干性相關分子Nanog 在食管鱗狀細胞癌組織中高表達并促進食管鱗癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移：基于激活TGF-β信號通路

摘要：目的 探討食管鱗狀細胞癌（鱗癌）中干性相關分子胚胎干細胞關鍵因子（Nanog）和侵襲遷移相關分子基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表達及其之間的調(diào)控關系。方法 運用免疫組織化學技術檢測127例食管鱗癌組織和82 例癌旁正常組織中Nanog 和MMP-2/MMP-9 蛋白的表達情況，分析Nanog 和MMP-2/MMP-9 蛋白的表達水平、相關性及與食管鱗癌患者的臨床病理參數(shù)和預后之間的關系；采用GEO數(shù)據(jù)庫分析Nanog 等干性相關分子主要富集通路；應用TIMER在線網(wǎng)站分析食管癌中TβR1和MMP-2及MMP-9的相關性。在體外運用siRNA轉(zhuǎn)染的方式將食管鱗癌細胞株分為正常對照組、Nanog 低表達組，采用劃痕實驗分析其對食管鱗癌細胞遷移的影響，qRT-PCR 及Western blotting 檢測兩組之間TβR1、p-Smad2/3、MMP-2/MMP-9 的表達情況。結果 Nanog 和MMP-2/MMP-9 蛋白在食管鱗癌組織中表達均上調(diào)（χ2=70.475，Plt;0.01；χ2=34.415，Plt;0.01；χ2=46.605，Plt;0.01），且呈正相關（r=0.205，P=0.045；r=0.307，Plt;0.001）。Nanog 和MMP-2/MMP-9蛋白表達水平與食管鱗癌的浸潤深度相關（χ2=23.9，Plt;0.01；χ2=6.029，Plt;0.05；χ2=11.89，Plt;0.05），有淋巴結轉(zhuǎn)移的樣本中，MMP-2/MMP-9蛋白表達水平高于無淋巴結轉(zhuǎn)移的樣本（χ2=10.08，Plt;0.01；χ2=5.731，Plt;0.05）。MMP-2/MMP-9 蛋白表達與食管鱗癌患者的年齡、性別和腫瘤分化程度無相關性（Pgt;0.05）。Kaplan-Meier生存分析顯示，Nanog和MMP-2/MMP-9蛋白高表達組的食管鱗癌患者生存時間短于低表達組（Plt;0.001；P=0.004；P=0.017）；生物信息學分析顯示，Nanog等干性相關分子主要富集在轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路，MMP-2/MMP-9與TβR1表達在食管癌中呈正相關關系。體外劃痕實驗結果顯示，Nanog促進食管鱗癌細胞系的遷移；qRT-PCR及Western blotting結果顯示，敲低Nanog后，TβR1、p-Smad2/3、MMP-2/MMP-9的表達水平明顯降低。結論 Nanog和MMP-2/MMP-9蛋白在食管鱗癌患者組織中高表達且呈正相關，其與食管鱗癌患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移及預后密切相關，且Nanog通過TGF-β信號通路影響MMP-2/MMP-9蛋白的表達。

關鍵詞：食管鱗狀細胞癌；胚胎干細胞關鍵因子；基質(zhì)金屬蛋白酶-2/基質(zhì)金屬蛋白酶-9；浸潤轉(zhuǎn)移；生存分析

食管癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國2020年食管癌發(fā)病率居惡性腫瘤排名第7位，死亡率居第5位［1］。食管癌患者預后較差，5年生存率為30.3%［2］，患者常死于癌癥的轉(zhuǎn)移復發(fā)［3］。研究表明，腫瘤干細胞是腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的關鍵因素［4， 5］。

胚胎干細胞關鍵因子（Nanog）在食管癌等惡性腫瘤中常存在異常表達［6］，是食管癌的干性標志物之一。研究表明，在腫瘤中Nanog 可維持腫瘤干細胞干性特征，促進腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移過程［7-9］。有研究顯示，在胃癌細胞中敲低Nanog 會導致基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）mRNA和蛋白表達水平下調(diào)從而抑制胃癌細胞MKN-45 的遷移能力［10］。有文獻報道食管癌中MMP-2和MMP-9表達明顯增高，其表達與食管癌的浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移和血管浸潤密切相關［11］。另有研究表明，在骨肉瘤干細胞中敲低轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）后MMP-2的水平明顯降低［12］。但目前Nanog蛋白在食管鱗癌組織中的異常表達的調(diào)控機制尚不清楚。

為探討食管鱗癌組織中干性分子Nanog的表達及其與侵襲轉(zhuǎn)移分子MMP-2/9 的相關性，本研究采用免疫組化技術聯(lián)合檢測Nanog和MMP-2/9蛋白在食管鱗狀細胞癌（ESCC）組織中的表達情況，初步探討Nanog和MMP-2/9 蛋白表達水平與食管鱗癌浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移及患者生存的關系，并通過生物信息學分析它們可能存在的調(diào)控信號通路，進而從細胞層面驗證Nanog可能通過TGF-β信號通路調(diào)控MMP-2、MMP-9的表達從而影響食管癌的侵襲遷移，為進一步尋找食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及預后分子靶標提供參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集2009年1月～2015年12月伊犁友誼醫(yī)院和新華醫(yī)院的127例食管鱗癌組織樣本及82例癌旁正常組織標本。納入標準：經(jīng)術后病理檢查結果確定為食管鱗癌；術前未進行放化療或新輔助免疫治療；具有福爾馬林固定后石蠟包埋組織；具有相關臨床病理資料。排除標準：經(jīng)術后病理檢查結果食管腺癌或食管鱗癌合并腺癌；合并其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤個人史；合并心、肝、腎等臟器功能不全；臨床病理信息不完整。對127例食管癌根治手術患者進行隨訪，隨訪終點為患者死亡時間或最后隨訪時間（2022年12月）。本研究獲石河子大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（倫理批號：2018-023-01）。

食管鱗狀細胞癌組織樣本127 例，病理診斷年齡23～76 歲，其中男性78 例、女性49 例；食管癌旁正常組織樣本共82例，年齡23～74歲，其中男性54例、女性28例（表1）。對食管癌旁正常組織和和食管鱗癌組織樣本進行HE染色，在兩位病理專家獨立閱片后，將其分為正常食管組織、食管高分化鱗癌、食管中分化鱗癌及食管低分化鱗癌。

1.2 免疫組織化學染色

ESCC樣本及配對正常組織樣本制備組織芯片，將包埋好的組織芯片蠟塊連續(xù)切片，石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，梯度乙醇進行脫水，切片加枸櫞酸緩液進行微波抗原修復；切片加Nanog 抗體（Cell SignalingTechnology，1∶600）、MMP-2抗體（Proteintech，1∶250）、MMP-9抗體（Santa Cruz，1∶100），4 ℃孵育過夜；加二抗孵育后用DAB顯色，蘇木素復染。檢測122 例（127 例中5例脫片或無法判讀）食管鱗癌組織和79例（82例中3例脫片或無法判讀）癌旁正常組織中Nanog蛋白表達情況，99例（127例中28例脫片或無法判讀）食管鱗癌組織和73 例（82 例中9 例脫片）癌旁正常組織中MMP-2的蛋白表達狀況，及119例（127例中8例脫片或無法判讀）食管鱗癌組織和81例（82例中1例脫片）癌旁正常組織中MMP-9的蛋白表達狀況。免疫組化染色結果由兩位病理學專家閱片，結果判定根據(jù)陽性細胞比例及染色程度進行評分。

1.3 生物信息學分析

在GEO（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫中篩選胚胎干性相關實驗數(shù)據(jù)，排除敲低或過表達基因等實驗干擾數(shù)據(jù)集后選擇GSE13834 數(shù)據(jù)集進行分析。利用GEO2R在線分析工具分析GSE13834數(shù)據(jù)集中具有差異的mRNA；利用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）網(wǎng)站分析差異表達的mRNA主要富集的通路。TIMER網(wǎng)站（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）分析TβR1和MMP-2及MMP-9的相關性。

1.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

食管癌細胞株TE-1細胞購自上海復祥生物科技有限公司。將對數(shù)生長期的TE-1細胞按照1.5×105/孔接種于六孔板（含有10%胎牛血清的RPMI1640），細胞融合達到60%～70%時加入siRNA與Lip2000的混合物到無血清培養(yǎng)基，孵育6 h后更換為完全培養(yǎng)基，48 h后進行后續(xù)實驗操作。siRNA由上海吉瑪公司合成，Nanog的靶序列如下：正向5'-GGAGGUCCUAUUUCUCUAA-3'和反向5'-UUAGAGAAAUAGGACCUCC-3'。

1.5 劃痕實驗

將細胞以2×105/孔的密度接種于六孔板，培養(yǎng)至90%融合。用200 μL無菌移液管尖端垂直在單層細胞上劃一條線，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在0、12、24、48 h時拍照，使用Image J測量劃痕面積并計算遷移率，遷移率計算公式為：（0 h劃痕面積-12、24、48 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.6 Western blotting實驗

將轉(zhuǎn)染48 h后的細胞提取蛋白后，用10%的SDSPAGE凝膠分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%BSA 封閉，并與所指示的一抗孵育，包括Nanog、TβR1、p-Smad2/3、MMP-2、MMP-9及β-actin，然后在室溫下與二抗孵育2 h。TBST洗膜5 min共6次后加入顯影液進行曝光顯影。

1.7 qRT-PCR實驗

使用RNA提取試劑盒提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）和熒光定量PCR試劑盒（康為）分別進行反轉(zhuǎn)錄和定量分析，通過2–ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。使用引物均由上海生工公司合成，引物序列：Nanog上游：5'-AATGGTGTGACGCAGGGATG-3'，下游：5'-TGCACCAGGTCTGAGTGTTC-3'；TGFβR1 上游：5'-CCTCGAGATAGGCCGTTTGT-3'，下游：5'-GCAATGGTAAACCAGTAGTTGGA-3'。Smad-2上游5'TGGGGACTGAGTACACCAAA-3'，下游5'-ACTGTGAAGATCAGGCCAGC-3'；MMP-2上游5'-TGCTGAAGGACACACTAAAGAAGATG-3'，下游5'-GCTTGCGAGGGAAGAAGTTGTAG-3'；MMP-9 上游5'-CGAACTTTGACAGCGACAAGAAG-3'，下游5'-CGGCACTGAGGAATGATCTAAGC-3'；βactin 上游5'-AACCGCGAGAAGATGACCCAG-3'，下游5'-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA-3'。

1.8 統(tǒng)計學方法

臨床樣本量根據(jù)成組設計兩樣本率比較公式n=［（zα+zβ）2×2πc （1－πc）］/（π1－π2）2計算，根據(jù)預實驗得出Nanog 食管鱗癌樣本量陽性率π1=65%，Nanog 食管鱗癌癌旁組織樣本量陽性率π2=5%，設α=0.05，β=0.10，計算得出最小樣本量為11例/組，本實驗在最小樣本量的基礎上隨機收集所得。

使用統(tǒng)計學軟件SPSS26.0進行數(shù)據(jù)分析。食管鱗癌及癌旁正常組織中的蛋白表達水平及其與食管癌患者臨床病理參數(shù)的關系采用χ2分析；使用Spearman 秩相關分析Nanog和MMP-2/MMP-9蛋白在在食管鱗癌中表達的相關性；采用Kaplan-Meier分析比較Nanog和MMP-2/MMP-9蛋白低表達和高表達患者之間總體生存的差異；兩組間比較采用t檢驗。以Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Nanog、MMP-2/MMP-9 蛋白在食管鱗癌組織中表達上調(diào)

免疫組化結果顯示，Nanog、MMP-2 及MMP-9 蛋白表達均主要定位于細胞漿中，其在食管鱗癌組織中的表達均明顯高于癌旁正常組織（圖1，表2，Plt;0.01）。

2.2 Nanog、MMP-2/MMP-9 蛋白表達與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關系

食管鱗癌樣本組織中Nanog、MMP-2/MMP-9蛋白表達與腫瘤浸潤深度密切相關（χ2=23.9，Plt;0.01；χ2=6.029，Plt;0.05；χ2=11.89，Plt;0.05），有淋巴結轉(zhuǎn)移的樣本中MMP-2/MMP-9 蛋白表達高于無淋巴結轉(zhuǎn)移樣本（χ2=10，08，Plt;0.01；χ2=5.731，Plt;0.05），而Nanog蛋白表達在有淋巴結轉(zhuǎn)移和無淋巴結轉(zhuǎn)移的樣本中差異沒有統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。食管鱗癌組織中Nanog、MMP-2/MMP-9蛋白表達與年齡、性別和腫瘤分化程度相關性不顯著（Pgt;0.05，表3）。

2.3 Nanog、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與食管鱗癌患者預后的關系

Kaplan-Meier生存分析顯示，在食管鱗癌患者組織樣本中Nanog、MMP-2及MMP-9低表達組的術后中位生存時間分別為40、30、32月，Nanog、MMP-2及MMP-9蛋白高表達組患者的術后中位生存時間均為19 月。Nanog、MMP-2及MMP-9蛋白高表達組患者生存時間短于低表達患者（Plt;0.001，P=0.004，P=0.017，圖2）。

2.4 Nanog 和MMP-2/MMP-9 蛋白表達在食管鱗癌中呈正相關

相關分析結果顯示，Nanog、MMP-2/MMP-9 蛋白在食管鱗癌中表達均上調(diào)且呈正相關（r=0.205，P=0.045；r=0.307，Plt;0.001，表4）。

2.5 Nanog 可能通過TGF- β 信號通路影響 MMP-2/MMP-9蛋白的表達

生物信息學分析顯示，Nanog等干性相關基因主要富集在TGF-β信號通路；TIMER網(wǎng)站的相關性分析顯示，食管癌中TβR1與MMP-2/9呈正相關（圖3）。Nanog與TβR1、p-Smad2/3蛋白的表達水平呈正相關（r=0.318，P=0.001；r=0.301，P=0.002），且MMP-2/MMP-9 與TβR1、p-Smad2/3蛋白的表達水平也呈正相關（r=0.448，Plt;0.001，r=0.303，P=0.004；r=0.202，P=0.045，r=0.239，P=0.015，表5）［13］。

2.6 體外細胞學實驗分析探討Nanog 對食管鱗癌細胞遷移能力的影響

qRT-PCR和Western blot 檢測結果顯示，si-Nanog組Nanog 的mRNA及蛋白表達水平明顯低于對照組（Plt;0.05，圖4A、B）。劃痕實驗結果顯示，與對照組相比，敲低Nanog 后食管鱗癌細胞的遷移率明顯降低（Plt;0.05，圖4C）。

2.7 Nanog 通過TGF-β 信號通路促進食管鱗癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移

qRT-PCR 和Western blotting 結果顯示，與對照組相比，敲低Nanog 后TGF-β信號通路及侵襲遷移相關分子的mRNA水平及蛋白水平均明顯下降（圖5，Plt;0.05）。

3 討論

食管癌是我國高發(fā)的胃腸道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率高于全球平均水平［14］。多數(shù)食管癌患者出現(xiàn)癥狀時已是中晚期，易發(fā)生轉(zhuǎn)移導致生存預后不佳。因此，探究食管癌侵襲轉(zhuǎn)移機制，尋找新的治療及評估預后標志物是改善患者預后、提高生存率的重要手段。

有研究表明腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生是由于腫瘤干細胞的存在［15］，而Nanog是一種參與胚胎干細胞自我更新的轉(zhuǎn)錄因子［16］，參與維持腫瘤干細胞的干性特征，同時，它還可作為致癌基因，Nanog異常表達與多種癌癥進展有關。本實驗免疫組化結果顯示，Nanog蛋白在食管鱗癌組織中高表達，且Nanog高表達的食管鱗癌患者浸潤深度高于低表達患者，進一步Kaplan-Meier法分析顯示Nanog高表達組患者術后生存時間短于低表達組。這說明Nanog蛋白在食管鱗癌組織中高表達，其蛋白表達是影響食管鱗癌浸潤及影響患者術后生存的重要因素。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在上皮源性惡性腫瘤舌鱗狀細胞癌和尿路上皮癌中Nanog蛋白在癌組織中均呈高表達，且其蛋白高表達與患者不良預后密切相關［17， 18］。有研究表明，Nanog在食管鱗癌組織中高表達，其蛋白表達除與浸潤深度相關外還與腫瘤分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移相關［19］。這與本研究結果一致。

MMPs是生長性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移常見的病理因素之一［20］，有研究表明在口腔鱗狀細胞癌中抑制Nanog基因會降低MMP-2/9蛋白的表達從而減弱口腔鱗狀細胞癌的侵襲遷移能力［21］，MMP家族蛋白酶在生理和病理環(huán)境中對細胞外基質(zhì)（ECM）的降解和重塑起著至關重要的作用［22］，這些蛋白在炎癥、腫瘤發(fā)生和血管生成中發(fā)揮著充分作用［23］。本實驗結果表明，MMP-2/9蛋白在食管鱗癌中高表達且與浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關，生存分析提示MMP-2/9 是影響食管鱗癌患者術后生存的重要因素。已有研究表明，MMP-2/9在包括膀胱癌、乳腺癌、食管癌及頭頸癌等多種腫瘤中表達均上調(diào)［24］。

本研究Spearman 秩相關分析顯示，Nanog 與MMP-2/9蛋白表達呈正相關。我們通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選干性分子并對差異基因進行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，Nanog等干性分子主要富集在TGF-β等信號通路；同時在線網(wǎng)站TIMER 分析發(fā)現(xiàn)TβR1 與MMP-2/9 呈正相關，提示Nanog可能通過TGF-β信號通路影響MMP-2/MMP-9的表達。本課題組前期在同一批食管鱗癌芯片組織中的研究表明，TβR1、p-Smad2/3蛋白在食管鱗癌中高表達且TGF-β/Smad 信號通路與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關［13］。因此，進一步分析Nanog、MMP-2/9蛋白與TβR1、p-Smad2/3蛋白表達的相關性，結果顯示Nanog 與MMP-2/9 蛋白表達均與TGF- β/Smad信號通路蛋白表達成正相關，這與本研究生信結果一致。此外，體外實驗結果表明敲低Nanog后TGF-β且食管鱗癌細胞的遷移率降低，由此得出結論：Nanog通過TGF-β/Smad 信號通路影響食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)在食管癌中敲低Nanog 后MMP-9 mRNA水平降低［8］；在前列腺癌中沉默Nanog 會降低TGF-β1的表達，并降低Smad2的磷酸化［25］；另有研究表明TGF-β1 通過NF-κB 依賴性途徑增強神經(jīng)元施萬細胞中MMP-9的表達［26］。這些研究為本文觀點提供了有利的證據(jù)。

綜上所述，本研究通過免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)食管癌組織中Nanog、MMP-2、MMP-9蛋白均高表達且呈正相關，它們與食管癌浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移及不良預后密切相關；體外實驗表明Nanog 通過TGF-β信號通路調(diào)控MMP-2、MMP-9的表達從而影響食管癌的侵襲遷移。這為進一步研究Nanog影響食管鱗癌浸潤轉(zhuǎn)移的分子機制奠定了基礎，并有望為食管鱗癌的治療及預后提供新的參考和方向。

參考文獻：

[1] 鄭榮壽， 陳 茹， 韓冰峰， 等. 2022年中國惡性腫瘤流行情況分析[J].中華腫瘤雜志， 2024， 46（3）： 221-31.

[2] Zeng HM， Chen WQ， Zheng RS， et al. Changing cancer survival inChina during 2003-15： a pooled analysis of 17 population-basedcancer registries[J]. Lancet Glob Health， 2018， 6（5）： e555-67.

[3] Nafteux PR， Lerut AM， Moons J， et al. International multicenterstudy on the impact of extracapsular lymph node involvement inprimary surgery adenocarcinoma of the esophagus on overallsurvival and staging systems[J]. Ann Surg， 2015， 262（5）： 809-15.

[4] Zhu ZP， Xu JH， Li LL， et al. Effect of gastric cancer stem cell ongastric cancer invasion， migration and angiogenesis[J]. Int J MedSci， 2020， 17（13）： 2040-51.

[5] Li D， Peng XQ， He GP， et al. Crosstalk between autophagy andCSCs： molecular mechanisms and translational implications[J].Cell Death Dis， 2023， 14（7）： 409-13.

[6] Pádua D， Figueira P， Ribeiro I， et al. The relevance of transcriptionfactors in gastric and colorectal cancer stem cells identification anderadication[J]. Front Cell Dev Biol， 2020， 8： 442-9.

[7] Vasefifar P， Motafakkerazad R， Maleki LA， et al. Nanog， as a keycancer stem cell marker in tumor progression[J]. Gene， 2022， 827：146448-57.

[8] Deng L， Zhang XP， Xiang XC， et al. NANOG promotes cellproliferation， invasion， and stemness via IL-6/STAT3 signaling inesophageal squamous carcinoma[J]. Technol Cancer Res Treat，2021， 20： 11038492-56.

[9] Serej ZA， Ebrahimi A， Kazemi T， et al. NANOG gene suppressionand replacement of let-7 modulate the stemness， invasion， andapoptosis in breast cancer[J]. Gene， 2021， 801： 145844-53.

[10]Vasefifar P， Najafi S， Motafakkerazad R， et al. Targeting Nanogexpression increased Cisplatin chemosensitivity and inhibited cellmigration in Gastric cancer cells[J]. Exp Cell Res， 2023， 429（2）：113681-8.

[11] Samantaray S， Sharma R， Chattopadhyaya TK， et al. Increasedexpression of MMP-2 and MMP-9 in esophageal squamous cellcarcinoma[J]. J Cancer Res Clin Oncol， 2004， 130（1）： 37-44.

[12]Ma K， Zhang C， Li WY. Gamabufotalin suppressed osteosarcomastem cells through the TGF?β/periostin/PI3K/AKT pathway[J].Chem Biol Interact， 2020， 331： 109275-83.

[13]楊 銘， 李 梅， 孫 暢， 等. TβR1 和p-Smad2/3 蛋白在哈薩克族食管鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義[J]. 華中科技大學學報： 醫(yī)學版，2023， 52（2）： 239-44.

[14]Sung H， Ferlay J， Siegel RL， et al. Global cancer statistics 2020：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin， 2021， 71（3）： 209-49.

[15]Nimmakayala RK， Leon F， Rachagani S， et al. Metabolicprogramming of distinct cancer stem cells promotes metastasis ofpancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Oncogene， 2021， 40（1）：215-31.

[16]Giri A， Kar S. Interlinked bi-stable switches govern the cell fatecommitment of embryonic stem cells[J]. FEBS Lett， 2024， 598（8）：915-34.

[17]Rodrigues MFSD， Xavier FCA， Andrade NP， et al. Prognosticimplications of CD44， NANOG， OCT4， and BMI1 expression intongue squamous cell carcinoma[J]. Head Neck， 2018， 40（8）：1759-73.

[18]Abdelbary AM， Atwa HA， Elfarargy OM， et al. Prognosticimplications of CD24， SOX2， and nanog expression in invasiveurothelial carcinoma[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol，2023， 31（6）： 421-8.

[19]李秀娟， 趙軼峰， 李明霞， 等. 食管鱗癌組織Nanog表達臨床意義分析[J]. 中華腫瘤防治雜志， 2014， 21（24）： 1962-5.

[20]Stillebroer AB， Mulders PF， Boerman OC， et al. Carbonic anhydraseIX in renal cell carcinoma： implications for prognosis， diagnosis，and therapy[J]. Eur Urol， 2010， 58（1）： 75-83.

[21]Kashyap T， Nath N， Mishra P， et al. Pluripotency transcription factorNanog and its association with overall oral squamous cell carcinomaprogression， cisplatin-resistance， invasion and stemness acquisition[J]. Head Neck， 2020， 42（11）： 3282-94.

[22]Alaseem A， Alhazzani K， Dondapati P， et al. Matrix Metalloproteinases：a challenging paradigm of cancer management[J].Semin Cancer Biol， 2019， 56： 100-15.

[23]Knapinska AM， Fields GB. The expanding role of MT1-MMP incancer progression[J]. Pharmaceuticals， 2019， 12（2）： 77-85.

[24]Gobin E， Bagwell K， Wagner J， et al. A pan-cancer perspective ofmatrix metalloproteases （MMP） gene expression profile and theirdiagnostic/prognostic potential[J]. BMC Cancer， 2019， 19（1）：581-7.

[25]Liu CM， Sheng MX， Lin LH， et al. NANOG regulates theproliferation of PCSCs via the TGF?β1/SMAD pathway[J]. OpenMed， 2020， 15（1）： 841-9.

[26]Muscella A， Vetrugno C， Cossa LG， et al. TGF-β1 activates RSC96Schwann cells migration and invasion through MMP-2 and MMP-9activities[J]. J Neurochem， 2020， 153（4）： 525-38.

（編輯：林 萍）

基金項目：國家自然科學基金（81860518）；石河子大學國際科技合作推進計劃項目（GJHZ202105）；兵團重點癌癥早診早治項目（CZ002907）