高通量快速檢測(cè)技術(shù)在呼吸道病原體檢測(cè)中的研究進(jìn)展

[摘要]"呼吸道傳染病是發(fā)病率較高的一類疾病，病原體檢測(cè)是該類傳染病防治的關(guān)鍵措施之一。高通量快速檢測(cè)技術(shù)可單次檢測(cè)多個(gè)樣品或在同一反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)，具有速度快、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。多重聚合酶鏈反應(yīng)、基因測(cè)序、生物芯片技術(shù)是當(dāng)前在呼吸道傳染病檢測(cè)中應(yīng)用較為廣泛的高通量快速檢測(cè)技術(shù)。本文探討上述3種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)高通量快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展前景進(jìn)行展望。

[關(guān)鍵詞]"高通量快速檢測(cè)技術(shù)；病原體；檢測(cè)；呼吸道傳染病

[中圖分類號(hào)]"R446.5；R51""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.36.025

呼吸道傳染病的發(fā)病率較高，其造成的疾病負(fù)擔(dān)日益加重[1-2]。呼吸道傳染病可通過飛沫、氣溶膠、直接接觸途徑傳播[3]。引發(fā)呼吸道疾病的病原體主要包括細(xì)菌、病毒和支原體等[4-5]；各種病原體引發(fā)呼吸道疾病的臨床表現(xiàn)十分相似，難以區(qū)分[6]。故病原體的快速檢出關(guān)系到患者的隔離和治療措施，進(jìn)而影響患者的康復(fù)效果和疾病的傳播情況[7]。傳統(tǒng)病原體檢測(cè)技術(shù)操作步驟煩瑣、檢測(cè)時(shí)間較長，難以滿足當(dāng)前衛(wèi)生健康工作需求，急需研發(fā)新的病原體高通量快速檢測(cè)技術(shù)。

高通量快速檢測(cè)技術(shù)是一種可單次檢測(cè)多個(gè)樣品或在同一設(shè)備體系中可同時(shí)進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)的技術(shù)，相比于其他檢測(cè)技術(shù)，高通量快速檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯。本文重點(diǎn)闡述多重聚合酶鏈反應(yīng)（multiplex"polymerase"chain"reaction，mPCR）、全基因組測(cè)序（whole"genome"sequencing，WGS）和生物芯片技術(shù)的原理，并分析各自的優(yōu)缺點(diǎn)及當(dāng)前的研究現(xiàn)狀，為今后病原體檢測(cè)領(lǐng)域的快速發(fā)展提供參考。

1""mPCR技術(shù)

mPCR是在同一聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase"chain"reaction，PCR）體系里加入兩對(duì)及以上引物并擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的技術(shù)，其反應(yīng)原理、所需試劑和操作步驟與傳統(tǒng)PCR無異。傳統(tǒng)PCR應(yīng)用一對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，僅用于單一病原體檢測(cè)。mPCR既保留傳統(tǒng)PCR特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，又能快速檢測(cè)多種病原體，是一種經(jīng)濟(jì)、高效的檢測(cè)方法[8-11]。在檢測(cè)數(shù)量方面，mPCR通?？蓪?shí)現(xiàn)一個(gè)病原體2～4個(gè)基因或2～4個(gè)目標(biāo)病原體的同時(shí)檢測(cè)，甚至更多。Miringu等[12]開發(fā)一種用于檢出包括肺炎克雷伯菌等11種細(xì)菌的mPCR檢測(cè)方法。另有學(xué)者設(shè)計(jì)一種基于擴(kuò)增子基因組富集的mPCR高通量引物及能創(chuàng)建LRRK2基因編碼區(qū)域的二代測(cè)序（next-generation"sequencing，NGS）面板，并使用該面板研究354個(gè)DNA樣本，其中至少有30個(gè)讀數(shù)覆蓋目標(biāo)區(qū)域97.4%的中位覆蓋率[13]。Oh等[14]研究證實(shí)，應(yīng)用mPCR能快速檢測(cè)（約1h）包括百日咳在內(nèi)的病原體。

雖然mPCR優(yōu)勢(shì)顯著，應(yīng)用廣泛。但諸多因素會(huì)影響mPCR的檢測(cè)結(jié)果[15]；樣品成分較復(fù)雜（如病原體含量低或含有其他物質(zhì)）易導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。當(dāng)前研究方向主要是通過優(yōu)化mPCR的反應(yīng)條件，并與其他技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用以進(jìn)一步完善檢測(cè)體系，提高其在檢測(cè)過程中的有效性與可行性。有學(xué)者提出基于mPCR的呼吸道病毒納米孔測(cè)序快速檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)簡(jiǎn)單快捷，可實(shí)時(shí)獲取擴(kuò)增片段的序列信息，特異性強(qiáng)，靈敏度高[16]。有學(xué)者將mPCR與其他高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合，設(shè)計(jì)適用于人腺病毒亞型全基因組擴(kuò)增的mPCR引物，通過Illumina"NGS技術(shù)進(jìn)行高通量測(cè)序[17]。Zhao等[18]利用嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe"acute"respiratory"syndrome"coronavirus"2，SARS-CoV-"2）非變異體及合成的攜帶SARS-CoV-2變異體的質(zhì)粒核酸序列，建立基于mPCR擴(kuò)增產(chǎn)物單堿基質(zhì)量探針延伸的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜方法，該方法可實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)，解決WGS技術(shù)耗時(shí)、成本高、技術(shù)要求高的問題。為克服mPCR難以區(qū)分死病原體和活病原體的缺陷，有學(xué)者通過加入疊氮溴化乙錠、疊氮溴化丙錠的方式使死病原體的DNA分子在擴(kuò)增時(shí)被抑制，從而提高mPCR檢測(cè)活病原體的準(zhǔn)確率[19]。

2""基因測(cè)序技術(shù)

WGS通過半導(dǎo)體感應(yīng)器對(duì)DNA復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的離子流進(jìn)行檢測(cè)，主要用于對(duì)未知病原體進(jìn)行基因組測(cè)序，可從未知病原體標(biāo)本中快速、低成本檢測(cè)并識(shí)別未知病原體。該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是讀數(shù)時(shí)間更長、樣本制備更簡(jiǎn)單，無須培養(yǎng)，無須進(jìn)行PCR擴(kuò)增，還可實(shí)現(xiàn)單分子測(cè)序。宏基因組二代測(cè)序（metagenomics"next"generation"sequencing，mNGS）技術(shù)可直接利用患者標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)以獲得病原體的基因序列，無須培養(yǎng)、無偏好性、陽性率高。目前，測(cè)序技術(shù)已發(fā)展出長讀測(cè)序、單細(xì)胞基因組學(xué)和納米孔測(cè)序技術(shù)[20]。應(yīng)用廣泛的Illumina測(cè)序平臺(tái)作為NGS技術(shù)的典范，利用邊合成、邊測(cè)序的大規(guī)模并行測(cè)序原理，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定。Heikema等[21]使用Illumina"MiSeq和Oxford"Nanopore"16S"rRNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)59個(gè)鼻拭子進(jìn)行白喉棒狀桿菌測(cè)序，結(jié)果表明Illumina平臺(tái)檢測(cè)鼻腔微生物群細(xì)菌屬的能力與納米孔測(cè)序平臺(tái)相當(dāng)。Winand等[22]使用特征明確的參考樣本，對(duì)第二代（Illumina）和第三代（Oxford"Nanopore"Technologies）測(cè)序技術(shù)的16s靶向基因組學(xué)進(jìn)行比較評(píng)估，結(jié)果表明該技術(shù)能可靠地識(shí)別細(xì)菌屬，快速分析混合樣品而無須任何培養(yǎng)步驟。Illumina公司推出的NovaSeq"6000系統(tǒng)，具有更強(qiáng)的靈活性，可將多種類型的測(cè)序試劑盒與雙流動(dòng)槽模式結(jié)合，實(shí)現(xiàn)高擴(kuò)展性的測(cè)序輸出，匹配從完整基因組測(cè)序到宏基因組學(xué)分析的廣泛應(yīng)用[23]。

相對(duì)于WGS技術(shù)，NGS技術(shù)的成本更低、效率更高，檢測(cè)結(jié)果一致。Yang等[24]采用靶向二代測(cè)序（targeted"next-generation"sequencing，tNGS）技術(shù)檢測(cè)支氣管灌洗液中的肺結(jié)核，結(jié)果表明tNGS技術(shù)的敏感度高、特異性強(qiáng)，在病原體檢測(cè)中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。Murphy等[25]使用+NGS技術(shù)直接檢測(cè)耐藥結(jié)核分枝桿菌，對(duì)55個(gè)結(jié)核分枝桿菌陽性培養(yǎng)物進(jìn)行tNGS檢測(cè)，并將結(jié)果與配對(duì)患者培養(yǎng)物的WGS檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)82%的涂片陽性原發(fā)標(biāo)本生成完整或部分易感性譜，tNGS識(shí)別的抗性突變與WGS一致。Miah等[26]建立一種直接從臨床標(biāo)本中對(duì)流感病毒亞型進(jìn)行測(cè)序的方法，成功對(duì)19個(gè)甲型流感病毒陽性臨床樣本進(jìn)行WGS檢測(cè)，所有片段的覆蓋率為100%，從提取RNA到獲得完成的序列僅需24h。然而有學(xué)者提出，雖然tNGS能檢測(cè)出少數(shù)變異基因序列及檢測(cè)出比焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing，PSQ）更多的靶標(biāo)，但PSQ仍是部分三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的診斷選擇[27]。

納米孔技術(shù)通過在膜的正向和反向分別將陰極和陽極施加到溶液中實(shí)現(xiàn)病原體的檢測(cè)。帶負(fù)電荷的生物分子（如DNA）在施加電壓的電泳力作用下穿過膜上的孔。不同分子通過孔隙轉(zhuǎn)移時(shí)可捕獲不同水平的電流，利用計(jì)算機(jī)輔助工具進(jìn)行病原體檢測(cè)。納米孔測(cè)序技術(shù)具有便于攜帶、實(shí)時(shí)測(cè)序、超長讀數(shù)等優(yōu)點(diǎn)。近年來，納米孔測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速。曹藍(lán)等[28]利用納米孔測(cè)序技術(shù)對(duì)新型重組H3N2禽流感病毒進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該病毒與H5N6禽流感病毒發(fā)生基因重組。納米孔測(cè)序技術(shù)的錯(cuò)誤率較高（5%～20%）[29]。有學(xué)者基于高級(jí)計(jì)算技術(shù)的堿基讀取方法，設(shè)計(jì)增加覆蓋度實(shí)現(xiàn)更高測(cè)序準(zhǔn)確度的方案[30]。綜上，基因測(cè)序技術(shù)具有高精度、高速、低成本解讀等優(yōu)點(diǎn)，但也存在后續(xù)分析困難和設(shè)備高昂的問題，在大規(guī)模推廣應(yīng)用中存在一定難度。

3""生物芯片技術(shù)

基因芯片又稱為DNA微陣列，是分子生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一種重要的體外分子診斷工具[31]?；蛐酒晒潭ㄔ诠腆w玻璃載玻片或硅基片上的微小DNA點(diǎn)組成，可同時(shí)分析數(shù)千個(gè)基因，以探索基因調(diào)控機(jī)制、識(shí)別生物標(biāo)志物和檢測(cè)病原體。由于其具有平行化、自動(dòng)化和微型化優(yōu)點(diǎn)，并可同時(shí)在一張芯片上進(jìn)行多個(gè)目標(biāo)病原體的檢測(cè)，且試劑消耗少等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于不同檢測(cè)環(huán)境中。

生物芯片主要用于傳染病的診斷、治療和預(yù)防，其發(fā)展依賴于傳感化學(xué)、微陣列制造（電子技術(shù)）和信息技術(shù)等多種技術(shù)。生物芯片技術(shù)可直接用于臨床標(biāo)本中耐藥結(jié)核病的診斷[32-33]。采用生物芯片技術(shù)進(jìn)行分枝桿菌種類鑒定研究證明生物芯片技術(shù)可快速鑒定痰標(biāo)本中大多數(shù)分枝桿菌[34]。生物芯片技術(shù)在小型化、便攜式研發(fā)方面發(fā)展較快。Wang等[35]開發(fā)的集成便攜式低成本定制檢測(cè)器和新型微孔陣列生物芯片平臺(tái)，可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)SARS-CoV-2，并在25min內(nèi)實(shí)現(xiàn)比色讀數(shù)?；诩傻倪B續(xù)流PCR和電泳生物芯片原理，Li等[36]制造一種用于快速診斷病原體的便攜式一體化微流控裝置，實(shí)現(xiàn)快速DNA擴(kuò)增和現(xiàn)場(chǎng)PCR產(chǎn)物檢測(cè)，可在2min31s內(nèi)完成擴(kuò)增，3min43s內(nèi)完成PCR產(chǎn)物檢測(cè)。Zhang等[37]報(bào)道的用于直接檢測(cè)RNA的微流控RNA芯片（微芯片原型）具有高特異性（區(qū)分單核苷酸差異）、快速性、準(zhǔn)確性、核酸酶抗性和可重復(fù)使用性等特點(diǎn)。

近年來，生物芯片技術(shù)向電化學(xué)芯片、磁光芯片、化學(xué)蝕刻方面發(fā)展，進(jìn)一步提高芯片技術(shù)的檢測(cè)效率。Manickam等[38]介紹一種用于高性能分子檢測(cè)的互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體集成電化學(xué)生物芯片，可進(jìn)行基于陣列的DNA檢測(cè)分析及DNA熔解分析和實(shí)時(shí)無標(biāo)記DNA雜交檢測(cè)。Chen等[39]開發(fā)一種基于γ-Fe2O3@Au核/殼磁性納米顆粒的Cotton-Mouton效應(yīng)的磁光生物芯片，用于檢測(cè)SARS-CoV-2，整個(gè)測(cè)試時(shí)間僅需50min。Gogianu等[40]開發(fā)的檢測(cè)平臺(tái)，使用一部納米銀催化刻蝕法在硅納米線基底上組裝3D微陣列芯片，可實(shí)現(xiàn)最佳信號(hào)強(qiáng)度（4.303，3.7）和變異系數(shù)（3.12%，2.59%），該平臺(tái)在DNA檢測(cè)方面有巨大潛力。

雖然生物芯片在病原體檢測(cè)方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，但現(xiàn)有的單個(gè)生物芯片檢測(cè)敏感度低、重復(fù)性差、分析范圍窄，需要進(jìn)行技術(shù)集成才能大規(guī)模運(yùn)用。芯片傳感器和低功耗數(shù)據(jù)傳輸?shù)南拗谱璧K生物芯片技術(shù)的發(fā)展[41]。

4""小結(jié)與展望

高通量快速檢測(cè)技術(shù)作為一種新型技術(shù)，具有傳統(tǒng)檢測(cè)方法沒有的優(yōu)勢(shì)，成為病原微生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。各種檢測(cè)方法各有利弊，仍處于完善階段。在今后的發(fā)展過程中，需解決以下問題：第一，病原體含量較低。多數(shù)情況下，樣品中病原體含量很低，且存在其他干擾成分，需對(duì)樣品進(jìn)行前處理或培養(yǎng)。傳統(tǒng)方法培養(yǎng)時(shí)間較長，因此需開發(fā)一批可快速富集多種目標(biāo)病原體的培養(yǎng)基，這是實(shí)現(xiàn)高通量快速檢測(cè)的關(guān)鍵。第二，區(qū)分假陽性/陰性結(jié)果。在病原體檢測(cè)過程中，已死亡無活性的病原體仍可被檢出，以致出現(xiàn)假陽性。有些亞致死細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后未修復(fù)，導(dǎo)致無法檢出，以致出現(xiàn)假陰性。因此，需要對(duì)現(xiàn)有方法進(jìn)行改進(jìn)以有效區(qū)別有無活性的病原體，從而避免檢測(cè)中出現(xiàn)假陽性/陰性結(jié)果，進(jìn)一步提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。第三，提高定量分析準(zhǔn)確度。很多檢測(cè)技術(shù)僅能進(jìn)行半定量或相對(duì)定量分析，而目標(biāo)病原體的快速準(zhǔn)確定量分析則與疾病的后續(xù)處置密切相關(guān)。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，呼吸道病原體的高通量快速檢測(cè)必將成為現(xiàn)實(shí)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–08–28）

（修回日期：2024–12–10）