減數(shù)分裂重組關(guān)鍵蛋白MMLLHH11結(jié)合蛋白的酵母雙雜交篩選和鑒定

殷 毅平 萍1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，上海市男科學(xué)研究所（上海 200001）2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院嘉定分院泌尿外科

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減數(shù)分裂重組關(guān)鍵蛋白MMLLHH11結(jié)合蛋白的酵母雙雜交篩選和鑒定

殷 毅1,2平 萍1*
1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，上海市男科學(xué)研究所（上海 200001）
2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院嘉定分院泌尿外科

摘要目的 探尋減數(shù)分裂關(guān)鍵重組蛋白MLH1在精子發(fā)生中的結(jié)合蛋白。方法 以MLH1為誘餌，通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)，在小鼠睪丸組織的cDNA文庫(kù)中進(jìn)行篩選，尋找MLH1的相互作用蛋白并通過(guò)GST pull-down和免疫共沉淀的方法進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果 通過(guò)酵母雙雜交的篩選，在小鼠睪丸中經(jīng)四缺板篩出蛋白29個(gè)，包括已知的MLH3和PSM2等。通過(guò)GST Pull-down和免疫共沉淀驗(yàn)證了其中一個(gè)新的蛋白R(shí)HNO1與MLH1的結(jié)合。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RHNO1在睪丸中高表達(dá)，提示RHNO1在精子發(fā)生中具有重要功能。結(jié)論 酵母雙雜交系統(tǒng)是尋找結(jié)合蛋白的有力手段，發(fā)現(xiàn)了新的MLH1結(jié)合蛋白R(shí)HNO1,可能參與了減數(shù)分裂同源重組。

關(guān)鍵詞精子發(fā)生;減數(shù)分裂;重組蛋白質(zhì)類

*通訊作者,E-mail:deer16@126.com

Key woorrddss spermatogenesis;meiosis;Recombinant Proteins

男性不育是影響人類健康的重大疾病，減數(shù)分裂中同源重組異常是睪丸生精功能障礙的重要原因[1]。同源重組標(biāo)記物MLH1在精子發(fā)生中的減數(shù)分裂過(guò)程中具有重要作用，但作用機(jī)制仍不清楚。為了探索MLH1在減數(shù)分裂重組交換中的作用機(jī)制，我們通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選小鼠睪丸cDNA文庫(kù)，尋找MLH1在同源重組中的結(jié)合蛋白并進(jìn)行篩選研究，為分析MLH1在減數(shù)分裂中同源重組的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)中所用小鼠C57BL6J購(gòu)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用得到上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。HEK293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

二、質(zhì)粒構(gòu)建

用TRIzol（Invitrogen）提取小鼠睪丸及HEK293T細(xì)胞RNA，用PrimeScrip RT reagent Kit （Takara）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶（Takara）進(jìn)行PCR，得到目的基因的CDS，經(jīng)酶切后（EcoRI、SalI、BamHI，Takara），連接（DNA Ligation Kit，Takara）到相應(yīng)載體上。MLH1（NM_026810.2）構(gòu)建到pGBKT7（Clontech）和FLAG（p3xFLAG-myc-CMV-24，Sigma）載體上；mRHNO1（ENSMUSG00000048668）和hRHNO1（NM_001252499.2）構(gòu)建到GFP （pEGFP-C1，Clontech）和GST（pGEX-5X-3，GE Healthcare）載體上。pGBKT7-MLH1上游引物：5’-ATATGAATTCATGGCGTTTGTAGC A G G A G T - 3’，下游引物：5’-ATATGGATCCTTTAACA-CCGCTCAAAGACT-3’；FLAG-MLH1上游引物：5’-ATATGAATTCTA TGGCGTTTGTAGCAGGAG3’，下游引物：5’- ATATGGATCCTTAACACCGCTCAAAGACT -T-3’； GFP/GST-mRHNO1上游引物：5’-TATAGAATTCGATGCCTCCCAAAAAGAGAC-3’，下游引物：5’- TATAGTCGACCTGTCAGA TCTTCACAAGGA-3’； GFP/GST-hRHNO1上游引物：5’- TATA G A AT T C G AT G C -C T C C C A G A A A A A A A C - 3’，下游引物：5’- T A T A G T C G -ACGGCAGTCAGCTTTTCACAAG-3’。

三、酵母雙雜交

酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)按照Clontech公司提供的《Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 3 &Libraries User Manual》操作。酵母雙雜交系統(tǒng)（Matchmake GAL4 Two-Hybrid System），小鼠睪丸組織cDNA文庫(kù)（Mate &Plate Library - Mouse Testis）和酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基購(gòu)自Clontech。將pGBKT7-MLH1載體轉(zhuǎn)化到AH109酵母中，經(jīng)過(guò)毒性檢測(cè)和自激活檢測(cè)后，免疫印跡檢測(cè)MLH1的蛋白表達(dá)。AH109菌株與小鼠睪丸cDNA文庫(kù)采用高強(qiáng)度篩選條件，四缺培養(yǎng)板（SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp）加入2.5 mmol/L的3-AT（Sigma）。四缺板上的克隆經(jīng)X-β-Gal（Sigma）驗(yàn)證后，PCR檢測(cè)插入片段大?。ㄒ餅镸atchmaker 3/5’ AD LD-Insert Screening Amplimer），并用HaeIII（Takara）酶切以去除重復(fù)克隆。提取酵母質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中，提取DH5α中的質(zhì)粒，質(zhì)粒送到Invitrogen公司測(cè)序，測(cè)序引物為Matchmaker 3/5’ AD LD-Insert Screening Amplimer。

四、GST pull-down 驗(yàn)證

將GST-mRHNO1和GST-hRHNO的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL-21大腸桿菌中，28℃ 1mM IPTG（Sigma）誘導(dǎo)表達(dá)5h，收菌后沉淀經(jīng)PBS重懸、超聲破碎，4℃ 12 000×g，離心15 min，取上清與Glutathione Sepharose 4B beads（G4B，GE healthcare）孵育，純化GST融合蛋白；將FLAG-MLH1質(zhì)粒用Lipofectamine 2000（Invitrogen）轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293T細(xì)胞中，36h后收集細(xì)胞，PBS中重懸、超聲破碎，4℃ 12 000×g，離心15 min，取上清與經(jīng)G4B純化的GST融合蛋白4℃孵育過(guò)夜。低速離心去上清后洗凈凝珠，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮10 min后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。蛋白膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，硝酸纖維素膜進(jìn)行免疫印跡，檢測(cè)FLAGMLH1[2]。

五、免疫共沉淀

將FLAG-MLH1和GFP-mRHNO1或GFP-hRHNO1質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染，36h后收集細(xì)胞，加入TNE裂解液（10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA and 1% NP-40），冰上裂解2h，4℃12 000×g，離心15min，取上清，加到孵育了兔抗GFP（Abcam）的Protein G Sepharose 4 fast fl ow（GE healthcare）凝珠，4℃孵育過(guò)夜。低速離心去上清后洗凈凝珠，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮10min后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后免疫印跡，檢測(cè)FLAGMLH1[3]。

六、免疫印跡

堿裂解法提取酵母蛋白，或TNE裂解液提取HEK293T細(xì)胞過(guò)表達(dá)的FLAG-MLH1和GFP-mRHNO1、GFP-hRHNO1，SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，孵育鼠抗Myc（Proteintech）、鼠抗GFP（Clonetech）、鼠抗GAPDH（Proteintech）、鼠抗FLAG（Sigma），T B S T洗滌后孵育H R P偶聯(lián)山羊抗兔/鼠I g G （Proteintech），洗滌后用ECL化學(xué)發(fā)光法經(jīng)ImageQuant LAS 4000 mini（GE healthcare）檢測(cè)目的蛋白。

七、Real-timee PPCCRR

用TRIzol提取小鼠各組織RNA，經(jīng)NanoDrop 1000（Thermo Scientific）測(cè)定濃度，逆轉(zhuǎn)錄（PrimeScrip RT reagent Kit，Takara）為cDNA后，采用SYBR法（SYBR Premix Ex Taq II Kit，Takara），使用7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）測(cè)定目的基因的表達(dá)水平。GAPDH上游引物：5-’TGTGTCCGTCGTGGATCTG-A-3’，下游引物：5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’；m R H N O 1上游引物：5’- TA AT T C AT C TC A C G C T G T T - 3’，下游引物：5’-CAAGGCTGTCAACCATTA-3’。

結(jié) 果

一、MMLLHH11在酵母中的表達(dá)、毒性及自激活檢測(cè)

MLH1作為減數(shù)分裂重組交換中的標(biāo)志物，在其中具有重要的作用，但是其具體的作用機(jī)制尚不是很清楚，還有待研究。酵母雙雜交是篩選相互作用蛋白的有力工具，前期的研究利用了血液、乳腺及淋巴細(xì)胞的cDNA文庫(kù)篩選MLH1的結(jié)合蛋白[4-6]。為了探討MLH1在同源染色體重組交換中的作用機(jī)制，我們利用了小鼠睪丸的cDNA文庫(kù)篩選MLH1的結(jié)合蛋白。將小鼠MLH1的CDS構(gòu)建到pGBKT7載體上，轉(zhuǎn)化到AH109菌株，免疫印跡檢測(cè)了MLH1的表達(dá)（圖 11AA）。MLH1對(duì)酵母的生長(zhǎng)沒(méi)有毒性（圖 11BB和圖 11CC），但自激活檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)其有輕微的自激活現(xiàn)象（圖 11DD），而2.5 mM 3-AT的三缺板即能抑制其自激活（圖 11EE--GG），而利用四缺板檢測(cè)時(shí)，其完全沒(méi)有克隆長(zhǎng)出，表明高強(qiáng)度篩選條件比較適宜（圖 11HH--JJ），而為了避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)，我們采用了2.5 mM 3-AT和四缺板的篩選條件（圖 11II）。

圖1 MLH11在AAHH110099菌株的表達(dá)及自激活檢測(cè)

二、酵母雙雜交克隆篩選

MLH1的AH109菌株與Y187的小鼠睪丸cDNA文庫(kù)雜交之后，觀測(cè)到了經(jīng)典的三葉草(或米奇鼠)結(jié)構(gòu)（圖22AA）。挑選四缺板上長(zhǎng)出來(lái)的克隆240個(gè)，經(jīng)X-β-Gal驗(yàn)證，剔除了未變藍(lán)的55個(gè)假陽(yáng)性點(diǎn)（圖 22BB），而兩次PCR都未擴(kuò)增的克隆，也將之去除49個(gè)克隆。將PCR產(chǎn)物按照大小分類，并用HaeIII酶切，將重復(fù)的克隆去除32個(gè)（圖3），共得出克隆104個(gè)。

圖2 酵母雙雜交和X-β--GGaall檢測(cè)結(jié)果

圖3 HaeIIII 酶切去除重復(fù)克隆

三、酵母雙雜交測(cè)序結(jié)果

酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α中，經(jīng)6次電擊轉(zhuǎn)化，仍有30個(gè)克隆轉(zhuǎn)化不成功，故共送樣68個(gè)并測(cè)序成功。經(jīng)在NCBI中序列比對(duì)并經(jīng)去重，得到基因29個(gè)基因的mRNA。其中包括MLH1的已知結(jié)合蛋白MLH3和PMS2。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研、分析，選定了一個(gè)新的基因RAD9-HUS1-RAD1 interacting nuclear orphan 1 （RHNO1，ENSMUSG00000048668）。mRHNO1含有235個(gè)氨基酸，分子量為27Kd，保守性很高，人、小鼠、大鼠、牛、雞和爪蟾的序列保守，其羧基端的保守性最高（圖 44AA），小鼠和大鼠之間的同源性為89%，人和鼠之間的同源性為70%（圖 44BB）。

圖4 RHNO1保守性分析

四、MLH1和RHNO1相互作用的驗(yàn)證

通過(guò)外源表達(dá)、純化GST融合蛋白mRHNO1和hRHNO1，利用GST pull-down技術(shù)沉淀HEK293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的FLAG-MLH1，證明了RHNO1和MLH1的相互作用（圖 55AA）；同時(shí)利用免疫共沉淀技術(shù)，在HEK293T細(xì)胞中同時(shí)過(guò)表達(dá)FLAG-MLH1和GFP-mRHNO1、GFP-hRHNO1，用GFP抗體沉淀相互作用蛋白，也驗(yàn)證了RHNO1和MLH1的相互作用（圖 55BB）。

五、RHNO1的表達(dá)分析

通過(guò)Real-time PCR，分析了RHNO1在小鼠各組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在睪丸中的表達(dá)水平最高（圖 6）。這一結(jié)果與Germ Online數(shù)據(jù)庫(kù)中的芯片結(jié)果一致[7]。

圖5 MLH1和RRHHNNOO11相互作用的驗(yàn)證

圖6 Real-time PCR 檢測(cè)mRRHHNNOO11在各組織中的表達(dá)

這些結(jié)果表明RHNO1參與了精子發(fā)生的調(diào)控，其與MLH1的相互作用，提示RHNO1參與了減數(shù)分裂中同源染色體重組過(guò)程的調(diào)控。

討 論

減數(shù)分裂同源染色體重組交換是染色體正確分離和正常精子形成的關(guān)鍵，染色體分離異?？蓪?dǎo)致精子發(fā)生障礙。許多不育男性睪丸組織學(xué)研究表明減數(shù)分裂發(fā)生異常，同源染色體重組交換錯(cuò)誤與男性不育的發(fā)生密切相關(guān)[8]。MLH1在精子發(fā)生中具有重要作用，MLH1的缺失導(dǎo)致精母細(xì)胞粗線期停滯，引起不育[9]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，MLH1在粗線期聯(lián)會(huì)復(fù)合體上呈點(diǎn)狀分布，與重組節(jié)的分布類似；MLH1的缺失引起重組缺陷，但是聯(lián)會(huì)正常。因此MLH1被用作同源重組和交叉的標(biāo)志物[10]。但是，MLH1在同源重組和交叉中的具體分子作用機(jī)制尚不清楚。MLH1的功能之一可能是介導(dǎo)了MSH4-MSH5復(fù)合物從同源染色體上解離，促進(jìn)交叉的完成[11]。其另一個(gè)功能可能是與MLH3形成MLH1-MHL3復(fù)合物，具有核酸內(nèi)切酶（endonuclease）活性，可能參與了重組中間體的解離[12]。但是，還有更多的問(wèn)題沒(méi)有得到解答。

為了研究MLH1在同源重組中的具體的作用機(jī)制，我們通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)尋找MLH1在睪丸中的結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的蛋白R(shí)HNO1與MLH1相互作用。通過(guò)分析RHNO1的序列，發(fā)現(xiàn)人、小鼠、大鼠、牛、雞和爪蟾RHNO1的蛋白序列有較高的保守性，尤其是其羧基端（圖 4）。通過(guò)GST pull-down和免疫共沉淀，驗(yàn)證了MLH1與RHNO1的相互作用（圖 5），通過(guò)Real-time PCR和免疫印跡發(fā)現(xiàn)RHNO1在小鼠睪丸組織中表達(dá)水平最高（圖 6），表明RHNO1在精子發(fā)生中具有重要功能。由于我們定制的抗體在組織學(xué)中的表現(xiàn)不佳，不能檢測(cè)其在生精細(xì)胞中的定位，暫時(shí)還不能明確其在精子發(fā)生中具體環(huán)節(jié)中的作用。研究表明RHNO1能與Rad9-Rad1-Hus1 （9-1-1）復(fù)合體及ATR激活因子TopBP1獨(dú)立結(jié)合，而9-1-1復(fù)合體通過(guò)募集RHNO1到DNA損傷位點(diǎn)，激活Chk1，啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)[13]。并且在人的細(xì)胞中敲低RHNO1能夠部分降級(jí)紫外線引起的ATR-Chk1信號(hào)通路的活性，但不影響9-1-1復(fù)合體與染色體的結(jié)合，也不影響9-1-1復(fù)合體與TopBP1的結(jié)合[14]。同時(shí)，RHNO1的變異體與遺傳性乳腺癌的發(fā)生關(guān)系不大[15]。這些結(jié)果提示RHNO1的主要功能可能與DNA損傷修復(fù)的關(guān)系不是很大。由于RHNO1主要表達(dá)在睪丸中，并與MLH1相互作用，提示RHNO1可能與MLH1介導(dǎo)的染色體同源重組相關(guān)。

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（2015-11-18收稿）

Screening and verifi cation of proteins that interact with MLH1,the key protein in meiosis recombination,by yeast two hybrid screening

Yi Yin1,2,Ping Ping1*
1.Department of Urology,Renji Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Adrology Institute,Shanghai 200001,China;
2.Department of Urology,Jiaotong Branch of Renji Hospital Affi liated to the Medicine School of Shanghai Jiaotong University
Corresponding author:Ping Ping,E-mail:deer16@126.com

AbstractObjective To screen proteins that interact with MLH1,the key protein in meiosis recombination in spermatogenesis.Metthhooddss Mouse testis cDNA library was screened by the bait of MLH1 using yeast two hybrid system to fi nd proteins interact with MLH1,and the interaction was validated by GST pull-down and co-immunoprecipitation.Resullttss Total of 29 interaction proteins were found on the plate of SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp by yeast two hybrid screening,including the known interaction proteins of MLH3 and PSM2.A new interaction protein was found which was named as RHNO1,and the interaction was confi rmed by GST pull-down and co-immunoprecipitation.The high expression level of RHNO1 in testis revealed by real-time PCR indicates that RHNO1 may have important function in spermatogenesis.Conclusion Yeast two hybrid system is an effective method to fi nd new interaction proteins,and we have identifi ed a new protein (called) RHNO1 interacted with MLH1,which may play roles in meiotic homologous recombination.

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2016.01.004

中圖分類號(hào)R321.1