2+存在時， DNA 輔助探針通過T-Hg2+-T 堿基錯配雜交引發(fā)CHA 反應（第一重信號放大），生成的DNA 雙鏈產物進一步引發(fā)RCA 反應，生成大量的G-四鏈體重復序列（第二重信號放大）。這種特殊的序列與氯化血紅素（Hemin）孵育后形成具有類辣根過氧化物酶活性的Hemin/G-四鏈體DNA 酶，可催化底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）發(fā)生氧化反應，使TMB 由無色變成藍色。由于結合了兩種高效的信號放大策略，采用紫外-可見吸收光譜法可實現(xiàn)Hg2+的高靈敏定量檢測，檢出限（LOD， 3σ）低至0.21 nmol/L。同時，通過裸眼觀測溶液的顏色變化，可實現(xiàn)濃度為1 nmol/L 的Hg2+的可視化檢測。此傳感器具有優(yōu)異的選擇性，可用于復雜水樣中Hg2+的檢測，為重金屬污染物的檢測提供了簡單靈敏的分析平臺，在環(huán)境監(jiān)測領域具有潛在的應用價值。

關鍵詞 催化發(fā)夾自組裝；滾環(huán)擴增；生物傳感器；可視化檢測；汞離子

隨著工業(yè)和經濟的高速發(fā)展，重金屬污染的問題變得日益嚴重[1]。常見的強毒性重金屬污染物有鉛、鎘、砷和汞等。這些重金屬主要通過食物鏈及生活用品等廣泛存在于人類生活中，對生態(tài)環(huán)境和人體健康構成了嚴重的威脅[2-3]。其中，汞離子（Hg2+）具有持久性、易遷移性、高生物毒性、強生物富集性及不可自然降解等性質，進入人體后與蛋白質或酶結合，在重要的組織和器官中積累，導致細胞功能異常，引發(fā)腦損傷、腎功能衰竭和消化系統(tǒng)損傷等多種疾病[4-6]。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的規(guī)定，飲用水中Hg2+的最高允許濃度為30 nmol/L[7]。目前，用于檢測Hg2+的方法有氣相色譜法、原子吸收光譜法、熒光光譜法和電感耦合等離子體質譜法等[8-10]。這些方法雖然大多能檢測nmol/L 級的Hg2+，滿足對飲用水中Hg2+的檢測需求，但所需的儀器設備昂貴、樣品預處理繁瑣耗時、操作要求高[11-14]，限制了這些方法在偏遠和不發(fā)達地區(qū)的應用。因此，開發(fā)一種簡單且靈敏度高的Hg2+檢測方法尤為重要。

研究表明， Hg2+可與胸腺嘧啶（T）通過N-Hg共價鍵特異性結合，形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T配位化合物[15-16]。T-Hg2+-T 錯配雜交結構的結合常數(shù)大于天然的A-T 堿基對，因此具有很強的穩(wěn)定性和特異性[17]?；谠撛聿⒔Y合生物傳感技術，研究者已構建了許多檢測Hg2+的生物傳感器，如電化學生物傳感器、熒光生物傳感器、比色生物傳感器及表面等離子體共振生物傳感器等[18-20]。其中，比色傳感器所需檢測儀器價格低、構建簡單、檢測方便，并且可實現(xiàn)可視化檢測，因此備受關注[21-23]。但是，比色傳感器的檢測靈敏度一般都較低，因此常需引入高效的信號放大策略，以實現(xiàn)對Hg2+的靈敏檢測。

2008 年， Pierce 課題組[24]基于Toehold-介導的鏈置換反應提出了催化發(fā)夾自組裝（Catalyzed hairpinassembly， CHA）反應原理。在該反應中， DNA 或RNA 引發(fā)鏈可催化兩個亞穩(wěn)態(tài)的DNA 發(fā)夾探針自組裝形成雙鏈體，并將引發(fā)鏈置換出來參與循環(huán)催化反應。該反應過程均在等溫條件下進行，一條引發(fā)鏈可多次催化發(fā)夾探針發(fā)生自組裝，得到大量的由兩個發(fā)夾型探針自組裝形成的雙鏈結構，從而達到信號放大的目的。CHA 反應已被廣泛應用于痕量生物分子的檢測。滾環(huán)擴增（Rolling circle amplification，RCA）反應是將環(huán)狀DNA 作為模板，通過一個與環(huán)狀DNA 互補的單鏈DNA 或RNA 作為引物，在聚合酶的作用下，加入脫氧核糖核酸混合物（dNTPs）可產生長單鏈DNA，此DNA 鏈可擁有無數(shù)多個重復的且可與模板DNA 互補的核酸片段[25]。RCA 可有效放大痕量靶標物的信號，在多種生物分子的檢測過程中顯示出巨大的應用潛力。若結合以上兩種高效的信號放大策略，構建具有雙重信號放大能力的傳感器，可望實現(xiàn)對痕量重金屬污染物Hg2+的高靈敏檢測。

基于此，結合CHA 和RCA 這兩種高效的信號放大技術，本研究構建了具有雙重信號放大功能的生物傳感器，實現(xiàn)了對重金屬污染物Hg2+的高靈敏定量檢測。當Hg2+存在時，輔助探針通過T-Hg2+-T 錯配雜交觸發(fā)CHA 反應，使Hg2+被不斷釋放出來并參與循環(huán)反應，實現(xiàn)第一重信號放大，得到大量可引發(fā)下一步RCA 反應的DNA 雙鏈結構；生成的DNA 雙鏈結構與環(huán)狀DNA 模板雜交，并引發(fā)RCA 反應，產生大量的G-四鏈體重復序列，實現(xiàn)第二重信號放大。大量的G-四鏈體可與氯化血紅素（Hemin）結合，形成Hemin/G-四鏈體復合物，該復合物具有類辣根過氧化物酶（HRP）活性[26]。Hemin/G-四鏈體DNA 酶可催化H2O2 氧化3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）生成氧化態(tài)的TMB，使得無色TMB 溶液變成藍色。加入H2SO4 終止反應后，溶液變成黃色。通過紫外-可見吸收光譜法可實現(xiàn)Hg2+的靈敏定量分析；此外，通過裸眼觀測溶液的顏色，可實現(xiàn)Hg2+的可視化檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-1800 型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；AKRY-UP-1824 型艾柯超純水機（成都康寧實驗專用純水設備廠）；ME104E 型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；pH-2602 型酸度計（杭州陸恒生物科技有限公司）。

T4 DNA 連接酶、Phi29 DNA 聚合酶（phi29）、脫氧核糖核酸混合物（dNTP）、核酸外切酶Ⅰ（Exo-Ⅰ）、核酸外切酶Ⅲ（Exo-Ⅲ）由上海碧云天生物技術公司提供；3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽（TMB·2HCl）、Hemin、H2O2、二硫蘇糖醇（DTT）、H2SO4、三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）、曲拉通X-100（Triton X-100）、二甲基亞砜（DMSO）和HgNO3 購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所用試劑均為分析純，核酸序列均由上海生物工程股份有限公司合成，其DNA 序列見表1。汞離子儲備液由HgNO3 配制。Tris-HCl 緩沖溶液（50 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L DTT，20 mmol/L MgCl2， pH 7.5）；HEPES 緩沖溶液（50 mmol/L HEPES， 40 mmol/L KCl， 400 mmol/L NaCl， 0.1%Triton X-100， 2% DMSO， PH 7.4）；10×T4 DNA 酶緩沖溶液（500 mmol/L Tris-HCl， 100 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT， 10 mmol/L ATP， pH 7.5），將10×T4 DNA 酶緩沖溶液稀釋10 倍獲得1×T4 DNA 酶緩沖溶液。實驗用水為超純水（電阻≥18.2 MΩ?cm）。

1.2 環(huán)狀DNA 模板的制備

將cDNA（10 μL， 100 μmol/L）和LP（50 μL， 100 μmol/L）于95 ℃加熱5 min，緩慢降至室溫；加入T4連接酶（10 μL， 2 U/μL）和1×T4 DNA 酶緩沖溶液（10 μL），孵育過夜，使DNA 末端連接在一起，形成環(huán)狀DNA 模板。將上述反應液在65 ℃下加熱10 min，使T4 連接酶失活；加入Exo-Ⅰ（10 μL， 10 U/μL）和Exo-Ⅲ（10 μL， 10 U/μL），使反應溶液的最終體積為100 μL，于37 ℃孵育2 h，以降解LP 鏈。將上述混合溶液在80 ℃下加熱15 min，使加入的酶失活。將得到的環(huán)狀DNA 模板在4 ℃下保存，備用。

1.3 Hg2+ 的檢測

采用Tris-HCl 緩沖溶液稀釋核酸探針。首先將HP1（100 μL， 5 μmol/L）和HP2（100 μL， 5 μmol/L）探針分別退火，即在95 ℃下加熱5 min 后緩慢降至室溫以保證發(fā)夾結構的形成。將AP（ 1 μL，5 μmol/L）、HP1（1 μL， 5 μmol/L）、HP2（1 μL， 5 μmol/L）、cDNA（1 μL， 5 μmol/L）、phi29 聚合酶（5μL， 2 U/μL）和dNTP（1 μL， 50 mmol/L）與5 μL 不同濃度的Hg2+反應2 h，再加入5 μL Hemin（10 μmol/L）共同孵育30 min，得到Hemin/G-四鏈體DNA 酶。加入20 μL TMB 顯色液，室溫下反應30 min，加入10 μL H2SO4 溶液（10 mol/L）終止反應。反應結束后，先拍攝實驗所需的照片，再用HEPES 緩沖溶液將上述溶液稀釋至200 μL，采用UV-1800 型紫外-可見分光光度計測定溶液的紫外-可見吸收光譜。

2 結果與討論

2.1 傳感器的檢測原理

借助于T-Hg2+-T 錯配雜交結構以及目標物誘發(fā)的CHA 和RCA 雙重信號放大策略，構建了靈敏檢測Hg2+的生物傳感器，其原理如圖1 所示。傳感器包含了2 個DNA 發(fā)夾探針（HP1 和HP2）、1 個輔助探針（AP）以及1 個環(huán)狀DNA 模板探針（cDNA）。為防止無目標物Hg2+存在時RCA 反應自發(fā)發(fā)生，將引發(fā)RCA 反應的引物序列分成兩段，分別設計在HP1 和HP2 的末端，并在HP1 和AP 鏈的末端（綠色部分）設計了4 個胸腺嘧啶（T）。Hg2+不存在時， AP 探針無法與HP1 穩(wěn)定結合，并由于動力學阻礙， HP1 和HP2無法發(fā)生自組裝，因此不能與cDNA 雜交， RCA 反應無法發(fā)生。加入Hg2+后， Hg2+與AP 和HP1 上的胸腺嘧啶（T）特異性結合，形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T 配位化合物，觸發(fā)鏈置換反應，將HP1 打開，暴露出HP1 發(fā)夾型DNA 探針中黃色區(qū)域的DNA 片段。暴露出的黃色序列可與HP2 中的黃色序列雜交，引發(fā)第二個鏈置換反應，使得HP1 和HP2 組裝在一起，并釋放出AP 鏈和Hg2+。其中，釋放出的Hg2+又可在AP 鏈的協(xié)助下引發(fā)HP1 和HP2 之間的另一個新的CHA 循環(huán)反應，再次釋放出AP 鏈和Hg2+。如此循環(huán)反應，最終產生大量的HP1/HP2 的雙鏈DNA 結構，達到第一重信號放大的目的。并且，此時分離在HP1 和HP2 末端的RCA 反應的引發(fā)鏈被拉近了距離，緊密靠近在一起。隨后， HP1/HP2 雙鏈的末端與cDNA 雜交，在phi29 聚合酶及dNTP 存在下，引發(fā)RCA 放大反應，產生大量的G-四鏈體重復序列。在Hemin 存在下，G-四鏈體與Hemin 結合形成Hemin/G-四鏈體DNA 酶。Hemin/G-四鏈體DNA 酶具有類HRP 活性，可催化H2O2 將底物TMB 氧化成氧化態(tài)的TMB，使底物顏色由無色變成藍色，加入H2SO4 溶液終止反應后，溶液顏色變?yōu)辄S色。通過紫外-可見吸收光譜法可實現(xiàn)Hg2+的靈敏檢測。此外，通過裸眼觀測溶液的顏色，實現(xiàn)Hg2+的可視化檢測。

2.2 傳感器的可行性分析

通過一系列的對照實驗探究此傳感器的可行性。如圖2 所示， HP1 和cDNA 的混合液在450 nm 處出現(xiàn)了一個微弱的吸收峰（曲線a），這是由于Hemin 微弱的催化能力所致。將HP1、HP2 與cDNA 混合，不加入其它探針時，出現(xiàn)了微弱增強的信號（曲線b），這可能是由于HP1 和HP2 探針之間非特異性的自組裝所致。在上述溶液中加入AP 探針后， 450 nm 處吸收值沒有明顯變化（曲線c），說明目標物Hg2+不存在時， AP 探針不會與HP1 結合，因此不會引發(fā)HP1 和HP2 之間的自組裝，后續(xù)的一系列反應也不會發(fā)生。以上結果表明，在目標物Hg2+不存在時，所有的DNA 探針是可以穩(wěn)定共存的。將Hg2+（1 或5 nmol/L）與AP、HP1、HP2 和cDNA 一起孵育時，可觀察到450 nm 處吸收值顯著增加（曲線d 和曲線e），表明加入Hg2+后， Hg2+可觸發(fā)CHA 反應，進而引發(fā)RCA 放大反應，產生大量的Hemin/G-四鏈體DNA 酶， DNA 酶可催化H2O2 將TMB 氧化成氧化態(tài)的TMB，加入H2SO4 終止反應后，在450 nm 處的吸收值增加。由圖2A 可見，隨Hg2+濃度增加，在450 nm 處的吸收值也隨之增大。與對照實驗組相比，加入目標物后，溶液的顏色明顯加深，并且隨著目標物濃度增加，溶液的顏色也隨之加深（圖2B），此結果與紫外-可見吸收光譜法測定結果一致，表明本方法可以實現(xiàn)Hg2+的可視化檢測。

2.3 實驗條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的檢測性能，對Hemin 濃度及目標物誘發(fā)CHA 和RCA 雙重信號放大反應的時間進行了優(yōu)化。如圖3A 所示，當Hemin 的濃度從0.5 μmol/L 增至1.0 μmol/L 時， 450 nm 處的吸光度增加值（A?A0）逐漸增大；當Hemin 濃度為1.0 μmol/L 時， A?A0 最大；當Hemin 濃度超過1.0 μmol/L 后， A?A0逐漸降低。這是由于過高濃度的Hemin 會產生較大的背景信號，使A?A0 減小。因此，本研究選擇Hemin濃度為1.0 μmol/L。如圖3B 所示，隨著目標物誘發(fā)CHA 和RCA 雙重信號放大反應時間的延長， A?A0 逐漸增大，直至120 min 后達到了一個平臺，表明此時反應達到平衡狀態(tài)。因此，選擇本研究的最佳反應時間為120 min。

2.4 傳感器的檢測性能

在最優(yōu)實驗條件下，進一步探究了基于CHA 和RCA 雙重信號放大的傳感器的檢測性能。如圖4A所示，隨著Hg2+濃度由0.5 nmol/L 增大至10.0 nmol/L，在450 nm 處的吸光度逐漸增大，并且吸光度與目標物Hg2+的濃度呈良好的線性關系（圖4B），線性方程為A=0.0943C+0.1653（R2=0.9949， A 為吸光度， C 為Hg2+的濃度）。本方法的檢出限（LOD， 3σ， n=11）低至0.21 nmol/L。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的規(guī)定，飲用水中Hg2+的最高允許濃度為30 nmol/L[7]。因此，本研究構建的生物傳感器可滿足飲用水中Hg2+的檢測需求。此外，通過裸眼觀察不同濃度Hg2+所對應溶液顏色的變化可以發(fā)現(xiàn)，隨著Hg2+濃度增加，反應溶液的顏色逐漸加深（圖4C），此結果與紫外-可見吸收光譜法的測定結果一致。由于檢測樣品和空白對照組之間存在明顯色差，通過裸眼觀察即可將1 nmol/L Hg2+和空白對照組區(qū)別開來，表明所構建的方法可實現(xiàn)對Hg2+的可視化檢測。與之前文獻報道的Hg2+檢測方法相比（表2），本研究構建的Hg2+檢測方法的檢測性能與之相當或更優(yōu)，并且不需要昂貴的儀器，可實現(xiàn)對Hg2+的可視化檢測。此外，采用此生物傳感器對5 nmol/L Hg2+進行6 次重復測定，相對標準偏差（RSD）為4.2%，表明此傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

2.5 傳感器的選擇性

采用此傳感器對其它環(huán)境相關的干擾金屬離子（Ag+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、Pb2+和Cd2+）進行檢測，結果如圖5 所示， 5 nmol/L Hg2+產生了較大的響應信號，而10 倍濃度的其它非靶標金屬離子在450 nm 處所產生的吸收值與背景信號相似， 表明此傳感器對Hg2+具有較好的選擇性，受其它離子的干擾較小。其原因可能是Hg2+可插入雙胸腺嘧啶堿基對中間，形成的T-Hg2+-T 結構觸發(fā)CHA 反應，從而進一步引發(fā)RCA 放大反應，產生較大的響應信號，而其它離子不能形成類似T-Hg2+-T 的結構，因此不能觸發(fā)CHA 反應，抑制了后續(xù)一系列反應的發(fā)生，產生的信號較小。

2.6 實際樣品的檢測

利用此傳感器自來水樣品進行檢測，以驗證方法的實用性。實驗結果如表3 所示，在自來水樣品中未檢出Hg2+， 3 個不同加標濃度（1、5 和10 nmol/L）下的Hg2+的回收率為99.8%～107.0%， RSDlt;0.2%，表明此傳感器可用于實際水樣中Hg2+的檢測。

3 結論

本研究基于CHA 和RCA 雙重信號放大策略構建了高靈敏檢測Hg2+的生物傳感器。Hg2+可觸發(fā)CHA 反應，并進一步引發(fā)RCA 放大反應，得到大量具有類HRP 活性的Hemin/G-四鏈體DNA 酶，催化底物反應產生放大的響應信號。由于采用了雙重信號放大策略，此傳感器具有較高的靈敏度和較好的選擇性，采用紫外-可見吸收光譜法測定Hg2+， LOD 低至0.21 nmol/L。同時，通過反應過程中溶液顏色的變化可實現(xiàn)對濃度為1 nmol/L 的Hg2+的可視化檢測，這有利于在偏遠地區(qū)水樣中Hg2+的現(xiàn)場可視化檢測。本傳感器操作方便、靈敏度高、選擇性好，可以實現(xiàn)可視化檢測，在環(huán)境檢測領域具有潛在的應用價值。

References

[1] BAUGHMAN T A. Environ. Health Perspect. ， 2006， 114（2）： 147-152.

[2] LIU Hui-Jia， XU Jian-Ling， MA Wen， MA Liang， WANG Han-Xi， PAN Qian-Bo， HE Qian-Qian， LUO Yi-Ou， CHEN Chao-Huang. Chin. J. Anal. Chem. ， 2021， 49（5）： 839-846.

劉慧佳， 徐建玲， 馬文， 馬良， 王漢席， 潘謙博， 何倩倩， 羅逸鷗， 陳朝煌. 分析化學， 2021， 49（5）： 839-846.

[3] ZHU Xiang-Rong， LI Gao-Yang， HUANG Lü-Hong， SU Dong-Lin， LIU Wei， SHAN Yang. Chin. J. Anal. Chem. ， 2015，43（4）： 599-603.

朱向榮， 李高陽， 黃綠紅， 蘇東林， 劉偉， 單楊. 分析化學， 2015， 43（4）： 599-603.

[4] WANG L J， JIA L P， MA R N， JIA W L， WANG H S. Anal. Methods， 2017， 9（35）： 5121-5126.

[5] DAS S， SARKAR A， RAKSHIT A， DATTA A. Inorg. Chem. ， 2018， 57（9）： 5273-5281.

[6] SHI Wei-Ping， CAI Jie， YANG Ya-Ni， LUO Huan-Huan， LIU Bing-Qian， FU Qiu-Ping. Chin. J. Anal. Chem. ， 2019， 47（9）：1337-1343.

石維平， 蔡杰， 楊雅妮， 羅歡歡， 劉冰倩， 付秋平. 分析化學， 2019， 47（9）： 1337-1343.

[7] World Health Organization. Guidelines for Drinking-Water Quality： Fourth Edition Incorporating the First Addendum.2022.

[8] SMAELE T， MOENS L， DAMS R， SANDRA P， VAN DER EYCKEN J， VANDYCK J. J. Chromatogr. A， 1998， 793（1）： 99-106.

[9] LI H H， BEI Q Y， ZHANG W H， MARIMUTHU M， HASSAN M M， HARUNA S A， CHEN Q S. Food Chem. ， 2023， 422：136202.

[10] GHAEDI M， M R FATHI M， SHOKROLLAHI A， SHAJARAT F. Anal. Lett. ， 2006， 39（6）： 1171-1185.

[11] SINGH S， KANSAL S K. J. Fluoresc. ， 2022， 32（3）： 1143-1154.

[12] MA S， HE M， CHEN B， DENG W， ZHENG Q， HU B. Talanta， 2016， 146： 93-99.

[13] MA Xu， ZHANG Fang， PAN Jia-Chuan， GUO Peng-Ran， OUYANG Gang-Feng. Chin. J. Anal. Chem. ， 2018， 46（12）：1975-1981.

馬旭， 張芳， 潘佳釧， 郭鵬然， 歐陽鋼鋒. 分析化學， 2018， 46（12）： 1975-1981.

[14] RAHMAN G， WOLLE M M， FAHRENHOLZ T， KINGSTON H， PAMUKU M. Anal. Chem. ， 2014， 86（12）： 6130-6137.

[15] MIYAKE Y， TOGASHI H， TASHIRO M， YAMAGUCHI H， ODA S， KUDO M， TANAKA Y， KONDO Y， SAWA R，F(xiàn)UJIMOTO T， MACHINAMI T， ONO A. J. Am. Chem. Soc. ， 2006， 128（7）： 2172-2173.

[16] WANG X， DONG S. HOU T， LIU L. LIU X. LI F. Analyst， 2016， 141（5）： 1830-1836.

[17] ZHANG He， WANG Qing， YANG Mei， FU Xin. Chin. J. Anal. Chem. ， 2019， 47（6）： 899-906.

張何， 王青， 楊梅， 傅昕. 分析化學， 2019， 47（6）： 899-906.

[18] ZHANG X， HUANG C， JIANG Y， JIANG Y， SHEN J， HAN E. J. Agric. Food Chem. ， 2018， 66（38）： 10106-10112.

[19] PARAMANIK B， BHATTACHARYYA S， PATRA A. Chem. Eur. J. ， 2013， 19（19）： 5980-5987.

[20] MA F， CHEN Y， ZHU Y， LIU J. Talanta， 2019， 194： 114-118.

[21] HAO Y， GUO Q， WU H， GUO L， ZHONG L， WANG J， LIN T， FU F F， CHEN G. Biosens. Bioelectron. ， 2014， 52： 261-264.

[22] KONG D M， WANG N， GUO X X， SHEN H X. Analyst， 2010， 135（3）： 545-549.

[23] XIE S， TANG Y， TANG D. Anal. Methods， 2017， 9（37）： 5478-5483.

[24] YIN P， CHOI H M T， CALVERT C R， PIERCE N A. Nature， 2008， 451（7176）： 318-322.

[25] ZHANG D， BRANDWEIN M， HSUIH T， LI H. Gene， 1998， 211（2）： 277-285.

[26] ZHOU X， PU Q， YU H， PENG Y， LI J， YANG Y， CHEN H， WENG Y， XIE G. J. Colloid Interface Sci. ， 2021， 599： 752-761.

[27] BI C C， KE X X， CHEN X， WEERASOORIYA R， HONG Z Y， WANG L C， WU Y C. Anal. Chim. Acta， 2020， 1100： 31-39.

[28] SAQIB M， BASHIR S， ALI S， HAO R. J. Electroanal. Chem. ， 2022， 906： 115896.

國家自然科學基金項目（No. 22364023）、云南省基礎研究計劃項目（Nos. 202301AT070074， 202201AU070056）、云南省教育廳科學研究基金項目（No. 2021J0436）和云南師范大學博士科研啟動項目（No. 2020ZB009）資助。