無乳鏈球菌與小鼠巨噬細胞互作轉(zhuǎn)錄組測序分析

摘要 巨噬細胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，但無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）卻能在巨噬細胞內(nèi)存活并以巨噬細胞為載體入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)。為解析無乳鏈球菌在巨噬細胞內(nèi)的存活機制，將無乳鏈球菌HN016 與RAW264.7 共孵育，提取胞內(nèi)細菌RNA 后進行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）、Gene Ontology（GO）及Kyotoencyclopedia of genes and genomes（KEGG）富集分析；于體外將HN016 與羅非魚原代巨噬細胞孵育，提取胞內(nèi)細菌RNA，并利用quantitative real-time PCR（qPCR）驗證目標基因（包括：sip、fbsA、cylB、cylD、cylE、neuA、cpsB 和cfb）表達情況。結(jié)果顯示，與無處理組相比，共篩選到1 215 個差異表達基因（DEG），其中896 個上調(diào)基因，319個下調(diào)基因。GO 富集結(jié)果顯示，DEG 在分子功能、生物學(xué)過程和細胞組分3 大類中均顯著富集。KEGG 富集結(jié)果顯示，顯著富集通路主要為ABC 轉(zhuǎn)運體、核糖體和群體感應(yīng)等代謝途徑。在DEG 中，篩選到無乳鏈球菌毒力相關(guān)基因27 個，包括fbsA（+8.65）、sip（+6.28）、c ylD（+4.93）和cfb（-4.65）等，并利用qPCR 驗證RNA-seq 結(jié)果，二者數(shù)據(jù)一致。而檢測羅非魚原代巨噬細胞內(nèi)存活細菌的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)其目標基因的表達水平與小鼠巨噬細胞的相似。因此推測，無乳鏈球菌在被巨噬細胞吞入后，巨噬細胞內(nèi)的有害環(huán)境增強了無乳鏈球菌的信號傳導(dǎo)機制，刺激了無乳鏈球菌的能量運輸和對巨噬細胞所產(chǎn)生的次生代謝物代謝的能力，并且提高了毒力相關(guān)基因的表達水平。

關(guān)鍵詞 無乳鏈球菌； 小鼠巨噬細胞RAW264.7； 胞內(nèi)存活； 次生代謝物

中圖分類號 S943 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）06-0307-09

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae），也被稱為B 組鏈球菌（group B Streptococcus，GBS），是一種革蘭氏陽性細菌，具有廣泛的宿主范圍，包括哺乳動物、爬行動物、兩棲動物以及魚類［1］。無乳鏈球菌不僅侵染人類，也會引起養(yǎng)殖魚類尤其是羅非魚的嚴重感染，并且能穿過血腦屏障，入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)［2-3］，導(dǎo)致人類和魚類的嚴重腦膜炎癥狀［4-5］。迄今為止，研究人員提出了無乳鏈球菌的3 種主要入侵策略，包括：經(jīng)細胞（transcellular）、旁細胞（paracellular）和特洛伊木馬（Trojan horse）。其中，特洛伊木馬機制是無乳鏈球菌利用被感染的宿主細胞，突破血腦屏障轉(zhuǎn)移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)［2，6］。

在無乳鏈球菌感染期間，宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生響應(yīng)，趨化因子招募巨噬細胞和中性粒細胞到感染部位，以消除入侵的病原體［7］。在巨噬細胞中，細菌被吞入吞噬體，其中溶酶體形成高度酸性環(huán)境，并產(chǎn)生抗菌肽、活性氧和活性氮等物質(zhì)，以殺死細菌［8-9］。有研究者認為化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）在吞噬細胞中的生存是該病原菌建立感染的一個重要機制［10］。此外，也有研究證明巨噬細胞在單核細胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）經(jīng)血傳播到腦內(nèi)皮細胞時充當(dāng)載體，然后進一步傳播李斯特菌到腦實質(zhì)中［11］。根據(jù)已有研究報道，無乳鏈球菌能夠在巨噬細胞內(nèi)存活一定時間，并利用莢膜多糖、雙組份系統(tǒng)CovS/CovR 等抵抗巨噬細胞內(nèi)的惡劣條件，提高細菌的胞內(nèi)存活率［12-13］。然而，無乳鏈球菌的胞內(nèi)存活機制目前尚未完全明了。因此，解析無乳鏈球菌在巨噬細胞內(nèi)的存活機制，對明確無乳鏈球菌的入腦過程和致病機制至關(guān)重要。

本研究以小鼠巨噬細胞RAW264.7 為模型，利用二代測序法鑒定無乳鏈球菌在巨噬細胞胞內(nèi)存活過程中產(chǎn)生差異性表達的基因，并用羅非魚原代巨噬細胞驗證小鼠巨噬細胞結(jié)果，旨在為解析無乳鏈球菌的巨噬細胞胞內(nèi)存活機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和細胞

無乳鏈球菌HN016 菌株于2010 年在廣州分離自發(fā)病的羅非魚體內(nèi)，其基因組序列己上傳至Gen‐Bank 數(shù)據(jù)庫，登錄號為CP011325.1。無乳鏈球菌用THB 液體/固體培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)。小鼠巨噬細胞RAW264.7 由筆者所在實驗室用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2傳代保存。

1.2 試劑

THB 培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素購自Gibco 公司；Percoll 白細胞分離液購自GE Healthcare公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT Kit）購自TaKaRa 公司；實時熒光定量PCR 檢測試劑盒（SYBR premix Ex TaqTM Kit）購自北京擎科生物技術(shù)有限公司；試驗中所用引物均由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.3 轉(zhuǎn)錄組樣品制備

將無乳鏈球菌HN016 培養(yǎng)至對數(shù)生長期，PBS清洗2 遍后重懸于DMEM 培養(yǎng)基，以MOI=10 向RAW264.7 細胞孔板中加入菌液，1 500 r/min 離心5 min 使得細菌與細胞充分接觸，于37 ℃、5% CO2條件下孵育1 h。孵育后，移去培養(yǎng)基，加入含青霉素（5 μg/mL）-鏈霉素（100 μg/mL）雙抗的DMEM 培養(yǎng)基孵育1 h 以殺滅胞外細菌，后用PBS 清洗2 遍，加入滅菌去離子水常溫裂解20 min，直至于顯微鏡下觀察到細胞發(fā)生膨脹破裂，釋放胞內(nèi)細菌。取適量裂解液稀釋涂板計數(shù)菌量，剩余裂解液6 000 r/min 離心10 min 收集菌體。另取等量細菌加入無細胞的孔板內(nèi)作為無處理組，同樣條件下孵育2 h 后，直接6 000r/min 離心10 min 收集菌體，于-80 ℃保存。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

從菌體樣品中提取總RNA，利用Nanodrop 2000對所提RNA 的濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。去除rRNA，從總RNA 中分離出mRNA，隨后將純化得到的mRNA 片段化并作為模板，利用隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。在進行第二鏈合成時，dNTP 試劑中用dUTP 代替dTTP，使cDNA 第二鏈中堿基包含A/U/C/G。雙鏈的cDNA 結(jié)構(gòu)為黏性末端，加入End Repair Mix 補成平末端，隨后在3′末端加上1 個A 堿基，用于連接Y 字形的接頭。在PCR 擴增前，用UNG 酶將cDNA第二鏈消化，從而使文庫中僅包含cDNA 第一鏈。經(jīng)檢測合格的文庫再通過Truseq SBS Kit（300 cycles）（Illumina）二代測序平臺進行測序。

1.5 序列組裝

利用Trimmomatic 軟件，去除接頭序列、低質(zhì)量讀段序列及長度過短序列，得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。利用Rockhopper 軟件，將質(zhì)控后得到的高質(zhì)量測序序列以HN016 菌株基因組（CP011325.1）為參考進行比對，使測序序列定位到基因組。

1.6 差異表達分析

采用RPKM（reads per kilobase of transcript permillion reads mapped）計算基因表達量。利用edgeR篩選差異表達基因（differentially expressed gene，DEG），篩選標準為|log2（fold change）| ≥1 和P≤0.05。使用軟件Goatools（https：//github.com/tanghaibao/GOatools）進行GO 富集分析；使用KOBAS（http：//kobas. cbi. pku. edu. cn/kobas3/？ t=1）進行KEGG PATHWAY 富集分析，P≤0.05 則認為是顯著富集。

1.7 毒力相關(guān)差異表達基因聚類分析

將篩選得到的DEG 與毒力因子數(shù)據(jù)庫VFDB（http：//www.mgc.ac.cn/VFs）進行比對，篩選與無乳鏈球菌毒力相關(guān)的DEG。

1.8 羅非魚原代巨噬細胞吞噬試驗

（1）配制Percoll 溶液（以10 mL 體積為例）。34% Percoll 溶液：3.4 mL Percoll、5.59 mL dH2O、1 mL HBSS （10×）和25 μL Heparin （104 U/mL）；51% Percoll 溶液：5.1 mL Percoll、3.89 mL dH2O、1 mL HBSS （10×）和25 μL Heparin （104 U/mL）；（2）制備34% Percoll-51% Percoll 分層：向15 mL 離心管中加入4 mL 34% 的Percoll 溶液，然后在溶液底部緩慢加入4 mL 51% Percoll 溶液，注意不要擾動界面；（3）取出羅非魚頭腎，用剪刀剪成1 mm3 的碎塊，將組織碎塊轉(zhuǎn)移到100 μm 細胞篩網(wǎng)中，用5mL 注射器活塞輕輕按壓組織碎塊，按壓過程中緩慢加入DMEM 培養(yǎng)基，使單個細胞通過100 μm 細胞過濾器；（4）水平離心機4 ℃ 1 500 r/min 離心30min（注意：離心機的加速度和減速度均應(yīng)設(shè)為0）；（5）收集3～4 mL 處于34% Percoll-51% Percoll 界面的白細胞，轉(zhuǎn)移入15 mL 離心管，加入6 mL 含肝素鈉的DMEM 培養(yǎng)基，混勻后4 ℃ 1 500 r/min 離心10min；重復(fù)1 次；（6）加入含有2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，重懸細胞，用血球計數(shù)板調(diào)整細胞濃度，轉(zhuǎn)移至12 孔細胞板，28 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)，待原代巨噬細胞貼壁之后，移除懸浮細胞和培養(yǎng)液，重新加入新鮮DMEM 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)待用；（7）無乳鏈球菌培養(yǎng)到對數(shù)期后，離心并重新懸浮于含有2% FBS 的DMEM 中；（8）以MOI=10 將細菌接種于羅非魚原代巨噬細胞，1 500 r/min 離心5 min 后于28 ℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h。孵育后，移去培養(yǎng)基，加入含青霉素（5 μg/mL）-鏈霉素（100 μg/mL）雙抗的DMEM 培養(yǎng)基孵育1 h 以殺滅胞外細菌，然后PBS清洗2 遍，加入滅菌去離子水20 min 裂解細胞，釋放胞內(nèi)細菌。（9）利用Trizol 法提取細菌RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后存于-20 ℃冰箱待用。

1.9 實時熒光定量PCR

差異表達基因中進行qPCR（quantitative realtimePCR）驗證。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime‐ScriptTM RT Kit）進行反轉(zhuǎn)錄，SYBR premix ExTaqTM Kit 進行熒光定量PCR，內(nèi)參基因為16SrRNA。qPCR 反應(yīng)體系（20 μL）：模板cDNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR premix ExTaqTM Kit 10μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。試驗獨立重復(fù)3 次，分析方法采用2–ΔΔCt法。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAW264.7 胞內(nèi)存活細菌檢測

裂解RAW264.7 細胞后，取裂解液稀釋涂板，計數(shù)胞內(nèi)存活細菌。結(jié)果顯示，在試驗條件下，RAW264.7 細胞內(nèi)存活細菌量為3.05×105CFU/mL，吞入率為16.31%。說明無乳鏈球菌能夠被RAW264.7 細胞吞入，且能夠在胞內(nèi)存活并保持活性。

2.2 差異表達基因的篩選

經(jīng)Truseq SBS Kit（300cycles）平臺測序，共獲得了36.82 G 數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)錄組各樣本Q20 接近99%，且Q30gt;90%，表明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析（表2）。

采用DESeq 分析發(fā)現(xiàn)，在互作組和無處理組之間，共計有1 215 個DEG。相較于無處理組，互作組中有896 個基因表達量顯著上調(diào)，319 個基因表達量顯著下調(diào)（圖1）。

2.3 差異基因功能注釋與富集分析

DEG 總共匹配到19 個GO 條目，分別是生物進程（biological process）9 類（47.37%）、細胞組分（cellularcomponent）3 類（15.79%）和分子功能（molecularfunction）7 類（36.84%）（圖2）。

對所有DEG 進行GO 富集分析，以獲得其潛在的功能注釋。GO 富集結(jié)果顯示，DEG 主要集中在生物進程，包括細胞蛋白質(zhì)代謝過程（cellular proteinmetabolic process，GO：0044267）、細胞酰胺代謝過程（cellular amide metabolic process，GO：0043603）、酰胺生物合成過程（amide biosynthetic process，GO：0043604）、肽類代謝過程（peptide metabolic process，0006412）（圖3）。

有1 166 條DEG 注釋到KEGG 數(shù)據(jù)庫，分屬于115 個代謝通路，其中注釋序列數(shù)量較多的途徑分別為代謝途徑（metabolism）、遺傳信息處理（genetic informationprocessing）和環(huán)境信息處理（environmentalinformation processing）等通路（圖4）。

KEEG 富集分析顯示，表達上調(diào)的DEG 主要在ABC 運輸工具（ABC transporters，ko02010）、核糖體（ribosome，ko03010）和群體感應(yīng)（quorum sensing，ko02024）等通路顯著性富集（圖5A）；而表達下調(diào)的DEG 主要在糖酵解/糖生成（glycolysis/gluconeogenesis，ko00010）、半乳糖代謝（galactose metabolism，ko00052）和丙酮酸代謝（pyruvate metabolism，ko00620）等通路顯著性富集（圖5B）。

2.4 毒力相關(guān)DEG聚類分析

為探究在巨噬細胞胞內(nèi)存活期間無乳鏈球菌毒力相關(guān)基因的表達水平，將轉(zhuǎn)錄組中DEG 與毒力基因數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選得到27 個無乳鏈球菌毒力相關(guān)DEG，其中22 個基因上調(diào)表達，5 個基因下調(diào)表達（圖6）。這些DEG 可分為以下8 個大類：（1）毒素（toxin），包括：cylE（+3.53）、cylK（ +3.43）、cpsX（ +3.33）、neuA（ +2.92）、cylF（+2.80）、t ig/ropA（+2.68）、cylB（+2.26）、cpsB（+2.20）、cfb（-4.65）、eno（-3.68）、gapdh（-2.44）、psaA（-1.21）和cba（-1.18）；（2）黏附（adherence），包括：fbsA（+8.65）、fbsB（+7.08）、sip（+6.28）、pa?vA（+5.77）和cylX（+5.69）；（3）蛋白酶（protease），包括：cylA（+3.87）和acpC（+3.58）；（4）酶類（enzyme），包括：htrA（+4.35）和cylG（+3.34）；（5）免疫活性抗原（immunoreactive antigen），包括：cylJ（+4.24）和cylI（+3.92）；（6）抗吞噬（antiphagocytosis）：cppA（+5.50）；（7）內(nèi)毒素（endotoxin）：cylD（+4.93）；（8）免疫逃逸（immune evasion）：cylZ（+4.32）。

此外，在非差異表達基因中，比對到18 個無乳鏈球菌毒力基因，包括cpsC～cpsK、groEL、groEL、neuB、rmlA、tuf、galU、rfbD、rmlB、hylB 和rmlC（表3）。

2.5 定量驗證

選擇上述DEG 中的8 個基因（sip、fbsA、cylB、cylD、cylE、neuA、cpsB 和cfb）分別在小鼠傳代巨噬細胞和羅非魚原代巨噬細胞進行定量表達驗證。qPCR檢測結(jié)果顯示，在RAW264.7 內(nèi)存活的無乳鏈球菌中，上述8 個基因的log2 （fold change）分別為+8.44、+7.64、+7.51、+6.14、+5.99、+5.58、+4.08 和-2.69，且表達變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致（圖7A）。在羅非魚原代巨噬細胞內(nèi)存活的無乳鏈球菌中，上述8個基因的log2（ fold change）分別為+8.45、+8.02、+5.86、+7.93、+5.20、+6.45、+3.77 和-3.18，其變化趨勢與小鼠巨噬細胞中的相似（圖7B）。

3 討論

本研究將無乳鏈球菌HN016 菌株與小鼠巨噬細胞RAW264.7 共孵育，待細菌被吞入后，收集胞內(nèi)細菌提取RNA 并進行RNA-Seq。通過差異表達基因分析，發(fā)現(xiàn)無乳鏈球菌在巨噬細胞胞內(nèi)存活期間出現(xiàn)大量的基因表達變化，進一步的GO 和KEGG 功能富集分析結(jié)果表明，DEG 主要在代謝相關(guān)通路顯著性富集。這一結(jié)果與在化膿性鏈球菌、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuisi）和多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）的研究中所發(fā)現(xiàn)的一致，表明在胞內(nèi)存活期間，病原菌多數(shù)上調(diào)表達基因同代謝相關(guān)［14-16］。富集通路包括ABC 運輸體，它可以通過離子和營養(yǎng)物質(zhì)的輸入/輸出來促進細菌的代謝和毒力［17］。這一結(jié)果說明無乳鏈球菌可能通過改變新陳代謝通路來利用外界資源以及適應(yīng)變化的環(huán)境條件。

此外，我們還將DEG 與無乳鏈球菌毒力因子數(shù)據(jù)庫進行比對，發(fā)現(xiàn)了27 個毒力相關(guān)DEG。其中，篩選到的毒力基因cfb 負責(zé)編碼28.4 ku 的蛋白分子CAMP 因子，CAMP 一直被認為是一種重要的致病因子：當(dāng)給兔或小鼠注射純化的CAMP 時，會導(dǎo)致兔或小鼠立即死亡［18-19］。目前，對CAMP 致病機制的理解包括其低聚物能夠在宿主膜上形成離散孔，以及它與糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白的結(jié)合從而促進細胞裂解［20］。該基因的下調(diào)表達表明，在無乳鏈球菌進入巨噬細胞的早期階段（1 h），無乳鏈球菌不會立即分泌CAMP 來裂解細胞，得以在細胞中潛伏一段時間，以“特洛伊木馬”形式突破血腦屏障，進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在無乳鏈球菌中，neuA 與neuB、neuC、neuD 一同編碼唾液酸酶。唾液酸酶能夠特異性地催化和激活無乳鏈球菌莢膜多糖表面的唾液酸，從而抑制補體替代途徑中C3b 在細菌表面的沉積。這種抑制能夠?qū)е戮奘杉毎椭行粤＜毎耐淌勺饔孟陆担M而提高無乳鏈球菌在宿主體內(nèi)的存活率［21-22］。我們推測，neuA 的顯著上調(diào)表達是無乳鏈球菌在與巨噬細胞孵育期間抗吞噬作用的結(jié)果。此外，在篩選到的27 個毒力基因中包含5 個黏附相關(guān)基因，分別是fbsA、fbsB、sip、pavA 和cylX。其中，F(xiàn)bsA 主要被認為可以促進黏附，而FbsB 被證明是入侵人體細胞所必需的［23-24］。而這些黏附相關(guān)基因的顯著上調(diào)表達，原因可能在于細菌與巨噬細胞孵育時間較短，即有些基因在黏附入侵過程中上調(diào)表達，入侵細胞后還未來得及回調(diào)。除DEG 中的毒力相關(guān)基因外，我們在非差異表達基因中也比對到了18 個毒力基因，其中有9 個毒力基因（cpsC～cpsK），它們屬于莢膜多糖合成操作子，而由cps 基因簇編碼的莢膜多糖是無乳鏈球菌的主要毒力因子［25］。有研究者通過對cps 基因簇的插入誘變，構(gòu)建了1 個非包囊突變體（Δcps），Δcps 在羅非魚感染過程中表現(xiàn)出毒力的明顯減弱［26-27］。在本研究中，這9 個cps 基因雖然全部呈上調(diào)趨勢，但其差異并不顯著，我們推測是由于孵育時間較短，無乳鏈球菌還未來得及完全上調(diào)cps 基因簇的表達水平。因此，在后續(xù)的研究中，可以增加多個時間點的檢測，從而更加全面系統(tǒng)地展現(xiàn)無乳鏈球菌在巨噬細胞內(nèi)存活期間轉(zhuǎn)錄組水平的變化情況。

本研究通過RNA-Seq，初步揭示了被小鼠巨噬細胞吞入后無乳鏈球菌轉(zhuǎn)錄組的變化，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞胞內(nèi)壓力影響著無乳鏈球菌的1 215 個基因的表達，這些DEG 顯著富集于一些與代謝、生物合成相關(guān)的GO 類別和KEGG 途徑，這些途徑與無乳鏈球菌的生命活動密切相關(guān)。推測無乳鏈球菌在被巨噬細胞吞入后，巨噬細胞內(nèi)的有害環(huán)境增強了無乳鏈球菌的信號傳導(dǎo)機制，刺激了無乳鏈球菌的能量運輸和對巨噬細胞所產(chǎn)生的次生代謝物代謝的能力，并且提高了毒力相關(guān)基因的表達水平。本研究結(jié)果可為進一步解析無乳鏈球菌在巨噬細胞內(nèi)的存活機制奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：邊書京）

基金項目：嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實驗室科研項目（NT2021008）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-46）