肝豆補腎湯通過激活ERK信號通路減少Wilson病TX小鼠異常精子生成并促進(jìn)生精細(xì)胞增殖

關(guān)鍵詞：Wilson ??；肝豆補腎湯；銅沉積；ERK信號通路；精子發(fā)生

Wilson ?。╓D）又名肝豆?fàn)詈俗冃?，是一種由ATP7B基因突變引起的銅代謝異常的常染色體隱性遺傳?。?， 3］。ATP7B主要在肝臟中表達(dá)，正常情況下通過膽汁促進(jìn)體內(nèi)過量銅的排泄。由于ATP7B功能障礙，WD患者體內(nèi)銅沉積過多。近年來，WD導(dǎo)致生殖系統(tǒng)損害的問題逐漸引起重視。研究指出，WD女性患者的異常妊娠結(jié)局中自然流產(chǎn)最為常見，其中未經(jīng)治療的患者中更容易觀察到自然流產(chǎn)，即使成功分娩也存在出生缺陷［4， 5］。男性患者則會出現(xiàn)性腺功能低下、乳房發(fā)育、陽萎、不育等癥狀［6， 7］。除了生殖內(nèi)分泌方面的變化，在WD男性患者身上還存在少精、弱精、生育力下降等問題［8］。研究表明，銅在男性生殖中起著特殊作用，性腺中銅過載會使精子質(zhì)量惡化并干擾生殖功能，并可能通過自噬、氧化應(yīng)激及生精細(xì)胞凋亡損傷睪丸［9-11］。目前，WD的主要治療方法是使用金屬螯合劑從體內(nèi)清除過量的銅；盡管WD的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療對一些患者有效，但目前療法存在局限性。約50%的WD患者在治療期間仍會出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，甚至惡化情況［12］。約1/3 的WD患者出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)，青霉胺被用作有癥狀的WD患者的一線治療藥物［13］，反而存在更多的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、皮疹、發(fā)熱甚至系統(tǒng)性紅斑狼瘡等［14， 15］?？紤]到后代的健康，由WD引起的生殖障礙的男性患者需要更安全的藥物。

課題組前期對WD患者進(jìn)行大樣本證候?qū)W調(diào)查顯示，該病主要證候為瘀血、痰濁，與濕熱密切相關(guān)，痰瘀互結(jié)為其主要病因病機，也是其發(fā)病的核心證候［16］。臨床和動物實驗研究表明［17-19］，由我院自主研發(fā)的肝豆靈片/湯可通過促進(jìn)WD患者及模型小鼠尿銅排泄、改善肝腎功能和腦血管損傷、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化等作用治療WD并且療效顯著。但WD臨床癥狀復(fù)雜，僅通過臨床表現(xiàn)和生理或生化檢查進(jìn)行診斷會忽視生殖系統(tǒng)損害。本課題組前期通過中醫(yī)證候?qū)W調(diào)查發(fā)現(xiàn)，WD伴男性生殖損害的中醫(yī)病因病機可總結(jié)為腎虛為本，痰濕、瘀血為標(biāo)［16， 20］。腎藏精，主生殖，只有腎氣充實，生長發(fā)育、生殖功能才能正常，基于以上調(diào)查研究及“腎主生殖”理論，我們在肝豆靈的基礎(chǔ)上添加了補腎藥物治療WD患者合并生殖功能障礙。我們前期進(jìn)行的臨床及基礎(chǔ)實驗研究發(fā)現(xiàn)GDBSD可以有效改善WD生殖系統(tǒng)的損害［8， 21-25］。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路是細(xì)胞增殖和凋亡信號網(wǎng)絡(luò)的核心［26， 27］，在精原干細(xì)胞周期性活動期間，ERK信號通路被周期性激活，以維持精原干細(xì)胞的增殖和分化［28， 29］。ERK信號通路的異常會嚴(yán)重?fù)p害睪丸功能，從而影響男性生殖。有研究指出，長期銅暴露可誘導(dǎo)動物睪丸組織損傷，引起細(xì)胞凋亡并影響生殖功能［30］。因此，減少睪丸組織中的凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖可能是治療WD男性生殖障礙的基本策略之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，WD銅沉積可能通過抑制ERK信號通路誘導(dǎo)下丘腦-垂體組織細(xì)胞凋亡從而影響生殖激素水平，進(jìn)而導(dǎo)致WDTX小鼠的生育能力下降，而GDBSD可以逆轉(zhuǎn)WDTX 小鼠下丘腦-垂體-性腺軸的損害情況［21， 22， 31］。臨床研究也證明，GDBSD可以明顯改善WD患者的生殖損害［23-25］。然而，除了垂體源性影響外，目前尚不明確中醫(yī)藥治療該病對睪丸、附睪組織、精子發(fā)生過程以及生育力的影響，以及ERK信號通路在這一過程中的作用機制。故本研究通過U0126抑制劑的干預(yù)，推測WD模型TX小鼠銅穩(wěn)態(tài)失衡可能通過ERK信號通路直接損傷其睪丸組織及精子發(fā)生異常。本實驗基于ERK信號通路研究GDBSD對銅沉積誘導(dǎo)的WD雄性TX小鼠睪丸精子發(fā)生異常的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

4周齡WDTX小鼠購自杰克遜實驗室（美國）。將60只純合雄性TX小鼠（體質(zhì)量20±5 g）隨機分為4組：WD模型、青霉胺組、GDBSD組、GDBSD+U0126組（n=15），并以15只正常DL小鼠（20±5 g）為對照組。每組小鼠都關(guān)在單獨通風(fēng)的籠子，并允許自由出入，動物房溫度控制在20～25 ℃，濕度50%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)至12周齡后進(jìn)行實驗。該實驗經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會審核通過（倫理批號：2024027）。

1.2 實驗藥品

肝豆補腎湯為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（安徽省中醫(yī)院）院內(nèi)制劑，肝豆靈片（皖藥制字：Z20050071），加中藥顆粒劑熟地黃、當(dāng)歸、菟絲子、益母草、杜仲、枸杞子、淫羊藿組成，顆粒劑由廣東一方制藥提供。青霉胺片（0.125 g/粒，國藥準(zhǔn)字：H31022286，上海上藥信宜藥廠有限公司），U0126（cell signaling）。使用方法：DMSO溶解后再以生理鹽水稀釋，可以抑制ERK1/2信號通路的活化。5-溴-2-脫氧尿嘧啶（BrdU，Sigma-Aldrich）。

1.3 方法

1.3.1 分組處理、給藥及取材 GDBSD組每天同一時間給予GDBSD藥液灌胃，0.2 mL/（10 g·d）；青霉胺組以青霉胺藥液灌胃（0.09 g/kg）；WD模型組給予同體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)28 d；GDBSD+U0126 組每天給予GDBSD藥液灌胃0.2 mL/（10 g·d），加每天下午同一時間腹腔注射U0126（20 mg/kg），連續(xù)28 d。實驗結(jié)束前1 d，每組取3 只小鼠分別于早晚各注射1 次BrdU（100 μL/mg）。實驗結(jié)束的次日早晨，小鼠予以1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，眼球取血后，選擇5只/組小鼠，將左側(cè)睪丸組織置入4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定處理；取右側(cè)小塊睪丸組織予以2.5%戊二醛固定制備電鏡切片；取附睪組織取精液檢測精液質(zhì)量并制備精子涂片；另外5只小鼠取出睪丸組織于-80 ℃快速冷凍保存；小鼠右側(cè)附睪組織用4%多聚甲醛固定，制備病理切片，左側(cè)附睪組織予以2.5%戊二醛固定劑（4 ℃預(yù)冷）固定制備電鏡切片。

1.3.2 檢測睪丸組織中的銅含量 將睪丸組織放入燒瓶中，加入硝酸4 mL和高氯酸1 mL浸泡過夜。然后，加入3 mL按4∶1配制的hNO3HCLO4混酸消化液，在電熱板上消化，直至無色透明，并加入少量去離子水去酸。冷卻后，用去離子水定容至10 mL，以等量的混合酸消解液作為消解樣品，空白樣品按同樣方法制備。用銅標(biāo)準(zhǔn)備用溶液配制標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用溶液。將銅元素標(biāo)準(zhǔn)系列、試劑空白溶液和消解樣品溶液導(dǎo)入原子吸收光譜儀重復(fù)測定。

1.3.3 HE染色法觀察小鼠睪丸和附睪的病理結(jié)構(gòu)以及精子結(jié)構(gòu) 用4%多聚甲醛溶液固定附睪24～48 h。石蠟包埋后制成連續(xù)切片，切片厚度為4 μm。切片放入66 ℃干燥箱中烤20～30 min，于二甲苯溶液中脫蠟3次，5 min/次。將切片依次在100%、95%、80%乙醇中復(fù)水3 min。將復(fù)水后的切片投入蘇木素染液（XinleBiotechnology）浸染2～5 min，使用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，蒸餾水沖洗后將切片置于95%乙醇中復(fù)水2 min。將切片置于伊紅染液（Xinle Biotechnology）浸染數(shù)秒后，置于100%乙醇中脫水處理。最后將切片依次浸入苯酚-二甲苯、二甲苯I、II進(jìn)行透明處理2 min，予以中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。染色結(jié)果顯示，蘇木素染成藍(lán)色，胞漿被曙紅染成紅色［28］。

1.3.4 電子顯微鏡觀察睪丸生精細(xì)胞和精子超微結(jié)構(gòu)新鮮睪丸及附睪組織予以2.5%戊二醛固定6～12 h后取出，用PBS液體沖洗干凈， 使用1%鋨酸固定1～2 h。睪丸組織依次經(jīng)過30%、50%的乙醇脫水處理，投入70%乙醇醋酸鈾中進(jìn)行包埋前染色。然后依次使用85%、90%、100%乙醇進(jìn)行脫水處理。脫水后將組織投入環(huán)氧丙烷中處理1～2 h，投入純環(huán)氧樹脂中浸泡2～3 h。經(jīng)純環(huán)氧樹脂包埋后分別在40 ℃、60 ℃烤箱中烤12、48 h。取出包埋塊進(jìn)行切片，切片厚度為70 nm。將干燥完畢帶有樣品的銅網(wǎng)投入3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，通過電子顯微鏡（JEM1400）觀察。

1.3.5 TUNEL法標(biāo)記睪丸組織凋亡細(xì)胞 用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（安徽欣樂生物技術(shù)有限公司）處理組織切片。切片在66 ℃的烘干箱中烘烤20～30 min，然后在二甲苯中浸泡3次，5 min/次。依次用100%、95%、80%乙醇復(fù)水3 min。用蒸餾水和PBS漂洗3 次，加入20 μg/mL不含脫氧核糖核酸酶的蛋白酶K，37 ℃孵育。用TdT酶+熒光標(biāo)記液（TdT酶+熒光標(biāo)記液=1∶9）滴入切片，室溫黑暗孵育60 min，用PBS漂洗3 次。將帶有抗熒光猝滅安裝介質(zhì)（包含DAPI）的切片貼片，用數(shù)字切片掃描儀掃描熒光切片。

1.3.6 免疫印跡檢測細(xì)胞凋亡和ERK信號通路相關(guān)蛋白 睪丸組織用RIPA細(xì)胞裂解緩沖液（Beyotime）裂解，冰浴勻漿，提取總蛋白。根據(jù)TRAKRA產(chǎn)品目錄配置凝膠。將5XSDS-PAGE上樣緩沖液按1：4加入收集的蛋白質(zhì)樣品中，沸水浴中加熱15 min，使蛋白質(zhì)完全變性。在每孔SDS-PAGE膠中加入5～10 μL蛋白質(zhì)樣品。在恒壓80 V條件下，電泳1 h。將與膠條尺寸相同的濾紙和預(yù)切的PVDF膜（ 甲醇中浸泡2～3 min），在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5 min，恒流轉(zhuǎn)膜。加入Western封閉液（5%脫脂奶粉），室溫封閉2 h。分別加入ERK1/2（稀釋比例1∶1000），p-ERK1/2（稀釋比例1∶1000），Cytc抗體（稀釋比例1∶2000），Caspase-3抗體（稀釋比例1∶3000）和Bcl-2 抗體（稀釋比例1∶2000），在4 ℃下封閉過夜。按照1∶1000用二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.2 h。采用ECL發(fā)光試劑盒（德國達(dá)姆施塔特米利波爾）檢測蛋白質(zhì)并通過Image J軟件分析蛋白質(zhì)水平。

1.3.7 免疫組化標(biāo)記BrdU陽性細(xì)胞 按以上方法制備石蠟切片。將組織切片于二甲苯溶液中脫蠟3次，分別于100%、95%、80%的乙醇中復(fù)水3 min，洗去乙醇，直到切片干凈透明?？乖邏盒迯?fù)：在高壓鍋內(nèi)配制2000 mL pH 為6.0 的檸檬酸鹽修復(fù)液。將切片放入3%H2O2中室溫孵育，并分別用蒸餾水、PBS-T沖洗3次。滴加一抗（BrdU），置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育60 min，PBS-T沖洗3 次，滴加二抗，并置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，PBS-T沖洗3次。滴加DAB顯色劑，顯微鏡下控制顯色時間，出現(xiàn)陽性終止顯色，并用蒸餾水沖洗干凈。蘇木素染色2～5 min，水洗干凈；1%鹽酸酒精分化后水洗干凈。碳酸鋰溶液藍(lán)化30 s后水洗干凈。置于100%乙醇脫水，二甲苯透明處理后中性樹膠封片。TUNEL染色后通過顯微鏡觀察結(jié)果。染色結(jié)果：細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽性表達(dá)位置為棕色。運用 Image J 軟件定量檢測各組小鼠睪丸組織內(nèi) BrdU陽性細(xì)胞比例。

1.3.8 精液質(zhì)量檢測 小鼠麻醉處死后，立即取一側(cè)附睪尾放入裝有3 mL生理鹽水的小燒瓶內(nèi)，用眼科剪充分剪碎。將懸液通過4 層濾紙過濾，獲得精子濾液，采用精子分析系統(tǒng)（CASA），放大倍數(shù)為250倍，測量精子參數(shù)。觀察5 個不同區(qū)域來估計精子活力。在精子計數(shù)板上加入少量精子濾液，在40 倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行精子計數(shù)。將精子濾液滴在干凈的玻片上，均勻鋪開，在室溫下自然干燥，伊紅染色后，用光學(xué)顯微鏡在200倍顯微鏡下觀察涂片，并根據(jù)形態(tài)計算精子畸形率。計算公式：

精子活動率（%）=活動精子數(shù)/精子總數(shù)×100%

精子畸形率（%）=畸形精子/精子總數(shù)×100%

1.3.9 生育力實驗 每組取5只雄性小鼠，分別與同代成年育齡正常雌性小鼠按1∶2的比例關(guān)籠飼養(yǎng)。每天早晨觀察雌性小鼠陰道栓的形成。確認(rèn)雌性小鼠懷孕后將雌雄鼠分籠飼養(yǎng)。待成年雌性小鼠生產(chǎn)后，記錄生育率及產(chǎn)仔數(shù)。各組雄性小鼠與雌性成年小鼠至少交配2月。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠睪丸銅含量

WD 模型組小鼠睪丸組織銅含量均高于對照組（Plt;0.05）。經(jīng)過青霉胺治療后，小鼠睪丸銅含量下降，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。GDBSD組小鼠睪丸銅含量低于WD模型組（Plt;0.05），與正常組相比仍有差異。GDBSD+U0126組小鼠睪丸組織銅含量均高于GDBSD組（表1）。

2.2 ERK信號通路驗證

在5 組中未觀察到總ERK 蛋白表達(dá)水平的差異。WD模型組p-ERK蛋白的表達(dá)水平低于對照組（Plt;0.05）。青霉胺處理后，小鼠睪丸組織中p-ERK蛋白表達(dá)水平增加，GDBSD組的蛋白表達(dá)趨勢與青霉胺組一致，GDBSD+U0126 組和WD 組睪丸組織中p-ERK水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05，圖1）。

2.3 小鼠睪丸組織病理形態(tài)和Johnsen評分

對照組的睪丸組織具有完整的生精小管結(jié)構(gòu)，各級生精細(xì)胞正常分布，從外到內(nèi)包括精原細(xì)胞、初級和次級精母細(xì)胞以及精子，緊密而規(guī)則地排列。WD模型組生精小管排列松散、紊亂，細(xì)胞間隙增寬，生精細(xì)胞數(shù)量減少。在青霉胺組和GDBSD組中，睪丸組織中的生精小管結(jié)構(gòu)正常，小管壁的基底膜完整，生發(fā)細(xì)胞排列整齊，生精細(xì)胞的層數(shù)高于WD模型組。GDBSD+U0126組的睪丸組織破壞比GDBSD組更嚴(yán)重，細(xì)胞排列松散，所有生精細(xì)胞水平均有不同程度的降低（圖2A～E）。與對照組相比，WD模型組得分降低，導(dǎo)管腔精子生成減少；青霉胺和GDBSD組的得分明顯高于WD模型組；GDBSD+U0126組的精子改善受到抑制（Plt;0.05，圖2F）。

2.4 精子質(zhì)量分析

對照組附睪內(nèi)細(xì)胞排列緊密，管腔內(nèi)可見大量成熟精子；WD模型組和GDBSD+U0126組僅有少量精子充滿部分空的附睪導(dǎo)管腔；與WD模型組相比，青霉胺組和GDBSD組的附睪導(dǎo)管間隙減小，導(dǎo)管腔內(nèi)可見大量精子，盡管其絕對數(shù)量仍少于對照組；GDBSD +U0126組對增加精子數(shù)量的促進(jìn)作用被抑制（圖3）。

與對照組相比，WD模型組的精子密度和存活率降低，畸形率升高（Plt;0.05）。與WD組比較，青霉胺組小鼠的精子密度和存活率增加，畸形率降低；GDBSD組小鼠精子的數(shù)量和質(zhì)量提高（Plt;0.05）。GDBSD+U0126組改善精子密度、活力和畸形率的效果受到抑制；WD模型組和GDBSD+U0126組的精子存活率和畸形率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

對照組的精子分為頭部和尾部，精子尾部細(xì)長，精子結(jié)構(gòu)正常。其余各組均有不同形態(tài)的異常精子。在WD模型組中觀察到許多尾部卷曲的精子和有頭無尾的精子。青霉胺組和GDBSD組精子結(jié)構(gòu)正常，畸形精子數(shù)量少。GDBSD+U0126組具有大量畸形精子，如尾部卷曲和頭部畸形精子（圖4）。

在對照組中，精子尾部中部的線粒體鞘排列緊密且結(jié)構(gòu)完整。WD模型組的精子結(jié)構(gòu)被破壞，并且觀察到線粒體鞘中段的結(jié)構(gòu)破壞和異常精子頭。青霉胺組和GDBSD組的精子結(jié)構(gòu)總體正常，線粒體鞘排列緊密，線粒體無明顯腫脹，9+2 結(jié)構(gòu)清晰，纖維致密。在精子尾部中部的橫切面中，GDBSD+U0126組的線粒體結(jié)構(gòu)被破壞甚至消失，線粒體鞘不連續(xù)（圖5）。

2.5 小鼠生精細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

對照組精母細(xì)胞中染色質(zhì)均勻，細(xì)胞器豐富，線粒體結(jié)構(gòu)正常。WD模型組顯示線粒體結(jié)構(gòu)顯著腫脹和線粒體嵴消失。用青霉胺和GDBSD處理后，精母細(xì)胞中的線粒體結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，未觀察到明顯的線粒體腫脹。施用U0126阻斷ERK信號通路激活導(dǎo)致精母細(xì)胞中異常線粒體結(jié)構(gòu)增加（圖6）。

2.6 小鼠睪丸組織的細(xì)胞凋亡

WD模型組中凋亡細(xì)胞的數(shù)量高于對照組，用青霉胺和GDBSD治療后，睪丸組織凋亡減少（Plt;0.05）。施用U0126以阻斷ERK信號通路激活后，GDBSD對睪丸組織中細(xì)胞凋亡的抑制作用被逆轉(zhuǎn)，與GDBSD組相比，細(xì)胞凋亡增加（Plt;0.05，圖7）。

與對照組相比，WD模型組睪丸中促凋亡蛋白Cytc和Caspase-3的表達(dá)水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平降低（Plt;0.05）。青霉胺處理后，小鼠睪丸組織中凋亡相關(guān)蛋白Cytc 和Caspase-3 的表達(dá)減少，Bcl-2 的表達(dá)增加（Plt;0.05）。GDBSD組的蛋白表達(dá)趨勢與青霉胺組一致。在給予U0126以阻斷ERK信號通路的激活后，小鼠睪丸組織中Cytc和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平高于GDBSD組，Bcl-2 的表達(dá)減少（Plt;0.05）。TUNEL染色顯示凋亡細(xì)胞的數(shù)量高于GDBSD組，這與蛋白質(zhì)表達(dá)水平的結(jié)果一致（圖8）。

2.7 小鼠睪丸組織中的細(xì)胞增殖

對照組睪丸組織細(xì)胞排列規(guī)則緊密，各級細(xì)胞排列有序，增殖細(xì)胞數(shù)量較多。WD模型組的睪丸組織顯示大量精母細(xì)胞缺失、生精小管空泡化和細(xì)胞增殖減少（Plt;0.05）。GDBSD改善小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)并增加細(xì)胞增殖（Plt;0.05）。盡管青霉胺改善了睪丸組織的結(jié)構(gòu)損傷，但細(xì)胞增殖沒有明顯改善。GDBSD+U0126組抑制了GDBSD對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用（Plt;0.05，圖9）。

2.8 雄性TX小鼠的生育力

比較5組雄性小鼠的生育能力，結(jié)果顯示，與對照組相比，WD模型組其同籠雌鼠妊娠率及產(chǎn)仔率均下降（Plt;0.05）。經(jīng)過GDBSD治療后，其同籠雌鼠妊娠率及產(chǎn)仔率均有一定程度提高，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。GDBSD+U0126 組小鼠其生育能力較GDBSD組有一定程度下降（Plt;0.05，表3）。

3 討論

生殖系統(tǒng)損害可能是WD的首發(fā)癥狀［32］。研究表明，WD的男性患者可能會出現(xiàn)生殖系統(tǒng)損害的癥狀，如陽痿、乳房發(fā)育和不育［33］。并且，患WD的男性精子活力明顯低于未患WD的男性［34］。在生理狀態(tài)下，精子的產(chǎn)生和成熟取決于下丘腦-垂體-睪丸軸的調(diào)節(jié)。對WD男性患者的研究表明，大多數(shù)成年患者對促性腺激素釋放激素、黃體生成素和卵泡刺激素的反應(yīng)降低［33］。WD男性患者通常伴隨功能障礙性HPT。但由于金屬螯合劑的局限性，WD男性的生殖損害亟需更加安全有效的治療藥物。WD男性患者合并生殖損害的中醫(yī)病因病機是以腎虛為本，痰濕、瘀血為標(biāo)［20］。本課題組前期采用本院制劑肝豆靈活血祛瘀散結(jié)的基礎(chǔ)上，加以補腎固本之品，經(jīng)長期臨床及基礎(chǔ)實驗研究，發(fā)現(xiàn)GDBSD可有效改善WD男性的生殖損害［8，22，25］，但目前尚缺乏關(guān)于GDBSD針對WD男性生育能力及性腺靶器官睪丸及精子發(fā)生相關(guān)的機制研究。故本實驗基于前期課題組研究以ATP7B基因缺失的雄性TX小鼠睪丸、附睪組織、精子及生育力為主要觀察對象，進(jìn)一步探究GDBSD對WD除下丘腦-垂體軸外的性腺器官睪丸、附睪及精子發(fā)生的影響及具體機制。

影響精子發(fā)生的重要原因之一是生精細(xì)胞的增殖與凋亡［35］。生精細(xì)胞異常的凋亡，會造成雄性生精功能損傷，包括精子密度及活力的下降。為確定WD對雄性TX小鼠生殖能力的損害及GDBSD是否對其病理形態(tài)及生育能力具有改善作用，我們分別對每組進(jìn)行了睪丸、附睪及精子HE染色、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察、睪丸生精小管Johnson評分、TUNEL染色、免疫組化和精液質(zhì)量檢測。結(jié)果表明，與對照組相比，WD模型組睪丸組織結(jié)構(gòu)破壞，生精細(xì)胞數(shù)量減少，凋亡數(shù)量增多，Johnson評分明顯降低，導(dǎo)管腔精子生成減少，畸形精子增多；青霉胺和GDBSD治療后，小鼠睪丸結(jié)構(gòu)恢復(fù)，細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞增殖增加。Johnson評分有所升高，精子密度和精子活力顯著增加，畸形精子減少。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組小鼠其生育能力受到影響，其同籠雌鼠的妊娠率及產(chǎn)仔率均降低。運用中藥干預(yù)后，可改善小鼠的生育能力，使得其同籠雌鼠的妊娠率及產(chǎn)仔率提高。這證實了WD模型TX小鼠存在睪丸組織結(jié)構(gòu)的破壞、精子發(fā)生異常和生育力的下降，以及GDBSD對TX小鼠睪丸、精子發(fā)生和生育能力的顯著保護(hù)作用。

ERK作為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的關(guān)鍵成員，在細(xì)胞增殖、分化以及凋亡中占有主導(dǎo)地位［26， 27］。研究表明，ERK信號通路參與生殖過程，與生殖系統(tǒng)損傷密切相關(guān)［36-38］。MEK（MAPK激酶/ERK激酶）激活ERK 信號通路并使ERK 磷酸化，被激活的ERK從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核［39］。在睪丸組織中，p-ERK主要存在于精原細(xì)胞、細(xì)線期至粗線期的初級精母細(xì)胞及伸長的精子細(xì)胞核中［40］，可促進(jìn)精子活化活力和頂體反應(yīng)［41］。同時，在初級精母細(xì)胞的減數(shù)分裂［42］和精子成熟［29］中可以看到活化的p-ERK蛋白。值得注意的是，銅沉積可以通過ERK信號通路和線粒體凋亡通路破壞性激素穩(wěn)態(tài)和對人絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞毒性，從而導(dǎo)致顯著的生殖毒性［43］。本課題組前期實驗結(jié)果也顯示，WD銅沉積可能抑制ERK的磷酸化，導(dǎo)致下丘腦神經(jīng)元和垂體細(xì)胞凋亡增加，從而影響生殖激素的釋放及生育能力下降［31］。但在睪丸組織中未有報道。研究發(fā)現(xiàn)，ERK信號通路也與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，并參與調(diào)節(jié)下游凋亡因子（Bax、Caspase-3、Bcl-2）的表達(dá)［44］。本研究發(fā)現(xiàn)，WD模型組相比于對照組睪丸組織銅含量明顯升高，p-ERK蛋白表達(dá)減少，ERK信號通路磷酸化受到抑制，Cytc 和Caspase-3 促凋亡蛋白的表達(dá)增加Bcl-2 抗調(diào)亡蛋白的表達(dá)減少，睪丸HE染色結(jié)果顯示生精小管排列松散、紊亂，細(xì)胞間隙增寬，生精細(xì)胞數(shù)量減少，精子HE染色顯示9+2結(jié)構(gòu)被破壞。這表明銅暴露可能通過抑制ERK的磷酸化而促進(jìn)睪丸生精細(xì)胞凋亡，從而影響精子發(fā)生異常。

本研究已證明GDBSD可改善TX小鼠睪丸損傷及精子發(fā)生異常，研究結(jié)果顯示，經(jīng)青霉胺及GDBSD治療后，與WD模型組相比，睪丸組織銅水平明顯下降，我們推測GDBSD可以減輕銅沉積，從而影響ERK磷酸化水平。故進(jìn)一步探討GDBSD與ERK信號通路的關(guān)系。Western blotting實驗顯示，與WD模型組對比，GDBSD組及青霉胺組促凋亡蛋白Cytc 和Caspase-3 的表達(dá)下調(diào)以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)上調(diào)，且p-ERK蛋白表達(dá)增加，總ERK水平無明顯差異，提示GDBSD可能促進(jìn)ERK磷酸化，從而激活ERK信號通路。因此，我們使用ERK信號通路抑制劑U0126進(jìn)一步明確GDBSD對ERK信號通路的影響。與GDBSD組相比，應(yīng)用U0126后的p-ERK蛋白水平降低，總ERK水平無明顯差異，且觀察到睪丸組織銅含量顯著升高，睪丸組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，提高了Cytc和Caspase-3蛋白水平，降低了Bcl-2蛋白水平，睪丸增殖細(xì)胞數(shù)量較少，檢測到明顯的細(xì)胞凋亡，精子質(zhì)量下降，生育能力也有所降低，GDBSD的治療效果受到抑制。以上結(jié)果進(jìn)一步證明，GDBSD通過激活ERK信號通路可改善WD中銅沉積誘導(dǎo)的睪丸生精細(xì)胞凋亡和增殖狀況及精子發(fā)生異常。

綜上所述，本研究認(rèn)為WD銅沉積可能通過抑制ERK信號通路的磷酸化，促進(jìn)下游促凋亡蛋白Cytc和Caspase-3 的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)，直接損傷睪丸組織，主要表現(xiàn)為生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，細(xì)胞凋亡增多、增殖減少，并誘導(dǎo)精子發(fā)生異常和生育力的下降。GDBSD通過激活ERK信號通路改善睪丸生精細(xì)胞增殖和凋亡狀況，以治療WD銅沉積誘導(dǎo)的雄性TX小鼠異常精子發(fā)生和生育功能。然而，GDBSD治療WD男性生殖的分子機制研究仍有許多未解之謎。接下來將進(jìn)一步探討GDBSD的最優(yōu)劑量和長期療效，并在更大樣本量和臨床試驗中驗證其安全性和有效性，并通過生物信息分析及體內(nèi)外實驗等多種方法進(jìn)一步探究GDBSD治療WD伴男性生殖障礙相關(guān)的分子機制，以及它們是否存在正負(fù)反饋。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)青霉胺及GDBSD對WD的男性生殖損害均具有改善作用，現(xiàn)代研究表明中西醫(yī)結(jié)合治療WD具有良好的效果［45］，西藥與GDBSD聯(lián)合運用或許對于WD的治療效果更佳，這有待進(jìn)一步探索。總之，本研究從細(xì)胞凋亡相關(guān)分子機制角度闡明了GDBSD改善WD雄性TX小鼠睪丸損傷及精子發(fā)生異常的發(fā)病機制，為GDBSD在WD伴男性生殖損害患者中的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，為中醫(yī)藥治療WD提供了新的方向。