miR-224-5p 調(diào)控PI3K/Akt/FoxO1 軸抑制氧化應(yīng)激減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

摘要：目的 探究miRNA-224-5p在缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制。方法 收集160 例急性心肌梗死（AMI）患者和80 例健康體檢者（HC）的血漿檢測(cè)miRNA-224-5p及生化指標(biāo)。H9c2細(xì)胞分為對(duì)照組（Control）、H/R組、H/R+miR-224-5pNC組、H/R+miR-224-5p mimics組。噻唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)細(xì)胞活力；試劑盒檢測(cè)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶2（SOD2）和乳酸脫氫酶（LDH）；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-224-5p與PTEN的靶向關(guān)系；生物信息學(xué)方法對(duì)靶基因的潛在機(jī)制進(jìn)行分析；qRT-PCR 檢測(cè)miRNA-224-5p mRNA 表達(dá)；Western blotting 檢測(cè)PTEN、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、SOD2、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Ak 及p-FoxO1/FoxO1 蛋白水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 與 HC 組相比，AMI 組的血糖、 C 反應(yīng)蛋白、CK、CK-MB 和cTnI水平均顯著高于對(duì)照組（Plt;0.05）。AMI組和H/R組miR-224-5p的表達(dá)低于對(duì)照組（Plt;0.05）；心肌細(xì)胞活力呈缺氧/復(fù)氧時(shí)間依賴性減少；PTEN是miR-224-5p 的靶基因；PI3K/Akt 通路是最顯著富集的通路；與Control 組相比，H/R 組SOD2 的活性降低，LDH的活性和MDA的含量均上升，細(xì)胞凋亡率上升（Plt;0.05），細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1、SOD2 和Bcl-2蛋白表達(dá)水平均降低，PTEN、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)均升高（Plt;0.05）；與H/R組比較，H/R+miR-224-5p mimics組SOD2的活性顯著上升，LDH、MDA的水平和細(xì)胞凋亡率均顯著降低（Plt;0.05），細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1、SOD2和Bcl-2的表達(dá)均上調(diào)，PTEN、Bax和Cleaved caspase3蛋白表達(dá)水平均降低（Plt;0.05）。結(jié)論 miR-224-5p過(guò)表達(dá)通過(guò)PI3K/Akt/FoxO1軸上調(diào)抗氧化基因SOD2的表達(dá)，緩解H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：缺氧/復(fù)氧；微小RNA；氧化應(yīng)激；凋亡

缺血性心肌?。↖CM）是由冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┬募∪毖鸬男募」δ苁С＃谛牟∈录l(fā)病率約為35/萬(wàn)～835/萬(wàn)在全球，且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)［1］。其發(fā)病機(jī)制包括缺血致心肌梗死、非梗死區(qū)域代償肥大、內(nèi)皮功能障礙、心肌細(xì)胞凋亡等［2］。隨著對(duì)冠心病研究的日益深入，氧化應(yīng)激在冠心病發(fā)生發(fā)展中的意義日益凸顯。氧化應(yīng)激（OS）是當(dāng)體內(nèi)氧自由基（OFR）產(chǎn)生過(guò)度或清除減少，造成體內(nèi)活性氧類生成與抗氧化防御之間的平衡紊亂，其在ICM疾病過(guò)程中可損害細(xì)胞膜，致鈣超載、細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生炎性介質(zhì)，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，損害血小板功能，影響miRNA的表達(dá)，繼而導(dǎo)致ICM的發(fā)生和發(fā)展［3］。而急性心肌梗死（AMI）是缺血性心臟病中導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一。

心肌缺血/再灌注損傷（IRI）是心臟手術(shù)、心臟移植、心肌梗死和心臟驟停中常見(jiàn)且嚴(yán)重的病理生理現(xiàn)象。IRI的細(xì)胞和分子機(jī)制非常復(fù)雜，包括炎癥、內(nèi)皮功能障礙、鈣濃度和pH值的變化，以及線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激［4］。心肌IRI最常發(fā)生在急性心肌梗死（AMI）再灌注治療期間。再灌注治療可以清除阻塞的冠狀動(dòng)脈并恢復(fù)心肌的血流，但可能會(huì)導(dǎo)致活性氧（ROS）的產(chǎn)生急劇增加，這會(huì)壓倒內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)。過(guò)量的ROS不僅會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激還會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而加重心肌細(xì)胞損傷，這兩者都在AMI的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［5， 6］。因此，提高機(jī)體的抗氧化能力從而消除過(guò)多的ROS可能是改善心肌梗死等缺血性心臟病的有效途徑。

微小RNA（miRNA）是一種長(zhǎng)度約為18～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼微小RNA，負(fù)向調(diào)節(jié)基因表達(dá)并調(diào)節(jié)特定基因的翻譯和穩(wěn)定性。近年來(lái)，在I/R損傷的心肌組織中發(fā)現(xiàn)了各種miRNA的顯著變化，表明miRNA可能是治療心肌I/R損傷的潛在治療靶點(diǎn)［7］。LncRNAAK087124/miR-224-5p/PTEN軸通過(guò)細(xì)胞凋亡和AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的內(nèi)皮細(xì)胞損傷［8］。miR-224-5p 靶向TXNIP 增強(qiáng)了HP-EV在緩解心肌梗死和再灌注治療前心肌細(xì)胞缺氧狀況方面的抗凋亡作用［9］。miR-224-5p/CPEB3 使EGFR/PI3K/AKT 信號(hào)失活來(lái)抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展［10］。PI3K/Akt信號(hào)通路的活化在心肌梗死以及心肌缺血再灌注損傷（（MI/RI）的心臟保護(hù)中起著至關(guān)重要的作用，被認(rèn)為是一條經(jīng)典的對(duì)心臟有利的通路［11］。而叉頭轉(zhuǎn)錄因子1（FoxO1）是PI3K/Akt信號(hào)軸的下游靶點(diǎn)［12］。FoxO1參與包括氧化應(yīng)激抵抗、代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和凋亡在內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程［13］。作為調(diào)節(jié)氧化還原動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxO1促進(jìn)位于不同亞細(xì)胞室的抗氧化蛋白的表達(dá)，如線粒體中的錳超氧化物歧化酶（SOD2）［14］。miR-224-5p與凋亡、炎癥和心腦血管病的缺血再灌注損傷等生理病理過(guò)程密切相關(guān)［15］。然而，miR-224-5p 是否通過(guò)調(diào)節(jié)FoxO1蛋白表達(dá)維持心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平從而減輕心肌細(xì)胞損傷尚未確定。

已證實(shí)體外H/R處理的H9c2心肌細(xì)胞模型可以復(fù)制在體心肌I/R損傷模型［16， 17］。因此在本研究中，我們利用H9c2心肌細(xì)胞建立了體外培養(yǎng)的H/R細(xì)胞模型，探討miR-224-5p 通過(guò)PI3K/Akt/FoxO1 信號(hào)軸抑制氧化應(yīng)激減輕缺氧/復(fù)氧對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象

選擇2021年12月～2023年2月在河北人民醫(yī)院心血管內(nèi)科收治的80 例ST段抬高心肌梗死（STEMI）患者，非ST段抬高心肌梗死（NSTEMI）患者80例。STEMI和NSTEMI患者的診斷基于ACC/AHA/ESC/WHF實(shí)踐指南［18］。胸痛超過(guò)12 h、接受溶栓治療和患有嚴(yán)重心力衰竭的AMI患者不包括在本研究中。還招募了同期80 名年齡和性別匹配，沒(méi)有證據(jù)表明有心血管或腦血管疾病的健康受試者作為健康對(duì)照組（HC）。從MI患者和健康體檢者收集5 mL空腹靜脈血立即離心以獲得純血漿，隨后儲(chǔ)存在-80 ℃用于進(jìn)一步分析。河北省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了本研究（倫理審查編號(hào)：202104），所有參與者均已知情同意。

1.1.2 材料和試劑

H9c2心肌細(xì)胞株（HCM）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、Lipofectamine3000、TRizol試劑、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（lnvitrogen）；胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司）；青鏈霉素雙抗溶液、丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒和乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；miR-224-5p 模擬物（miR-224-5p mimics）、模擬物陰性對(duì)照（miR-NC）、miR-224-5p抑制物（anti-miR-224-5p）、抑制物陰性對(duì)照（anti-miR-NC）以及雙熒光素酶報(bào)告載體（漢恒生物科技（武漢）有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄酶、2×SYBR Green mastermiX （廣州瑞博生物科技有限公司）；膜聯(lián)蛋白－異 硫氰酸熒光素/碘化丙啶（AnneXin V-FlTC/Pl）（漢恒生物科技（武漢）有限公司）；兔抗PTEN抗體、兔抗PI3K抗體、兔抗Akt抗體購(gòu)于（購(gòu)于Cell Signaling Technology公司）；超氧化物歧化酶2抗體（SOD）、磷酸化叉頭蛋白家族1抗體（p-FOXO1A （phospho S256））（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；裂解型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3兔單克隆抗體、兔B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）多克隆抗體、兔Bcl相關(guān)X蛋白（BaX）單克隆抗體、β-肌動(dòng)蛋白抗體（β-actin）單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔lgG（上海碧云天生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法

患者入院后的空腹靜脈血，離心力調(diào)至2180×g，10 min 分離血清及血漿，貝克曼自動(dòng)生化分析儀對(duì)CK、CK-MB、CRP 及血糖進(jìn)行檢測(cè)；全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定血清中cTnI 的濃度。

1.2.2 H9c2 心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

H9c2 細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱在含有完全培養(yǎng)基（RPMI 1640+10%胎牛血清+1%青-鏈霉素溶液）的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每3 d換液1 次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到85%～90%融合時(shí)傳代或凍存。參照［19］構(gòu)建H/R 模型：首先在低葡萄糖DMEM培養(yǎng)基中（1 mg/mL），低氧條件（95% N2 和 5% CO2，37 ℃）置于三氣培養(yǎng)箱中孵育12 h。隨后，細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM中、在95%空氣和5%CO2中37℃孵育不同的時(shí)間，不同的時(shí)間取決于復(fù)氧需要的時(shí)間。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞2×105接種于含有1%FBS 的高糖DMEM培養(yǎng)基（4.5 mg/mL）的24孔板中并孵育24 h。轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-224-5p mimics按照Lipofecta mineTM3000 試劑制造商的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行H/R 處理，分別記為H/R+miR-NC組（空載體）與H/R+miR-224-5p 組（模擬物序列）。在DMEM 中正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組（Control）；細(xì)胞H/R處理作為H/R模型組。

1.2.4 生物信息學(xué)

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）下載GSE230165 高通量數(shù)據(jù)集。使用R軟件EdgeR包分析差異表達(dá)的 miRNA，Plt;0.05設(shè)為顯著差異的閾值。TargetScan7.2（http：//www.targetscan.org/vert_72/）數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-224-5p的靶基因，并對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG通路分析。

1.2.5 RNA

分離和實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）使用TRIzol 試劑從H9c2 細(xì)胞或者200 μL血漿中提取總RNA，然后使用第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。對(duì)于miRNA檢測(cè)，在存在莖環(huán)的情況下對(duì)1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。miRNA和U6的引物由廣州銳博生物技術(shù)有限公司提供。最后，根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒（Sparkjade）對(duì)總miRNA進(jìn)行定量，U6作為內(nèi)源性對(duì)照。引物序列如下：miR-224-5p， forward：5'-ACAAGTCACTAGTGGTTCC-3'；reverse：5'-CAGTGATGTTGCGGTCTG-3'；U6， forward： 5'-CAGCACATTCGGCAGCACA-3'；reverse：5'-TGGTGTCG TTGGAGTCG-3。使用 2－△△Ct法計(jì)算miRNA的表達(dá)量。

1.2.6 噻唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)細(xì)胞活力

用完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整至以5×104/mL，吸取100 μL稀釋后的細(xì)胞懸液，加入96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置對(duì)照孔。培養(yǎng)24 h后加入20 μL MTT（5 mg/mL）孵育4 h。然后，通過(guò)離心機(jī)去除培養(yǎng)基，并通過(guò)加入150 μL DMSO裂解細(xì)胞以溶解甲臜。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的吸光度（A）來(lái)量化細(xì)胞活力，并計(jì)算細(xì)胞存活率［實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%］。

1.2.7 檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)

根據(jù)試劑制造商的方案，按照試劑盒說(shuō)明書，分別收集H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液上清和細(xì)胞。LDH活性的檢測(cè)使用LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的培養(yǎng)液上清。將各組H9c2細(xì)胞使用細(xì)胞裂解液在冰上裂解后，收集上清液，檢測(cè)SOD2 的活性和MDA的含量。

1.2.8 雙熒光素酶活性測(cè)定

構(gòu)建野生型（Wt）Wt-PTEN-3'-UTR和突變體（Mut）Mut-PTEN-3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，根據(jù)Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明步驟將Wt-PTEN-3'-UTR或Mut-PTEN-3'-UTR與miRNA陰性對(duì)照寡核苷酸（miRNA NC）或miR-224-5p 模擬物（miR-224-5p mimic）分別共轉(zhuǎn)染至H9c2 細(xì)胞。根據(jù)轉(zhuǎn)染程序，轉(zhuǎn)染48 h后使用試劑盒和多模式酶標(biāo)儀測(cè)量雙熒光素酶報(bào)告基因活性。

1.2.9 Western blotting

收集各組H9c2細(xì)胞，用細(xì)胞裂解緩沖液裂解，并在4 ℃下以12 000 g離心15 min。用RIPA裂解緩沖液提取蛋白質(zhì)，用8%～12%的分辨率凝膠進(jìn)行SDS-PAGE分離。將分解后的蛋白質(zhì)電印跡到膜上。在用5%脫脂牛奶封閉后。TBST溶液洗膜3次，然后分別加入稀釋后的一抗：Caspase-3（1∶1000）、Bax（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、PTEN（1∶1000）、Akt（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、p-Akt（1∶2000）、p-PI3K（1∶1000）、SOD2（1∶1000）、FoxO1（1∶1000）、p-FoxO1（1∶1000）、β-actin（1∶500） 4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST洗滌3次后，加入HRP標(biāo)記的二抗IgG（1∶2000）于室溫孵育1 h。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影，在Bio-Rad 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光，用ImageJ軟件進(jìn)行定量。

1.2.10 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)

數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2 心肌細(xì)胞，消化、稀釋、轉(zhuǎn)染、分組等操作后，用PBS 溶液進(jìn)行洗滌，離心5 min后，用1×Binding Buffer緩沖液稀釋成1×106/mL的細(xì)胞懸液，取100 μL細(xì)胞懸液，按照試劑盒說(shuō)明書加入5 μL的Annexin V-APC和5 μL的7-AAD染色液， 輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育20 min。，混勻后上機(jī)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 24.0、GraphPadPrism8.02 和R 語(yǔ)言軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及可視化，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。Shapiro-Wilk法用于檢驗(yàn)正態(tài)性，Levene法用于評(píng)估方差齊性。各組間差異比較采用單因素方差分析兩兩比較用LSD法，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用Fisher精確檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。此外，受試者工作特征曲線（ROC）下面積（AUC）被用來(lái)評(píng)估m(xù)iRNA 作為AMI 的診斷標(biāo)志物的準(zhǔn)確性。Plt;0.05（雙側(cè)）時(shí)，差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的臨床參數(shù)

80例STEMI患者和80例NSTEMI患者，與健康對(duì)照組（HC）在年齡和性別完全匹配，基本信息和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果如表1所示。STEMI和NSTEMI患者的血糖、C反應(yīng)蛋白、CK、CK-MB和cTnI水平均顯著高于對(duì)照組（Plt;0.05）。

2.2 miR-224-5p在AMI疾病中的表達(dá)水平

高通量數(shù)據(jù)分析顯示miR-224-5p顯著下調(diào)（圖 1A）。AMI患者與HC組血漿miR-224-5p表達(dá)水平結(jié)果顯示STEMI（n=80）和NSTEMI（n=80）組血漿miR-224-5p的水平均低于HC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。但是STEMI 與NSTEMI 患者血漿中miR-224-5p 的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，圖1B）；miRNA-224-5p 在AMI 患者和健康受試者之間表現(xiàn)出很強(qiáng)的分離能力，STEMI的曲線下面積（AUC）為0.952（圖1C）；NSTEMI患者和健康被試者的AUC為0.973（Plt;0.001，圖1D）。

2.3 缺氧/復(fù)氧降低心肌細(xì)胞活力

缺氧引起心肌細(xì)胞活力的時(shí)間依賴性下降，缺氧暴露后12 h開(kāi)始顯著下降（Plt;0.05，圖2A）；隨著復(fù)氧時(shí)間的增加，在12 h復(fù)氧后，心肌細(xì)胞活力也顯著降低（Plt;0.05，2B）；Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低氧暴露12 h 后，心肌細(xì)胞凋亡活性顯著增加，表現(xiàn)為Bcl-2/Bax比值降低，Cleaved caspase3表達(dá)升高；隨后復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)心肌細(xì)胞Bcl-2/Bax 蛋白比值逐漸降低、Cleaved caspase3 的表達(dá)上升，缺氧/復(fù)氧降低了細(xì)胞存活率（Plt;0.05，圖2C～E）；在H/R 處理的H9c2 細(xì)胞中，miR-224-5p的表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.05，圖2F）。

2.4 miR-224-5p靶向調(diào)控PTEN的表達(dá)

基于在線數(shù)據(jù)庫(kù)篩選miR-224-5p的靶基因（圖3A）。TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)的分析顯示，miR-224-5p與PTEN之間存在結(jié)合位點(diǎn)（圖3B）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，在H/R處理的H9c2 細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)miR-224-5pmimic顯著抑制野生型PTEN 3'-UTR報(bào)告基因的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），但不影響具有突變miR-224-5p結(jié)合位點(diǎn)的PTEN 3'-UTR報(bào)告基因的熒光素酶活性（Pgt;0.05）。此外，當(dāng)miR-NC或Vector與Wt或Mut共轉(zhuǎn)染時(shí)，組間熒光素酶活性沒(méi)有變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，圖3C）。京都基因和基因組百科全書（KEGG）對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行的信號(hào)通路分析表明PI3K/Akt是最顯著富集的通路（圖3D）。

2.5 各實(shí)驗(yàn)組SOD2、LDH及MDA水平比較

與Control 組比較，H/R組上清中SOD2 的水平降低，MDA和LDH水平增加（Plt;0.05）；與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-224-5P組SOD2的水平上調(diào)，MDA和LDH的水平顯著下降（Plt;0.05）；H/R+miR-NC組與H/R組各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，圖4）。

2.6 miR-224-5p 通過(guò)PI3K/Akt/FoxO1 信號(hào)傳導(dǎo)參與H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

與Control 組相比，H/R 組細(xì)胞中PTEN、Cleavedcaspase-3 和bax 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（Plt;0.05），p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1、SOD2 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平以及Bcl-2/Bax比值顯著下調(diào)（Plt;0.05）；與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-224-5p mimic 組細(xì)胞中PTEN、Cleaved caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（Plt;0.05），p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1、SOD2 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值顯著升高（Plt;0.05，圖5）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與Control 組相比，H/R 組的細(xì)胞凋亡率顯著升高（Plt;0.05）；與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-224-5p mimic組的細(xì)胞凋亡率降低（Plt;0.05，圖5E、F）。

3 討論

缺血/再灌注損傷是缺血性心臟病的主要病因，因此減輕心肌細(xì)胞損傷并因此保護(hù)心臟功能對(duì)于降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要［20］。研究表明miRNAs 在心肌梗死中異常表達(dá)并在調(diào)節(jié)心肌損傷中發(fā)揮作用，但miRNAs 在心肌梗死中的功能仍未完全了解。本研究探究了miR-224-5p在AMI患者中的診斷價(jià)值，與健康對(duì)照組相比，STEMI和NSTEM患者miRNA-224-5p血漿中濃度顯著降低，miRNA-224-5p的ROC曲線下面積（AUC）在HC 與STEMI（AUC=0.973）和NSTEMI（AUC=0.952）表現(xiàn)出很強(qiáng)的區(qū)分性，進(jìn)一步在細(xì)胞上研究對(duì)缺氧/復(fù)氧的影響。MTT的結(jié)果顯示缺氧/復(fù)氧處理降低了細(xì)胞活力，激活了細(xì)胞中的凋亡途徑。細(xì)胞凋亡是缺血/再灌注損傷的嚴(yán)重后果，當(dāng)?shù)蛲鐾緩奖患せ顣r(shí)，會(huì)發(fā)生各種變化，包括細(xì)胞收縮和脫落、核碎裂和凋亡體的形成［21］。在凋亡相關(guān)蛋白中，Bcl-2家族和裂解的caspase-3是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，Bcl-2可能促進(jìn)細(xì)胞存活，而B(niǎo)ax可能通過(guò)凋亡促進(jìn)細(xì)胞死亡。Bcl-2/Bax 比值是決定細(xì)胞損傷后是否發(fā)生細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素［22］。Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R可顯著下調(diào)Bcl-2/Bax 的比值，上調(diào)Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)。此外越來(lái)越多的研究表明在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷過(guò)程中miR-7a-5p、miR-1224 和MicroRNA-590-3p的濃度發(fā)生了嚴(yán)重的變化。經(jīng)特異性抑制或模擬miRNAs處理的H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞通過(guò)作用其靶基因（分別為VDAC1、HIF-1α和GPX4）顯著調(diào)節(jié)各種細(xì)胞炎癥途徑，顯著降低氧化應(yīng)激、caspase-3活性和細(xì)胞凋亡，并顯著保護(hù)心肌細(xì)胞損傷提高細(xì)胞存活率［23-25］。在此，我們發(fā)現(xiàn)miR-224-5p 在缺氧/再灌注后H9c2細(xì)胞中也顯著下調(diào)。然而，miR-224-5p對(duì)H/R暴露的心肌細(xì)胞損傷中氧化應(yīng)激和凋亡的報(bào)道較少。

本研究探討了H/R誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞miR-224-5p水平顯著降低的潛在分子機(jī)制。使用TargetScan在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-224-5p 可能的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-224-5p 與PTEN的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）存在特異的結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)PTEN是miR-224-5p的靶基因。PTEN作為一種脂質(zhì)磷酸酶，負(fù)調(diào)控PI3K信號(hào)通路并將PIP3轉(zhuǎn)化為PIP2。當(dāng)PTEN發(fā)生突變或失活時(shí)，PI3K效應(yīng)子特別是Akt，在沒(méi)有任何外源致癌刺激的情況下被激活。PI3K/Akt信號(hào)通路參與多種生理過(guò)程，是許多疾病尤其是腫瘤發(fā)展的重要信號(hào)途徑，能調(diào)控細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)移和新陳代謝，在凋亡和炎癥因子募集中發(fā)揮作用［26， 27］。如Akt 磷酸化Bcl-2 家族成員BAD，使其與14-3-3結(jié)合而阻止其與Bcl-XL結(jié)合起始凋亡［28］。PTEN/PI3K/Akt-mTOR信號(hào)通路是缺血性心臟病中BMI1 誘導(dǎo)的心臟纖維化的原因［29］。KEGG富集分析顯示miR-224-5p的預(yù)測(cè)靶基因與最顯著富集的通路PI3K/Akt通路相關(guān)。研究表明，PI3K/Akt通路在抵抗ROS 方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，并改善心肌細(xì)胞的存活［30］。叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O1（FoxO1）是一種調(diào)節(jié)抗氧化反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，已被認(rèn)為是改善心臟氧化應(yīng)激損傷的有趣靶點(diǎn)［31］。FoxO1又是PI3K/Akt信號(hào)通路的下游靶標(biāo)。氧化應(yīng)激是ROS生成和抗氧化防御系統(tǒng)之間失衡的結(jié)果，乳酸脫氫酶和丙二醛是細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)，而超氧化物歧化酶是保護(hù)性指標(biāo)［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，H9c2 細(xì)胞進(jìn)行H/R 處理后，細(xì)胞LDH和MDA水平升高，同時(shí)SOD2 表達(dá)也減少，表明H/R后確實(shí)能夠使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，抗氧化系統(tǒng)受損。與H/R組比較，miR-224-5p mimic轉(zhuǎn)染H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞后，LDH的活性降低，MDA含量減少而SOD2活力上升，結(jié)果表明，miR-224-5p可顯著抑制H/R暴露的心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激，提示miR-224-5p 可能通過(guò)阻斷氧化應(yīng)激而對(duì)H/R處理的心肌細(xì)胞產(chǎn)生抗凋亡作用。

為了研究miR-224-5p 是否通過(guò)PI3K/Akt/FoxO1抑制氧化應(yīng)激減少細(xì)胞凋亡。體外模擬miR-224-5p過(guò)表達(dá)，WB結(jié)果顯示，與Control組相比，H/R組H9c2細(xì)胞中PTEN、Cleaved caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)水平升高，p-Akt、p-FoxO1、SOD2 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平以及Bcl-2/Bax 比值降低。miR-224-5p 過(guò)表達(dá)后p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1、SOD2和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平以及Bcl-2/Bax比值均明顯升高，PTEN、Cleaved caspase-3和bax蛋白表達(dá)水平顯著降低。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示miR-224-5p 轉(zhuǎn)染減少了H/R引起的H9c2 心肌細(xì)胞凋亡。表明miR-224-5p過(guò)表達(dá)可顯著減輕氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)細(xì)胞免受H/R的影響。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)miR-224-5p 保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧損傷與PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路密切相關(guān)。然而，本研究?jī)H在體外細(xì)胞水平上研究了miR-224-5p在H/R中的機(jī)制。為了更準(zhǔn)確地分析miR-224-5p調(diào)控PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路在AMI中的機(jī)制，并為未來(lái)的臨床應(yīng)用提供思路，需要在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)上進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證性研究。

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（編輯：吳錦雅）

基金項(xiàng)目：河北省政府資助臨床醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)項(xiàng)目（2020009）；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H2024307005）