N-乙酰轉(zhuǎn)移酶對羅非魚無乳鏈球菌毒力相關(guān)特性的影響

摘要 為闡明N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（NAT）在無乳鏈球菌致病過程中的作用，利用同源重組法構(gòu)建野生株HN016的nat 基因缺失株Δnat，并比較野生株和缺失株的生長、形態(tài)、黏附入侵細胞能力、抗吞噬能力、全血存活能力和致病力。結(jié)果顯示，Δnat 的溶血能力降低，并且nat 缺失導(dǎo)致無乳鏈球菌對羅非魚腦細胞的黏附和入侵能力下降，并增加了細菌對血液殺傷和吞噬細胞吞噬的敏感性。羅非魚感染試驗結(jié)果顯示，nat 基因缺失株Δnat（2×108 CFU/尾，致死率為36%）對羅非魚的致死力顯著低于野生株HN016（2×108 CFU/尾，致死率為85%）。羅非魚感染12 h 后，與野生對照株相比，Δnat 突變株在血液、脾臟和腦組織中載菌量顯著降低。研究表明，N-乙酰轉(zhuǎn)移酶參與無乳鏈球菌抵抗宿主血液和吞噬細胞的清除，并協(xié)助細菌對羅非魚組織的入侵和定植。

關(guān)鍵詞 無乳鏈球菌； N-乙酰轉(zhuǎn)移酶； 基因缺失； 生物學(xué)特性； 羅非魚

中圖分類號 S917.1 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）06-0289-08

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是一種革蘭氏染色呈紫色的鏈狀球菌，又稱B 族鏈球菌（group B streptococcus，GBS）。近年來，無乳鏈球菌已成為水生環(huán)境中的主要病原體之一，能感染許多養(yǎng)殖魚類，導(dǎo)致敗血癥和腦膜炎［1］，給養(yǎng)殖業(yè)尤其是羅非魚（Oreochromis spp.）養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

細菌發(fā)揮致病作用的前提是能夠響應(yīng)宿主體內(nèi)微環(huán)境的變化，而這種響應(yīng)依賴于蛋白翻譯后的修飾［2］。乙?；揎検堑鞍追g后修飾中最保守的方式之一。乙?；梢哉{(diào)節(jié)RcsB 蛋白的活性，從而影響大腸桿菌（Escherichia coli）在酸脅迫下的存活和鞭毛合成［3］。乙?；倪^程需要乙酰轉(zhuǎn)移酶的參與，乙酰轉(zhuǎn)移酶可以催化乙?；鶑囊阴］o酶A 轉(zhuǎn)移到底物，并通過催化底物的乙?；?，協(xié)調(diào)細菌的各種生物過程［7］。已鑒定的乙酰轉(zhuǎn)移酶被分為3 個家族，分別為GCN5 （general control non-repressed 5 protein，GCN5）、CBP/p300 （cyclic-AMP response bindingprotein-binding protein， CBP） 和MYST （Moz，Ybf2， Sas2 和Tip60， MYST），其中GCN5 家族乙酰轉(zhuǎn)移酶是細菌中最主要的乙酰轉(zhuǎn)移酶［5］。GNAT（GCN5-related N-acetyltransferase，GNAT）將乙酰輔酶A 的乙?；D(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的N-氨基上，因此稱為N-乙酰轉(zhuǎn)移酶。

N-乙酰轉(zhuǎn)移酶在細菌耐藥性和代謝等多種生理活動中發(fā)揮重要作用。例如，在結(jié)核分枝桿菌（My?cobacterium tuberculosis）中，具有N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的Eis 蛋白可以通過乙?；揎棸被擒疹惪股?，從而削弱其與核糖體的結(jié)合，導(dǎo)致耐藥性［6］；在炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthraci）中，N-乙酰轉(zhuǎn)移酶可以乙?；蜏缁铈溍顾?，導(dǎo)致細菌抵抗鏈霉素的抑制和殺滅［7］；在牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingi?valis）中，N-乙酰轉(zhuǎn)移酶能夠調(diào)節(jié)牙齦痛蛋白酶的激活和成熟［8］。目前，在鏈球菌中關(guān)于乙酰轉(zhuǎn)移酶的研究并不多見。已報道的相關(guān)研究包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT 可以賦予糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和A 族鏈球菌氯霉素抗性，并且將CAT 基因重組到質(zhì)粒上用于科學(xué)研究［9］；由無乳鏈球菌的neuD 基因編碼的O-乙酰轉(zhuǎn)移酶是細菌莢膜多糖唾液酸所必需的［10］，而無乳鏈球菌中的N- 乙酰轉(zhuǎn)移酶尚未見報道。

本研究構(gòu)建無乳鏈球菌nat 基因缺失株，探究該基因缺失對細菌溶血能力、全血存活能力、黏附入侵能力、抗吞噬能力、組織定植能力以及對羅非魚致死率的影響，以期闡明N-乙酰轉(zhuǎn)移酶在無乳鏈球菌致病過程中的作用，促進對無乳鏈球菌致病機制的了解。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、細胞和試劑

無乳鏈球菌野生株HN016 分離自廣東省某養(yǎng)殖場患腦膜炎的羅非魚。大腸桿菌DH5α 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。溫敏型自殺載體pSET4s由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)周洋教授惠贈。TiB 細胞是一種來自羅非魚大腦的成纖維細胞系，由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院曾偉偉教授贈送。小鼠單核細胞巨噬細胞（RAW264.7）由筆者所在實驗室保存并傳代。

DNA 聚合酶混合液、核酸Marker、限制性核酸內(nèi)切酶、核酸連接酶、pMD9-T 載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 酶混合物購自寶生物工程有限公司（大連）；質(zhì)粒提取、瓊脂糖凝膠核酸回收和原核生物的RNA 提取試劑盒購自Tiangen 公司；DL-蘇氨酸購自Invitrogen 公司；蔗糖、磷酸氫二鉀、氫氧化鉀和甘油購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒和PBS（磷酸鹽緩沖液）購自Solarbio 公司；麻醉劑MS-222 購自Macklin 公司；藥敏片購自杭州微生物有限公司；壯觀霉素（spectinomycin，Spc）購自德國Biofroxx 公司；胎牛血清和DMEM（Dulbecco’smodified Eagle medium）培養(yǎng)基購自Gibco 公司；THB （Todd-Hewitt broth） 和LB （Luria-Bertanibroth）培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 菌株及細胞的培養(yǎng)

無乳鏈球菌在THB 或含1.5%（m/V）瓊脂的THB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37 ℃。大腸桿菌DH5α在LB 或含1.5%（m/V）瓊脂的LB 培養(yǎng)基上生長，溫度為37 ℃。必要時將壯觀霉素加入固體培養(yǎng)基或肉湯中，終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。小鼠單核細胞巨噬細胞（RAW264.7）在37 ℃、5% 二氧化碳條件下用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。羅非魚腦細胞系（TiB）在含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃。

1.3 Δnat 缺失株的構(gòu)建

1）基因缺失質(zhì)粒的構(gòu)建。以HN016 基因組為模板，分別用目的基因上游引物和下游引物擴增上下游同源臂。用融合PCR 的方法將2 個同源片段連接，再與pMD19-T 載體連接測序，之后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切后克隆至質(zhì)粒pSET4s 的合適位置，采用熱擊方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，提取質(zhì)粒備用。

2）感受態(tài)細胞的制備。將過夜培養(yǎng)菌液按1∶100 轉(zhuǎn)接至THY（含40 mmol/L DL- 蘇氨酸的THB）培養(yǎng)液中，37 ℃，180 r/min 培養(yǎng)至OD600 nm 為0.4～0.6；冰浴30 min 后，12 000 r/min，4 ℃離心10min 收集菌體；用EB 緩沖溶液（10% 蔗糖、2 mmol/L磷酸氫二鉀）重懸細菌，同上離心；再用超純水洗2 次，之后用15% 甘油溶液重懸細菌，洗2 次。最后用15% 甘油重懸菌體，按每管80～100 μL 分裝，于-80 ℃凍存待用。

3）電轉(zhuǎn)化。將該菌的感受態(tài)細胞與基因缺失質(zhì)粒以體積比10∶1 混合（質(zhì)粒最終的劑量控制在l μg）后加到電轉(zhuǎn)化杯中，冰上放置0.5 h。電轉(zhuǎn)化時，儀器設(shè)置：電壓2.35 kV/cm、電阻200 Ω 和電容25 μF。電轉(zhuǎn)化結(jié)束后立即將l mL 復(fù)蘇液加入電擊杯中。將電轉(zhuǎn)化后的無乳鏈球菌在28 ℃和180 r/min 振蕩培養(yǎng)3 h，然后加入壯觀霉素至終質(zhì)量濃度100 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。

4）缺失株的篩選。將培養(yǎng)過夜的菌液涂布在固體THB 培養(yǎng)基上，直至長出單克隆。挑取單克隆接種至含有100 μg/mL 壯觀霉素的THB 液體培養(yǎng)基中。之后，在不含抗生素的THB 培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min 連續(xù)傳代培養(yǎng)，在溫度和抗性的雙重選擇下促使重組缺失質(zhì)粒與基因組上具有相同序列的基因片段發(fā)生同源重組。將傳代后的菌液梯度稀釋后涂在含有壯觀霉素抗性和無抗性的THB 平板過夜培養(yǎng)。當(dāng)無抗性的平板上長的菌落明顯多于抗性平板時挑選無抗性平板上的菌落，用缺失基因的內(nèi)部引物和上下游同源臂引物進行PCR 篩選。

5）缺失株的驗證。用同源臂引物PCR 擴增疑似缺失株相應(yīng)片段，并通過DNA 膠回收試劑盒純化PCR 產(chǎn)物，測序，測序結(jié)果只含有缺失基因上下游片段，則說明缺失株構(gòu)建成功。另外，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的無乳鏈球菌野生株和缺失株進行RNA 的提取，用DNase Ⅰ去除基因組DNA 干擾。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR premixEx TaqTM Kit，采用說明書兩步法qRT-PCR 檢測目的基因的mRNA 水平，以16S rRNA 基因作為內(nèi)參。所用引物見表1，均由北京擎科生物公司合成。采用2-ΔΔCt法分析mRNA 水平的差異［11］。

1.4 表型測定

1）生長曲線。將過夜培養(yǎng)的菌液按1∶100 稀釋到新鮮的THB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)中期（OD600 nm=0.4～0.5）。培養(yǎng)物在新鮮的THB 培養(yǎng)基中稀釋至OD600 nm為0.1。取稀釋后的培養(yǎng)物 200 μL至96 孔微孔板中，37 ℃孵育，每小時搖動10 s 后測量OD600 nm 值，設(shè)置4 個技術(shù)重復(fù)。根據(jù)重復(fù)的平均值繪制OD600 nm隨時間的變化曲線圖。

2）溶血性。將過夜培養(yǎng)的細菌劃線接種于血平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，使其形成明顯溶血圈，觀察溶血情況并拍照。

3）革蘭氏染色。先涂片固定，草酸銨結(jié)晶紫染1 min，蒸餾水沖洗；再加碘液覆蓋涂面染約1 min，水洗，用吸水紙吸去水分；再加95% 乙醇數(shù)滴，輕輕搖動脫色，20 s 后水洗，吸去水分；番紅染色液染1 min后用蒸餾水沖洗；干燥，鏡檢。

1.5 全血存活試驗

試驗參照文獻［12］描述的方法，并有所修改。在羅非魚的尾靜脈取血，立即加入0.1% 肝素鈉，備用。準備好已經(jīng)生長到對數(shù)期的無乳鏈球菌，稀釋至合適濃度加到血液中，控制細菌最終的濃度為1×103 CFU/mL，將混合液置于37 ℃培養(yǎng)箱并保持微翻轉(zhuǎn)。分別于0 和1.5 h 取一定量的混合液，涂布到THB 固體培養(yǎng)平板上，記錄長出的菌落數(shù)。

1.6 黏附和入侵試驗

試驗參照文獻［12］描述的方法，并有所修改。

1）黏附試驗。用0.25% 胰酶處理單層TiB 細胞后，顯微鏡觀察并計算細胞數(shù)量，再加到24 孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。無乳鏈球菌野生株HN016 和缺失株培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600 nm 為0.6），洗菌液3 次，調(diào)整到濃度為4×106 CFU/mL，將菌液加入細胞孔（復(fù)合感染比MOI=10），微速離心后將細胞板放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。取出后用PBS 緩沖液洗3～5 次，再加入純水裂解細胞并進行平板計數(shù)菌落數(shù)。黏附率是衡量細菌黏附細胞的一個重要指標，黏附率（裂解后菌落數(shù)量/加入細菌數(shù)量）越高說明細菌黏附細胞的能力越強。

2）入侵試驗。方法同黏附試驗，不同的是PBS洗滌后，需加入青霉素G 至終質(zhì)量濃度為100μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)細胞1 h。入侵率是衡量細菌侵入細胞的一個重要指標，入侵率（裂解后菌落數(shù)量/加入細菌數(shù)量）越高說明細菌侵入細胞的能力越強。

1.7 抗吞噬試驗

試驗參照文獻［12］描述的方法。RAW264.7 細胞用含10% 胎牛血清的DMEM 營養(yǎng)液在5% CO2和37 ℃條件下傳代培養(yǎng)，以4×105 細胞/孔傳代至24 孔板上，形成單層貼壁細胞。以MOI 為10，即4×106 細胞/孔的細菌懸液感染RAW264.7 細胞。接種后將24 孔板在室溫下1 000 r/min 離心15 min 使細菌與細胞充分接觸。24 孔板置37 ℃、5% CO2作用1 h。用PBS 洗3～5 遍，每孔加入l mL 含100 μg/mL 慶大霉素和5 μg/mL 青霉素的DMEM，以徹底清除巨噬細胞外殘余細菌。加入抗生素1 h 后用無菌PBS 清洗2 遍再加入去離子水裂解細胞。將該裂解液梯度稀釋后涂平板計數(shù)菌落數(shù)。吞噬率是衡量細菌抵抗吞噬的一個重要指標，吞噬率（裂解后菌落數(shù)量/加入細菌數(shù)量）越低說明細菌抗吞噬的能力越強。

1.8 致死率試驗

試驗參照文獻［12］描述的方法，并有所修改。試驗用羅非魚均購自廣東粵強豐水產(chǎn)養(yǎng)殖場，體質(zhì)量（10±1） g，于實驗室暫養(yǎng)2 周后進行相關(guān)試驗。通過2 次離心收集對數(shù)后期的細菌，并用PBS 重懸，備用。將120 尾魚隨機分為3 組（野生株組、突變株組和對照組），每組40 尾。對照組注射無菌PBS 0.1mL，試驗組羅非魚用90 mg/L 的MS-222 麻醉后腹腔注射0.1 mL 細菌懸液（每尾魚注射2×108 CFU）。對被注射感染的魚進行監(jiān)測，連續(xù)14 d，從所有死魚的腦組織中重新分離出細菌并進行鑒定。試驗重復(fù)2 次。

1.9 組織載菌量試驗

試驗參照文獻［19］描述的方法，并有所修改。將20 尾魚隨機分為2 組，每組10 尾。分別腹腔注射野生株HN016 和突變株，每尾魚注射2×108 CFU。麻醉的處理方法同本文“材料與方法1.8”。感染后12 h，采集腦、脾臟和血液樣本，稱測各組織質(zhì)量。勻漿后用PBS 連續(xù)稀釋至10-2、10-3、10-5 和10-6 進行平板計數(shù)。計數(shù)時選取菌落數(shù)在30～300 的平板。

1.10 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism 6.0 軟件做圖，利用t 檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，以Plt;0.05 （*）為有統(tǒng)計學(xué)差異，Plt;0.01 （**）為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，Plt;0.001 （***）為有極顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。除了特殊說明，所有試驗均進行3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 無乳鏈球菌nat 基因缺失株的構(gòu)建

如圖1A 所示，用nat 基因內(nèi)部引物（nat-F/nat-R）進行PCR 擴增，以缺失株Δnat 基因組為模板，無法獲得擴增產(chǎn)物，以野生株HN016 基因組為模板能獲得約500 bp 的產(chǎn)物；以nat 基因外部引物（nat-A/nat-D）進行PCR 擴增，以缺失株Δnat 基因組為模板，PCR 擴增產(chǎn)物大小為上下游同源臂的大小之和約1 000 bp，而以野生株HN016 基因組為模板，PCR擴增產(chǎn)物大小為上下游同源臂加nat 基因長度約2 200 bp。結(jié)果表明缺失株Δnat 構(gòu)建成功。用qRTPCR檢測nat 基因mRNA 的表達水平，結(jié)果（圖1B）顯示，nat 基因的mRNA 在野生菌株中正常表達，而在缺失株Δnat 中未檢測到表達；另外，用qRT-PCR檢測nat 基因的上游基因（SAHN016_RS06510）和下游基因（SAHN016_RS06520）的mRNA 表達水平，結(jié)果（圖1B）顯示在缺失株Δnat 和野生株HN016 中nat 上下游基因的mRNA 表達水平?jīng)]有顯著差異。因此，nat 基因缺失不影響上下游基因的表達。

2.2 nat 基因缺失對無乳鏈球生長特性、菌落形態(tài)和溶血能力的影響

如圖2A 所示，缺失株Δnat 和野生株HN016 均在2 h 左右進入對數(shù)生長期，4 h 左右進入平臺期，表明缺失株Δnat 和野生株HN016 生長無顯著差異，這表明nat 基因缺失不影響細菌生長。同時革蘭氏染色結(jié)果也表明基因缺失不影響細菌革蘭氏染色（圖2B）。另外通過比較缺失株Δnat 和野生株HN016 在血平板上的溶血環(huán)，nat 基因缺失使無乳鏈球菌的溶血能力減弱（圖2C）。

2.3 nat 基因缺失對無乳鏈球菌在血液中生存能力的影響

如圖3 所示，與羅非魚全血孵育1.5 h 后，野生株HN016 增長了14.6 倍，缺失株Δnat 增長了11.9 倍，Δnat 在血液中的生存能力顯著弱于野生株HN016。說明nat 基因缺失顯著降低無乳鏈球菌在羅非魚全血中的生存能力。

2.4 nat 基因缺失對無乳鏈球菌黏附和入侵羅非魚腦細胞能力的影響

如圖4A 所示，野生型HN016 對TiB 細胞的入侵率為0.8%，缺失株Δnat 對TiB 細胞的入侵率為0.19%，Δnat 的入侵率比野生型下降了75.6%（圖4A）。如圖4B 所示，野生型HN016 對TiB 細胞的黏附率為24.1%，缺失株Δnat 對TiB 細胞的黏附率為13.8%，Δnat 對TiB 細胞的黏附性下降了42.7%（圖4B）。這些結(jié)果表明nat 基因缺失顯著降低無乳鏈球菌黏附和入侵羅非魚細胞的能力。

2.5 nat 基因缺失對無乳鏈球菌抗吞噬能力的影響

用RAW264.7 評價Δnat 的抗吞噬能力，突變株Δnat 和野生株HN016 的吞噬率分別為64.5%和38.2%，Δnat 比HN016 更容易被吞噬（圖5）。結(jié)果表明，Δnat 對RAW264.7 的吞噬作用更敏感，nat 基因缺失顯著降低無乳鏈球菌對巨噬細胞吞噬作用的抗性。

2.6 nat 基因缺失對無乳鏈球菌致病力的影響

對培養(yǎng)至對數(shù)期的野生株和缺失株以2×108CFU/尾的劑量，腹腔注射的方式攻毒羅非魚，并在之后的14 d 內(nèi)觀察存活情況。結(jié)果如圖6 所示，HN016 感染羅非魚3 d 內(nèi)可造成85% 死亡率，第4～14 天內(nèi)沒有出現(xiàn)死魚。Δnat 感染羅非魚8 d 后造成36% 羅非魚死亡，第8～14 天內(nèi)沒有出現(xiàn)死魚。PBS對照組在試驗周期內(nèi)并沒有造成羅非魚的死亡。感染HN016 的羅非魚表現(xiàn)出典型的出眼癥、角膜混濁、鰓帽下緣出血等癥狀，而感染Δnat 的羅非魚癥狀較輕或無明顯癥狀（圖6B）。這些結(jié)果表明nat 基因缺失顯著降低了無乳鏈球菌的致病力。

2.7 缺失株Δnat 感染組織載菌量的變化

如圖7 所示，羅非魚感染野生株12 h 后，腦、脾臟和血液載菌量分別為4.81×105、3.77×107 和4.5×106 CFU/mg，感染突變株Δnat 后，腦、脾臟和血液載菌量分別為3×104、2.86×106 和2.6×104 CFU/mg（圖7），Δnat 感染后的組織載菌量較野生株顯著下降，其中在大腦減少93.8%，在脾臟減少92.4%，在血液中減少了99.4%。這些結(jié)果進一步表明nat 基因缺失降低了無乳鏈球菌毒力。

3 討論

本研究通過同源重組構(gòu)建了無乳鏈球菌nat 基因缺失菌株，發(fā)現(xiàn)與野生株相比，Δnat 的革蘭氏染色和在培養(yǎng)基中的生長無明顯差異，表明nat 基因缺失對細菌生長和形態(tài)的影響不大。但nat 缺失明顯削弱細菌在全血中的存活能力，表明nat 基因有助于無乳鏈球菌在血液中生存。溶血性試驗結(jié)果表明，nat基因的缺失導(dǎo)致了無乳鏈球菌溶血能力減弱，這與大腸桿菌中的乙酰轉(zhuǎn)移酶缺失的表型一致［13］，大腸桿菌中的溶血素需要乙?；拍馨l(fā)揮溶血活性，這表明nat 基因的缺失，可能導(dǎo)致了溶血素不能被乙?；?，最終導(dǎo)致無乳鏈球菌溶血性降低。莢膜多糖是細菌關(guān)鍵毒力因子，對細菌在血液中存活至關(guān)重要［14］。在大腸桿菌中，乙?；那v膜多糖可以使細菌逃避血液的殺傷，避免宿主的免疫防御［15］。因此，我們推測nat 缺失導(dǎo)致無乳鏈球菌在血液中生存能力的下降可能是因為細菌莢膜多糖不能被乙酰化修飾，這還需要進一步的實驗驗證。

腦膜炎是無乳鏈球菌感染最常見的臨床綜合征，細菌導(dǎo)致腦膜炎需要黏附和入侵腦細胞。本研究利用羅非魚大腦成纖維細胞TiB 評估基因缺失對細菌黏附入侵能力的影響。結(jié)果顯示Δnat 黏附和入侵TiB 的比率遠低于野生株，表明nat 基因參與無乳鏈球菌入侵大腦過程。與上述結(jié)果相似，CheY 也是一種乙酰化蛋白，Yao 等［16］的研究表明CheY 促進單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）與上皮細胞的初步黏附并有助于單增李斯特菌對上皮細胞的入侵。插入沉默空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）的cheY 基因可導(dǎo)致該細菌獲得較高的體外黏附和入侵能力，但無法在體內(nèi)定植和引起疾病［11］。抵抗吞噬細胞吞噬是無乳鏈球菌發(fā)揮致病作用的關(guān)鍵，因此我們還探究了nat 缺失對無乳鏈球菌抗RAW264.7吞噬能力的影響，結(jié)果表明缺失株對吞噬細胞的敏感性顯著增加。這說明致病菌的乙酰轉(zhuǎn)移酶在抗吞噬過程中發(fā)揮重要作用。

黏附和入侵減少以及吞噬敏感性增加是否會導(dǎo)致無乳鏈球菌對羅非魚致病力的降低？為了回答這個問題，我們利用羅非魚感染模型驗證了缺失株和野生株對羅非魚的致死率和在器官中的定植能力。當(dāng)使用2×108 CFU/尾的劑量攻毒羅非魚時，野生株死亡率為85%，而nat 基因缺失株僅為36%，同時感染野生株的羅非魚死亡速度更快，在感染最初的2 d發(fā)生集中性大量死亡，但缺失株沒有發(fā)生集中性死亡，表明nat 基因缺失導(dǎo)致無乳鏈球菌對羅非魚致死率發(fā)生明顯下降。為了更全面了解細菌致病力，我們采集了受感染羅非魚的脾臟、血液和大腦，并統(tǒng)計了不同組織和血液中的細菌載量。結(jié)果顯示缺失株在器官和血液中的載量均低于野生株，表明nat 基因的缺失導(dǎo)致無乳鏈球菌更容易被免疫系統(tǒng)清除，血液和脾臟中的細菌密度顯著降低可以證明這一點。而在大腦中觀察到的細菌密度的減少再次證明Δnat進入大腦的能力受損。由此可見，nat 基因表達的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶是無乳鏈球菌關(guān)鍵毒力因子，nat 基因缺失導(dǎo)致無乳鏈球菌毒力減弱。乙酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的乙?；揎椏烧{(diào)節(jié)多種細菌毒力。在沙門氏菌中，乙酰轉(zhuǎn)移酶可以通過乙?；{(diào)控PhoP 的活性，而PhoP是細菌毒力的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，因此，推測乙酰轉(zhuǎn)移酶具有調(diào)控細菌毒力的功能［17］。在銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中，kdsA 基因產(chǎn)物被乙?；?，參與脂多糖的生物合成，是銅綠假單胞菌毒力所必需的［18］。因此，我們推測Δnat 毒力的減弱可能是細菌中某些毒力因子乙?；潭冉档蛯?dǎo)致的，需要進一步進行實驗驗證。

綜上，本研究初步探究了無乳鏈球菌N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的功能，發(fā)現(xiàn)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶參與無乳鏈球菌通過血液運輸并感染羅非魚器官的過程，并且能夠協(xié)助無乳鏈球菌抵抗吞噬細胞和血液的清除，最終導(dǎo)致無乳鏈球菌對羅非魚的高致病力。這一結(jié)果闡明了N-乙酰轉(zhuǎn)移酶在無乳鏈球菌中的作用，為進一步探索無乳鏈球菌致病機制提供了理論依據(jù)。本研究中，我們成功地以HN016 的基因組為模板，PCR 擴增并純化出nat 基因片段，并通過嘗試酶切酶連或者重疊PCR 的方法將nat 基因連接到回補質(zhì)粒pSET4s上，但是，目前我們還沒有獲得正確的回補質(zhì)粒，后續(xù)會繼續(xù)嘗試獲得回補株，并檢測回補株的表型和毒力。

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（責(zé)任編輯：邊書京）

基金項目：武漢市知識創(chuàng)新專項-基礎(chǔ)研究項目（2023020201010103）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項（2662023PY021）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-46）；國家自然科學(xué)基金面上項目（32173015）；嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實驗室科研項目（NT2021008）