齊墩果酸衍生物的合成及抗腫瘤活性研究

摘 要 目的：以齊墩果酸為先導(dǎo)化合物，設(shè)計并合成一系列基于MEK激酶靶點(diǎn)的齊墩果酸衍生物。方法：利用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計技術(shù)，確定能和關(guān)鍵位點(diǎn)結(jié)合的活性基團(tuán)。以齊墩果酸為起始原料，經(jīng)過C-28位酯化、C-3位引入酰胺基得到目標(biāo)產(chǎn)物。結(jié)果：合成了4個新型齊墩果酸衍生物Ⅰ1～Ⅰ4，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS、1H-NMR、13C-NMR確證，體外研究顯示它們的抗腫瘤活性顯著高于母體齊墩果酸，其中Ⅰ4對HepG2細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的抑制活性（IC50值為19.12 μmol/L）。結(jié)論：Ⅰ4有成為新型MEK抑制劑的潛力。

關(guān)鍵詞 齊墩果酸衍生物 合成 抗腫瘤活性 計算機(jī)輔助藥物設(shè)計

中圖分類號：O629.29； R914.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）21-0076-05

引用本文 杜新春， 宋艷玲， 何鑫. 齊墩果酸衍生物的合成及抗腫瘤活性研究[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（21）： 76-80.

基金項(xiàng)目：遼寧省一流本科專業(yè)建設(shè)項(xiàng)目（13621-2020-0202）；遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2015020687）

Synthesis of oleanolic acid derivatives and their antitumor activity

DU Xinchun1， SONG Yanling2， HE Xin1

（1. Department of Chemistry and Chemical Engineering， Shenyang Institute of Science and Technology， Shenyang 110170， China； 2. College of Pharmaceutical and Biological Engineering， Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang 110142， China）

ABSTRACT Objective： To design and synthesize a series of oleanolic acid derivatives based on MEK kinase target using oleanolic acid as the lead compound. Methods： Computer-aided drug design technology was used to determine the active groups that can bind to key sites. Oleanolic acid was used as starting material， the target compounds were obtained by esterification at position C-28 and introduction of an amide group at position C-3. Results： Four oleanolic acid derivativeⅠ1-Ⅰ4 were synthesized and their structures were identified by MS， 1H-NMR and 13C-NMR， and their antitumor activity in vitro was significantly higher than that of maternal oleanolic acid， in which compoundsⅠ4 showed strong inhibitory activity against HepG 2 cells （IC50=19.12 mmol/L）. Conclusion： CompoundⅠ4 has the potential to be a novel MEK inhibitor.

KEY WORDS oleanolic acid derivatives； synthesis； antitumor activity； computer aided-drug design

齊墩果酸（1）是廣泛分布于自然界中的齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物，具有抗腫瘤、降糖、降脂等多種藥理活性[1-3]。但因其水溶性差、生物利用度較低而限制了其臨床應(yīng)用[3]。

胞外調(diào)控激酶（extracellular regulated kinase，ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的重要成員，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Ras-Raf- MEK-ERK）調(diào)控異常會致使多種癌細(xì)胞增生、擴(kuò)散并轉(zhuǎn)移。MEK是ERK途徑中的3個關(guān)鍵靶位點(diǎn)之一，因此該信號途徑是小分子藥物發(fā)展的熱門靶點(diǎn)[4]，已成為備受關(guān)注的熱門研究項(xiàng)目。

通過運(yùn)用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計MVD軟件與MEK1蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)（PDB：4l mn）進(jìn)行模擬對接，分析了已上市的MEK抑制劑曲美替尼與目標(biāo)蛋白的相互作用（圖1）。結(jié)果表明，其分子結(jié)構(gòu)中的酰胺結(jié)構(gòu)可與MEK蛋白中的氨基酸殘基Arg234、Ser212、Asp190等形成氫鍵，說明酰胺結(jié)構(gòu)可能是化合物發(fā)揮抗腫瘤作用的重要活性基團(tuán)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計將1的C-28位酯化、C-3位引入酰胺基，同時引入取代苯環(huán)作為疏水性基團(tuán)，設(shè)計并合成了4個未見文獻(xiàn)報道的齊墩果酸類似物（圖2）。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Buchi B-540熔點(diǎn)測定儀（瑞士Buchi公司），溫度計未經(jīng)校正；ARX-400型核磁共振儀（德國Bruker公司），CDCl3為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)；1100 SL型離子阱質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）。

齊墩果酸（批號CY160305，規(guī)格500 g，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司）；三氯化鈦（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）；鹽酸羥胺（天津博迪化工有限公司）；HepG2、SGC7901（中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；其余試劑均為市售分析純。

1.2 制備方法

1.2.1 齊墩果酸甲酯制備

將1（5 g，10.95 mmol）和無水K2CO3（3.78 g， 27.35 mmol）溶于50 mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，攪拌，緩慢加入碘甲烷（1.37 mL，21.89 mmol），常溫下攪拌6 h[5]；加水稀釋，加乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次用5%稀鹽酸、蒸餾水、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，洗滌，減壓蒸干溶劑得到白色針狀晶體齊墩果酸甲酯（2）4.40 g，產(chǎn)率85%。

1.2.2 3-羰基-齊墩果酸甲酯制備

將化合物2（4.40 g，9.35 mmol）溶于200 mL丙酮中，冰鹽浴下待溫度降至0 ℃以下，緩慢滴加Jones試劑至反應(yīng)液橘紅色不再消失，室溫下反應(yīng)1～2 h；加入異丙醇130 mL進(jìn)行淬滅反應(yīng)30 min[6]；減壓蒸發(fā)部分溶劑，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌3次，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥過夜；抽濾，洗滌，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得淡黃綠色固體，干燥后用甲醇-二氯甲烷重結(jié)晶得白色晶體3-羰基-齊墩果酸甲酯（3）4.15 g，產(chǎn)率95%。

1.2.3 3-羥肟-齊墩果酸甲酯制備

將化合物3（4.15 g，8.85 mmol）溶于50 mL吡啶中，加入鹽酸羥胺（2.76 g，39.74 mmol），攪拌溶解，50 ℃回流反應(yīng)2 h，降至室溫[7]；加入適量二氯甲烷稀釋，分別經(jīng)過10%鹽酸、飽和食鹽水洗滌3次，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，抽濾，洗滌，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到白色固體3-羥肟-齊墩果酸甲酯3.24 g，產(chǎn)率76%。

1.2.4 3-氨基-齊墩果酸甲酯制備

將3-羥肟-齊墩果酸甲酯（4.88 g，10.08 mmol）溶于250 mL甲醇中，加入乙酸銨（9.04 g，117.30 mmol），再加入氰基硼氫化鈉（7.08 g，112.70 mmol），攪拌溶解，在冰鹽浴下待溫度降至0 ℃后滴加15%的三氯化鈦溶液（29.33 mL，34.22 mmol），室溫下反應(yīng)12 h；然后減壓蒸發(fā)部分溶劑，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至10，用二氯甲烷萃取，有機(jī)相用蒸餾水洗滌、無水硫酸鈉干燥、抽濾、洗滌、減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到白色固體3-氨基-齊墩果酸甲酯（4）3.78 g，產(chǎn)率80%。mp：221.3～223.7℃。ESI-MS m/z：470.8[M+H]+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.30（tdd，J=5.1，1.6，0.9 Hz，1H），3.64（s，3H），2.69（ddtt，J=7.0，5.5，4.2，1.5 Hz，1H），2.45（tq，J=5.1，1.0 Hz，1H），2.09～1.97（m，2H），1.97～1.95（m，3H），1.94～1.80（m，3H），1.76～1.70（m，1H），1.70～1.67（m，2H），1.67～1.64（m，1H），1.64～1.58（m，2H），1.57～1.50（m，3H），1.49～1.44（m，1H），1.43～1.40（m，2H），1.40～1.34（m，3H），1.17（tdq，J=6.0，3.0，1.6 Hz，1H），1.11（s，3H），0.98（t，J=1.5 Hz，3H），0.95（s，3H），0.93（t，J=1.8 Hz，6H），0.90（s，3H），0.87（t，J=1.5 Hz，3H）。13C-NMR（101 MHz，CDCl3）δ：178.32，143.77，122.37，60.04，55.77，51.54，47.66，46.74，45.87，41.66，41.30，39.22，38.84，37.67，37.13，33.86，33.11，32.68，32.39，30.70，28.47，27.68，26.48，25.92，23.64，23.35，23.08，18.58，16.85，15.96，15.19。

1.3 目標(biāo)化合物的合成

1.3.1 3-（苯甲酰胺基）-齊墩果酸甲酯（Ⅰ1）的制備

將化合物4（0.15 g，0.32 mmol）溶于5 mL無水二氯甲烷，再將苯甲酸（0.12 g，0.96 mmol）用5 mL無水二氯甲烷溶解后滴加至反應(yīng)瓶中，最后加入二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）（0.08 g，0.43 mmol）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）（0.039 g，0.32 mmol），攪拌，常溫反應(yīng)3 h；然后用適量二氯甲烷稀釋，經(jīng)5%鹽酸洗滌3次，再經(jīng)蒸餾水洗滌、無水硫酸鈉干燥、抽濾、洗滌、減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、硅膠柱色譜分離、乙酸乙酯/石油醚（5%/20%）洗脫，得白色粉末化合物Ⅰ1 0.11 g，產(chǎn)率60%。mp：187.1～190.3 ℃。ESI-MS m/z：574.9[M+H]+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.73～7.66（m，2H），7.57～7.49（m，1H），7.48～7.40（m，2H），7.36（d，J=8.2 Hz，1H），5.30（tdd，J=5.1，1.6，0.9 Hz，1H），3.73（dddd，J=11.5，5.9，3.0，1.6 Hz，1H），3.64（s，3H），2.45（tq，J=5.1，1.0 Hz，1H），2.09～1.99（m，2H），1.97～1.93（m，2H），1.92～1.87（m，1H），1.87～1.80（m，1H），1.79～1.75（m，1H），1.74～1.70（m，1H），1.70～1.65（m，3H），1.65～1.55（m，4H），1.50～1.43（m，2H），1.43～1.32（m，4H），1.26（dddd，J=5.5，3.9，3.0，1.5 Hz，1H），1.11（s，3H），0.98（t，J=1.5 Hz，3H），0.95（s，3H），0.93（dd，J=3.6，1.6 Hz，6H），0.90（s，3H），0.87（t，J=1.5 Hz，3H）。13C-NMR（101 MHz，CDCl3）δ：178.36，167.12，143.83，135.29，131.29，128.59，126.80，122.30，56.96，55.93，51.53，47.59，46.76，45.86，41.69，41.34，39.27，38.93，37.98，36.96，33.87，33.12，32.63，32.39，30.70，28.62，27.70，25.91，25.47，23.65，23.39，23.09，18.63，16.87，16.75，15.29。

1.3.2 3-（對甲基苯甲酰胺基）-齊墩果酸甲酯（Ⅰ2）的制備

按照化合物Ⅰ1的合成方法，由化合物4（0.15 g，0.32 mmol）和對甲基苯甲酸（0.13 g，0.96 mmol）反應(yīng)制得白色固體Ⅰ2 0.12 g，產(chǎn)率64%。mp：238.3～240.8 ℃。ESI-MS m/z：588.8[M+H]+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.70～7.56（m，2H），7.42（d，J=8.2 Hz，1H），7.22（dq，J=8.3，0.8 Hz，2H），5.30（tdd，J=5.1，1.6，0.9 Hz，1H），3.73（dddd，J=11.4，5.9，3.0，1.6 Hz，1H），3.64（s，3H），2.45（tq，J=5.1，1.0 Hz，1H），2.39（d，J=0.9 Hz，3H），2.07～1.98（m，2H），1.98～1.87（m，3H），1.84（ddd，J=12.1，8.3，5.6 Hz，1H），1.79～1.71（m，2H），1.70～1.65（m，3H），1.64～1.54（m，4H），1.50～1.43（m，2H），1.42～1.32（m，4H），1.26（ddq，J=7.0，4.0，1.5 Hz，1H），1.11（s，3H），0.98（t，J=1.5Hz，3H），0.95（s，3H），0.93（dd，J=3.6，1.6 Hz，6H），0.90（s，3H），0.87（t，J=1.5 Hz，3H）。13C-NMR（101 MHz，CDCl3）δ：178.36，167.07，143.81，141.66，132.35，129.22，126.80，122.30，56.86，55.92，51.53，47.57，46.75，45.84，41.68，41.32，39.25，38.93，37.97，36.95，33.86，33.11，32.62，32.39，30.69，28.61，27.68，25.91，25.47，23.65，23.38，23.08，21.43，18.62，16.85，16.75，15.28。

1.3.3 3-（對甲氧基苯甲酰胺基）-齊墩果酸甲酯（Ⅰ3）的制備

按照化合物Ⅰ1的合成方法，由化合物4（0.15 g，0.32 mmol）和對甲氧基苯甲酸（0.5 g，3.29 mmol）反應(yīng)制得白色粉末Ⅰ3 0.14 g，產(chǎn)率73%。mp：187.8～190.4 ℃。ESI-MS m/z：604.9[M+H]+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.77～7.66（m，2H），7.34（d，J=8.1 Hz，1H），7.01～6.87（m，2H），5.30（tdd，J=5.1，1.6，0.9 Hz，1H），3.83（s，3H），3.73（dddd，J=11.5，5.9，3.0，1.6 Hz，1H），3.64（s，3H），2.45（tq，J=5.1，1.0 Hz，1H），2.07～1.97（m，2H），1.97～1.89（m，3H），1.84（ddd，J=12.1，8.3，5.6 Hz，1H），1.80～1.70（m，2H），1.70～1.65（m，3H），1.65～1.55（m，4H），1.50～1.43（m，2H），1.43～1.33（m，4H），1.26（dddd，J=7.0，3.9，2.9，1.5 Hz，1H），1.11（s，3H），0.98（t，J=1.5 Hz，3H），0.95（s，3H），0.93（dd，J=3.6，1.6 Hz，6H），0.90（s，3H），0.87（t，J=1.5 Hz，3H）。13C-NMR（101 MHz，CDCl3）δ：178.38，166.68，163.93，162.05，143.82，132.30，128.57，113.74，56.85，55.92，55.45，51.54，47.58，46.77，45.85，41.69，41.34，39.26，38.94，37.97，36.96，33.87，33.11，32.63，32.40，30.70，28.61，27.69，25.91，25.51，23.65，23.39，23.09，18.63，16.86，16.75，15.28。

1.3.4 3-（對硝基苯甲酰氨基）-齊墩果酸甲酯（Ⅰ4）的制備

按照化合物Ⅰ1的合成方法，由化合物4（0.15 g，0.32 mmol）和對硝基苯甲酸（0.5 g，2.99 mmol）反應(yīng)制得白色粉末Ⅰ4 0.14 g，產(chǎn)率70%。mp：192.4～194.7 ℃。ESI-MS m/z：619.8[M+H]+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.31～8.23（m，2H），8.18～8.05（m，2H），7.53（d，J=8.2 Hz，1H），5.30（tdd，J=5.1，1.6，0.9 Hz，1H）， 3.73（dddd，J=11.5，5.9，3.0，1.6 Hz，1H），3.64（s，3H），2.45（tq，J=5.1，1.0 Hz，1H），2.08～1.98（m，2H），1.98～1.88（m，3H），1.84（ddd，J=12.1，8.3，5.6 Hz，1H），1.79～1.71（m，2H），1.70～1.65（m，3H），1.65～1.54（m，4H），1.50～1.43（m，2H），1.42～1.33（m，4H），1.26（dddd，J=7.0，3.9，2.9，1.5 Hz，1H），1.11（s，3H），0.98（t，J=1.5 Hz，3H），0.95（s，3H），0.93（dd，J=3.6，1.6 Hz，6H），0.90（s，3H），0.87（t，J=1.5 Hz，3H）。13C-NMR（101 MHz，CDCl3）δ：178.57，166.78，149.25，143.16，138.24，128.66，128.66，124.63，124.63，122.17，57.88，54.30，51.19，48.10，47.33，45.48，43.56，40.67，39.68，39.32，36.47，36.41，33.88，32.44，31.75，31.11，29.33，29.22，29.22，28.66，24.22，23.87，23.28，23.28，21.56，18.85，18.53，16.03。

1.3.5 化合物的抗腫瘤活性測試

活性測試由沈陽化工大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室完成。使用曲美替尼作為陽性對照藥物，通過MTT法測試目標(biāo)化合物的抗腫瘤活性，并選擇HepG2和SGC7901細(xì)胞作為測試目標(biāo)。計算所測化合物對腫瘤細(xì)胞的IC50。

2 結(jié)果

MVD軟件能夠預(yù)測蛋白質(zhì)與配體的相互作用，計算結(jié)合能，通過函數(shù)打分將結(jié)果通過數(shù)值體現(xiàn)出來，分?jǐn)?shù)表示為結(jié)合自由能Escore（kcal/mol），其絕對值越大，表示結(jié)合能力越強(qiáng)[8]（表1）。

通過Discovery Studio 2016 Client直觀分析目標(biāo)化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所設(shè)計的1的衍生物能夠插入到MEK蛋白靶標(biāo)中，利用氫鍵、疏水鍵、π-σ鍵、π-alkyl等與靶蛋白的多個氨基酸殘基（Asn221，Ser248，Val191，Met230，Asp190等）相互作用。Ⅰ4是其中分值最高的化合物，結(jié)構(gòu)中新引入的酰胺結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)蛋白具有氫鍵作用，對比曲美替尼、化合物Ⅰ4與靶標(biāo)蛋白的對接圖（圖1、圖3），發(fā)現(xiàn)曲美替尼和化合物Ⅰ4均與相同的氨基酸殘基Asp190形成氫鍵，初步判斷化合物Ⅰ4和曲美替尼與靶標(biāo)蛋白具有相同的結(jié)合位點(diǎn)。

目標(biāo)化合物與MEK靶蛋白的分子對接模擬結(jié)果顯示，化合物Ⅰ4與MEK蛋白的結(jié)合較為緊密。

化合物Ⅰ4對人肺癌細(xì)胞HepG2的IC50為19.12 mmol/L，活性顯著高于母體1，稍低于曲美替尼（表2）。體外抗腫瘤活性測試結(jié)果顯示，目標(biāo)化合物對細(xì)胞HepG2的抑制活性均強(qiáng)于1。

3 討論

本研究以O(shè)A為母體，運(yùn)用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計進(jìn)行模擬對接，分析已知靶點(diǎn)MEK蛋白與抑制劑的結(jié)合情況，將酰胺結(jié)構(gòu)引入C-3位，設(shè)計合成了4個新型齊墩果酸衍生物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS，1H-NMR，13C-NMR確證。體外藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，化合物在人肝癌細(xì)胞HepG2中具有良好的生長抑制活性，Ⅰ系列化合物對HepG2細(xì)胞的IC50大小順序?yàn)棰?>Ⅰ1>Ⅰ3>Ⅰ4，初步構(gòu)效關(guān)系表明，在R1基團(tuán)的苯環(huán)上引入吸電子基團(tuán)有利于提高化合物的抗腫瘤活性?？傮w而言，與同類研究相比在齊墩果酸C-3位引入酰胺基對提高化合物的抗腫瘤活性具有積極作用，且計算機(jī)輔助篩選可大大提高新藥研發(fā)速度。藥理學(xué)活性實(shí)測與分子對接模擬預(yù)測的結(jié)果相關(guān)性較好，對進(jìn)一步優(yōu)化齊墩果酸衍生物的結(jié)構(gòu)和MEK抑制劑的開發(fā)具有一定的參考價值。今后將進(jìn)一步對該系列化合物的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究，并尋找其他作用靶點(diǎn)蛋白。

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