牛支原體凍干保護性物質(zhì)的初步篩選

摘要 為探求牛支原體凍干菌的有效保護性物質(zhì)，利用四因素四水平正交試驗和單因素試驗，通過檢測凍干后牛支原體HB150 的活菌數(shù)，篩選并評價脫脂乳、蔗糖、甘露醇、葡聚糖、海藻糖、尿素、BSA、賴氨酸等物質(zhì)對牛支原體凍干后活菌率的影響，并最終確定不同保護制劑的最佳濃度及配比。結(jié)果顯示，最佳的凍干保護劑配比（m/V）為：脫脂乳15%、蔗糖4.0%、甘露醇4.0%、葡聚糖3.0%、海藻糖2.0%、尿素1.5%、BSA 1.0%、賴氨酸0.3%。該配方于-40 ℃、12 Pa 條件下冷凍干燥20 h，能夠保持牛支原體的最高活菌率，達到（55.2±2.1）%。結(jié)果表明，所篩選的動干保護劑具有較好的保護作用，可以應用于牛支原體的實際凍干操作。

關鍵詞 牛支原體； 冷凍干燥； 保護劑； 正交試驗； 疫苗

中圖分類號 S852.62 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）06-0282-07

牛支原體（Mycoplasma bovis）是牛呼吸道疾病綜合征的主要病原體之一［1］，能夠引起牛的支氣管肺炎、關節(jié)炎、生殖道疾病等多種癥狀，致死率可高達50%［2］，給全球養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失［3］。2008 年我國首次在湖北省新購牛群中具有呼吸道疾病癥狀牛體內(nèi)分離鑒定到該病原，隨后全國多個地方報道了運輸應激誘發(fā)的牛支原體肺炎和新生犢牛的牛支原體肺炎［4］。隨著牛支原體對抗生素耐藥性的逐年上升［5］，該病的防治也越來越困難。疫苗免疫成為了預防和控制牛支原體病的重要手段。為預防該病，筆者所在課題組前期已開發(fā)出了牛支原體減毒活疫苗（HB150 株），臨床試驗證實具有較好的保護效力，但如何保持疫苗株凍干后的高存活率成為問題。

凍干保護劑是疫苗研發(fā)過程中的重要組成部分。有效的凍干保護劑可以改變生物制品由于冷凍干燥時的物理、化學環(huán)境所帶來的菌體傷害，盡可能保持原有的生理、生物活性。目前常用的凍干保護劑成分主要有脫脂奶、山梨醇、甘油、海藻糖、谷氨酸鈉、蔗糖、乳糖、抗壞血酸、甘露醇等［6-8］。

本研究以海藻糖、蔗糖、脫脂奶、山梨醇、尿素、牛血清白蛋白等16 種物質(zhì)為基礎，利用正交試驗、單因素試驗［9］，以牛支原體凍干后的存活率為指標，對牛支原體疫苗株冷凍干燥時起保護性作用的物質(zhì)進行評價，并確定最佳濃度配比，旨在篩選牛支原體疫苗株在凍干條件下的有效保護性物質(zhì)，并為后期牛支原體凍干疫苗株HB150 的生產(chǎn)提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1）牛支原體HB150 株。由華中農(nóng)業(yè)大學反芻動物病原研究室制備并保存。

2）PPLO 液體培養(yǎng)基。PPLO Broth 10.5 g，酵母浸出物2.5 g，丙酮酸鈉0.5 g，純水定容至500 mL，121 °C 滅菌15 min 后，加入無菌馬血清50 mL，10 ×MEM 5 mL，青霉素鈉溶液 5 mL（8 萬 IU/ mL），1%酚紅溶液0.5 mL。

3）PPLO 固體培養(yǎng)基。在PPLO 液體培養(yǎng)基的基礎上，加1.5% 瓊脂。

4）保護劑配料。海藻糖、葡聚糖、山梨醇為阿拉丁試劑（上海）有限公司產(chǎn)品；尿素、蔗糖，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；脫脂乳、甘露醇為BioFroxx公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白為biosharp 公司產(chǎn)品；賴氨酸為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 菌種的制備

1）牛支原體HB150 株菌液的制備。將保存的牛支原體接種于PPLO 液體培養(yǎng)基中，于5% CO2、（37.0±1.0） ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h 復壯后，再按1∶100 比例接種于PPLO 液體培養(yǎng)基，于5% CO2、（37.0±1.0） ℃條件下厭氧靜置培養(yǎng)40～44 h，保存菌液備用。

2）凍干菌粉的制備。將培養(yǎng)后的牛支原體菌液，于4.0 ℃、12 000 r/min 條件下離心30 min，收集沉淀，分別于含有不同組分的候選凍干保護劑中重懸。將重懸后的菌液分裝后置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥20 h，得到凍干菌粉。隨機抽取3 瓶檢測有效活菌數(shù)，計算存活率。

1.3 活菌數(shù)檢測

采用PPLO 固體平板計數(shù)法計算活菌數(shù)。將凍干前菌液做10 倍梯度稀釋，分別從10-4、10-5、10-6稀釋度各取100 μL 接種于PPLO 固體培養(yǎng)基上，于5% CO2、（37.0±1.0） ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后，取菌落數(shù)在20～200 個的稀釋度進行計數(shù)；凍干后的菌粉用生理鹽水恢復至凍干前體積，計數(shù)方法同上。

凍干后活菌率計算方法：活菌率=凍干后2 mL菌懸液的活菌總數(shù)/凍干前2 mL 菌懸液的活菌總數(shù)×100%。

1.4 凍干保護劑篩選及凍干保護程序

1） 凍干保護劑主成分的篩選。為研究不同質(zhì)量/體積的海藻糖、葡聚糖、蔗糖和脫脂乳對牛支原體HB150 株凍干后細菌存活能力的影響，設計四因素四水平正交試驗，各因素水平如表1 所示。

依據(jù)表1，利用SPSSAU 系統(tǒng)得到海藻糖、葡聚糖、蔗糖和脫脂乳的四因素四水平正交設計表，如表2 所示。

將不同保護性物質(zhì)依照表2 進行配比后，制備用于凍干的保護劑配方，與菌株混合，制備凍干菌粉。計算凍干菌粉的活菌率，最高值所對應的組合為最佳主成分配比。

2） 凍干保護劑輔成分的篩選。依據(jù)正交試驗（材料與方法中“1.4”）的結(jié)果，通過單因素試驗在所確定的主成分配比的基礎上，逐步按比例添加以下物質(zhì)。

①向主成分中分別添加1%、2%、3%、4%、5%（m/V）含量的山梨醇、甘露醇和1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%（m/V）的聚乙二醇8000，與菌株混合，凍干后計算活菌率。對比這3 種醇類物質(zhì)的凍干保護效果，確定最佳保護性物質(zhì)及配比。

②在添加醇類物質(zhì)的基礎上，分別添加1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0% （m/V）的半乳糖和0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%（m/V）的尿素以及0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%（m/V）的抗壞血酸，與菌株混合，凍干后計算活菌率。對比半乳糖、尿素和抗壞血酸3 種不同性質(zhì)物質(zhì)對凍干后活菌率的提升效果，確定最佳保護性物質(zhì)及配比。

③在此基礎上再分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%（m/V）的酪蛋白、BSA 和1.0%、1.5%、2%、2.5%（m/V）的NBS，與菌株混合，凍干后計算活菌率。對比這3 種物質(zhì)的凍干保護效果，確定最佳蛋白類的保護性物質(zhì)及配比。

④ 最后分別添加0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%（m/V）的甘氨酸、賴氨酸和精氨酸，凍干后計算活菌率；對比3 種物質(zhì)的凍干保護效果，確定最佳氨基酸類的保護性物質(zhì)及配比。最終確定輔成分及其最佳配比。

3）凍干保護程序。使用筆者所在實驗室常規(guī)凍干保護程序參數(shù)：-40 ℃、12 Pa 條件下冷凍干燥20 h對牛支原體進行凍干。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用單因素方差分析來檢測組間的顯著性差異。采用以下方法判定統(tǒng)計學顯著性：*表示有差異，但不顯著（Pgt;0.05）， **表示存在顯著性差異（Plt;0.01）， ***表示存在極顯著差異（Plt;0.001），****表示存在極極顯著差異（Plt;0.000 1）。誤差條表示平均值的標準誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干保護劑主成分篩選

通過四因素四水平正交設計試驗對凍干保護劑的主成分進行篩選，結(jié)果如圖1 所示， G6 組對應的凍干菌粉的活菌率最高，為（32.7±1.5）%，所對應的成分及配比為4.0% 海藻糖、3.0% 葡聚糖、4.0% 蔗糖及15% 脫脂乳。

計算得到A、B、C 和D 四因素的極差R 依次為10.33、3.48、8.84 和11.41。極差越大表明該因素對活菌率的影響越顯著，因此可知脫脂乳對牛支原體凍干后活菌率影響最大，其次為海藻糖、蔗糖，葡聚糖對凍干后活菌率影響作用最小。k 值為正交試驗各水平下的指標總和，k 值越高表明該因素對活菌率的影響越顯著。由表3 中k 值可知，牛支原體凍干保護劑主成分最佳組合為A1B2C1D4，即2.0% 海藻糖、3.0% 葡聚糖、4.0% 蔗糖、15% 脫脂乳，將該配方命名為G17。在該配方條件下重復3 次試驗，得到的牛支原體HB150 株凍干后活菌率為（33.6±1.1）%，高于正交試驗組（G6 組）的凍干后活菌率［（32.7±1.5）%］。

2.2 凍干保護劑輔成分篩選結(jié)果

1） 添加3 種不同的醇類物質(zhì)凍干后活菌率。在2.0% 海藻糖、3.0% 葡聚糖、4.0% 蔗糖、15% 脫脂乳的基礎上，逐一添加不同含量的甘露醇（圖2A）、山梨醇（圖2B）和聚乙二醇8000（圖2C），結(jié)果顯示，添加4% 的甘露醇和山梨醇凍干后活菌率最高，分別為（35.4±1.2）%和（32.7±0.7）%；聚乙二醇8000 的添加量與活菌率呈負相關，在1% 時活菌率最高，為（24.1±1.3）%。表明3 種醇類物質(zhì)中4.0% 甘露醇對牛支原體凍干保護效果好于4.0% 山梨醇和1.0% 聚乙二醇8000，且添加聚乙二醇8000 作為保護性物質(zhì)會降低牛支原體凍干保護效率。

2） 添加不同含量的半乳糖、尿素和抗壞血酸的牛支原體凍干后活菌率。在2.0% 海藻糖、3.0% 葡聚糖、4.0% 蔗糖、15% 脫脂乳、4.0% 甘露醇的基礎上，添加不同含量的半乳糖（圖3A）、尿素（圖3B），結(jié)果顯示，牛支原體凍干后2.0% 半乳糖凍干后活菌率最高，為（33.6±1.2）%，與本文“2.2 1）”中添加4.0%甘露醇凍干后保護效果無差異（Pgt;0.05）；1.5% 的尿素凍干后活菌率為（44.1±1.6）%，較其他含量的尿素凍干保護效果更好。而添加抗壞血酸（圖3C）的保護劑配方凍干后活菌率在抗壞血酸占比為1.2%時，活菌率最高僅為（24.6±2.4）%，繼續(xù)增加抗壞血酸的比例，則會導致制品溶液產(chǎn)生絮狀物，改變原有凍品的物理性狀，進而降低制品中牛支原體的活菌率。

3）添加3 種不同的蛋白類物質(zhì)凍干后活菌率。在1.5% 尿素、2.0% 海藻糖、3.0% 葡聚糖、4.0% 蔗糖、15% 脫脂乳、4.0% 甘露醇的基礎上，添加不同含量的蛋白類保護性物質(zhì)，凍干后結(jié)果顯示：1.0%BSA（圖4A）凍干活菌最高為（52.3±1.8）%；0.5%酪蛋白（圖4B）凍干活菌最高為（32.5±1.5）%；2.0%NBS（圖4C）活菌率凍干活菌最高為（35.9±2.1）%。酪蛋白和NBS 的對牛支原體的凍干保護效果不如BSA。

4）添加3 種不同的氨基酸類物質(zhì)的牛支原體凍干后活菌率。在1.0% BSA、1.5% 尿素、2.0% 海藻糖、3.0% 葡聚糖、4.0% 蔗糖、15% 脫脂乳、4.0% 甘露醇的基礎上，繼續(xù)添加含量為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5% 的甘氨酸（圖5A）、賴氨酸（圖5B）和精氨酸（圖5C），凍干后計算活菌率；其中添加0.3% 甘氨酸、0.3% 賴氨酸、0.6% 精氨酸活菌率最高，分別為（47.2±3.0）% 、（55.2±2.1）% 和（36.9±1.0）% 。綜上所述，在本文“2.2 3）”的配方基礎上添加0.3% 的賴氨酸能夠最顯著提高牛支原體的凍干后活菌率。

2.3 最佳凍干保護劑配方對凍干物外形的影響及其保護效果的穩(wěn)定性

根據(jù)上述試驗結(jié)果，我們初步確定了牛支原體凍干保護劑的最佳配方，為15% 脫脂乳、4.0% 蔗糖、4.0% 甘露醇、3.0% 葡聚糖、2.0% 海藻糖、1.5% 尿素、1.0% BSA、0.3% 賴氨酸。用該配方進行牛支原體凍干，凍干物外觀呈淡黃色海綿狀疏松團塊，易與瓶身脫離（圖6）。

確定牛支原體最佳保護劑配方即15% 脫脂乳、4.0% 蔗糖、4.0% 甘露醇、3.0% 葡聚糖、2.0% 海藻糖、1.5% 尿素、1.0%BSA、0.3% 賴氨酸后，將牛支原體凍干物置于-20 ℃存放，以確定凍干保護劑保護效果的穩(wěn)定性。在凍干后30、90、180 d，分別隨機取3 瓶凍干的牛支原體進行計數(shù)，結(jié)果如表4 所示，凍干后活菌率在180 d 內(nèi)隨著時間變化基本無衰減，證明我們篩選出的牛支原體最佳凍干保護劑組合具有較高的穩(wěn)定性。

3 討論

添加不同類型的保護劑可有效提高牛支原體HB150 株凍干后的存活率，推測凍干保護劑對菌株微環(huán)境的調(diào)節(jié)、降低菌體凍干損傷、提高菌體抗凍能力等有關。研究發(fā)現(xiàn)，糖類物質(zhì)能在冷凍過程中增加蛋白質(zhì)自由能從而抑制蛋白變性，又能在干燥脫水過程中取代蛋白質(zhì)與水分子間的氫鍵來穩(wěn)定蛋白，并且不含還原基，不會使生物制品發(fā)生蛋白質(zhì)褐變反應從而變質(zhì)失活［10］；但葡聚糖、聚乙二醇8000這2 種聚合物類保護劑在牛支原體的冷凍干燥中的作用并不明顯［11］，且新生牛血清（NBS）的保護效果不如同為聚合物的牛血清白蛋白（BSA）保護效果明顯。

多羥基醇能與菌體細胞膜的自由基通過水合作用降低游離水含量，減少低溫下晶核的形成，穩(wěn)定磷脂雙分子層和膜蛋白結(jié)構，增加細胞的穩(wěn)定性，從而起到保護作用［12］。山梨醇與甘露醇互為同分異構體，在本研究中，添加甘露醇作為牛支原體凍干保護性物質(zhì)對提升凍干后活菌率的效果較山梨醇明顯。

尿素作為低溫保護劑，能夠減緩凍品溫度降低速度，有效保護活菌；抗壞血酸作為抗氧化劑在凍干過程中能夠防止制品中的有效成分在冷凍干燥過程中發(fā)生氧化變性，從而保護菌體內(nèi)的酶活性［12］，但抗血酸添加量超過1.2% 時，制品溶液產(chǎn)生絮狀物，物理性狀發(fā)生改變，導致凍品中牛支原體的活菌率降低。

半乳糖作為凍干保護劑的一種，在制品脫水干燥過程前就已經(jīng)開始發(fā)生不可逆變性，在本研究中作為牛支原體保護劑只能提供十分有限的保護效力。因此，筆者設想使用蛋白類保護性物質(zhì)，通過提高制品溶液中的蛋白濃度來降低牛支原體在冷凍干燥中的死亡率。BSA 作為一種球蛋白，在凍干過程中作為填充劑為凍干制品提供支撐，本研究結(jié)果表明，相比酪蛋白和NBS，BSA 在牛支原體凍干過程中顯示出最好的保護效果。另外，對于凍干保護劑中添加的氨基酸類物質(zhì)，本研究中使用的賴氨酸較甘氨酸、精氨酸能更好地控制凍干制品在冷凍干燥過程中溶液pH 的變化，從而維持凍干制品的活性。

本研究通過正交試驗設計對凍干保護劑的主成分進行了篩選，發(fā)現(xiàn)保護劑主成分對牛支原體凍干后存活率的影響順序分別為：脫脂乳gt;海藻糖gt;蔗糖gt;葡聚糖。通過單因素試驗分析12 種不同物質(zhì)對牛支原體凍干后活菌率的影響，篩選到甘露醇、尿素、BSA 等幾種對牛支原體凍干后活菌率有明顯提升作用的輔助物質(zhì)成分，并確定了在主成分上添加4.0% 甘露醇、1.5% 尿素、1.0% BSA 以及0.3% 賴氨酸，最終凍干后活菌率能夠達到（55.2±2.1）%；同時也證實復合保護劑因各種物質(zhì)之間存在互補作用，相比較單一保護劑能擁有更高的保護作用。有其他研究指出，豬肺炎支原體在凍干后6 a 仍能存活［13］；雞敗血支原體和滑膜支原體在凍干后分別獲得了10% 和90% 的存活率［14］，與這些結(jié)果比較，本研究篩選出的凍干保護性物質(zhì)保護牛支原體凍干后達到的存活率處于較高水平，可為后期牛支原體凍干保護劑配方優(yōu)化提供物質(zhì)選擇的理論參考依據(jù)。

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（責任編輯：邊書京）

基金項目：寧夏回族自治區(qū)重點研發(fā)計劃項目（2023BCF01038）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉牛/牦牛）產(chǎn)業(yè)技術體系項目（CARS-37）