NLRP3蛋白介導(dǎo)烏司他丁減輕肢體缺血再灌注損傷

[摘要] 目的 觀察核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/NOD樣受體家族3（NOD like receptors family pyrin domain containing 3，NLRP3）通路在烏司他?。╱linastatin，UTI）預(yù)處理肢體缺血再灌注損傷中的作用情況。方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將21只SD大鼠分入對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組，每組7只。對(duì)實(shí)驗(yàn)組采取經(jīng)尾靜脈注射UTI干預(yù)，另兩組經(jīng)尾靜脈行生理鹽水干預(yù)，經(jīng)過10min，于一側(cè)股部切口，借助動(dòng)脈夾對(duì)股動(dòng)脈行夾閉處理，同時(shí)借助橡皮筋在恒定張力下對(duì)側(cè)支循環(huán)進(jìn)行環(huán)扎阻斷處理。3h后去除阻斷，并再灌注2h，取大鼠血清測(cè)量腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、IL-18；取部分腓腸肌–80℃凍存，PCR、Western blot法檢測(cè)NF-κB/NLRP3。另取一部分腓腸肌存儲(chǔ)于多聚甲醛內(nèi)，借助光鏡查看骨骼肌形態(tài)，切取小部分腓腸肌測(cè)定濕干比。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組濕干比、LDH、CK、IL-6、IL-18、TNF-α、NF-κB、NLRP3明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組濕干比、LDH、CK、IL-6、IL-18、TNF-α、NF-κB、NLRP3明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。結(jié)論UTI可通過NF-κB/NLRP3通路降低細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 缺血/再灌注損傷；炎癥反應(yīng)；NF-κB/NLRP3通路；烏司他丁

[中圖分類號(hào)] R982 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.26.017

Ulinastatin reduces ischemia-reperfusion injury mediated by NLRP3 in skeletal muscle

Department of Anesthesiology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigate the role of nuclear factor-κB（NF-κB）/NOD like receptors family pyrin domain containing 3（NLRP3）pathway in limb ischemia-reperfusioninjury（IRI）pretreated with ulinastatin（UTI）. MethodsTwenty-one SD ratswere randomly divided into Sham group， IRI group， UTI group. In UTI group， ulinastatin was injected after anesthesia. After 10 minutes， the animal model was established by claming the femoral artery and ligaturing collateral circulation. After 3h of ischemia， the clamp and tourniquet were removed and the rats underwent 2h of reperfusion. In the other groups， the homologous saline was also injected in the same time. Plasma concentrations of lactate dehydrogenase（LDH） and creatine kinase（CK）， interleukin（IL）-6，IL-18， tumor necrosis factor-α（TNF-α） were measured. The gastrocnemius muscle was harvested and immediately stored at –80℃. NF-κB and NLRP3 were detected by Western blot and PCR. The other section muscle was stored in triformol for HE staining. The wet/dry was also immediately detecting. ResultsThe level ofwet/dry， LDH， CK， IL-6， IL-18， TNF-α， NF-κB， NLRP3 IRIwere higherthan those in Sham group（<0.05）. The level of wet/dry， LDH， CK， IL-6， IL-18， TNF-α， NF-κB， NLRP3 IRIwere significantly lowerthan those in IRIgroup（<0.05）. ConclusionUlinastatin can reduce the cellular inflammatory response through the NF-κB /NLRP3 pathway， thereby achieving a protective effect on limb IRIin rats.

[Key words]Ischemia-reperfusion injury; Inflammatory response; NF-κB/NLRP3pathway; Ulinastatin

肢體缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）即肢體在一段時(shí)間內(nèi)供血明顯減少時(shí)沒有出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，反而在供血好轉(zhuǎn)時(shí)肢體出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷的病理生理現(xiàn)象。諸多因素可引發(fā)肢體IRI，包括遠(yuǎn)端血管重建術(shù)、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)、肢體骨折內(nèi)固定術(shù)、止血帶應(yīng)用時(shí)間過長(zhǎng)等^[1]。關(guān)于肢體IRI的研究多涉及炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡等，但在圍術(shù)期預(yù)防及早期干預(yù)缺乏有效手段，且具體機(jī)制尚未明晰。探討有效途徑防范并減輕肢體IRI極具價(jià)值。

烏司他丁（ulinastatin，UTI）為絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitor，SPI），屬于蛋白酶家族，在蛋白合成與降解中發(fā)揮重要作用，對(duì)腫瘤與炎癥起到一定抑制作用，可防止器官發(fā)生IRI^[2]。近年來，對(duì)UTI與IRI間的聯(lián)系已有許多深入研究，現(xiàn)已明確其可有效保護(hù)腦、心臟等器官的IRI^[3-4]。UTI通過抑制炎性活動(dòng)、抗血液凝固、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)酶活性、抗凋亡等機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的有效防治^[5]。NOD樣受體家族3（NOD like receptors family pyrin domain containing 3，NLRP3）在炎癥反應(yīng)中是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，通過抑制NLRP3炎癥小體激活可減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)器官功能，改善預(yù)后^[6]。在臨床上，UTI多用于治療器官衰竭、急性胰腺炎、敗血性休克等疾病^[7-8]。本研究探討UTI對(duì)大鼠肢體IRI的作用，并分析其是否通過NLRP3蛋白發(fā)揮作用，闡明其在大鼠肢體IRI中的安全有效性。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

21只雄性、成年SD大鼠，于SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，體質(zhì)量280～320g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物倫理編號(hào)：WYYY-AEC-2024-135，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0017]。采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組（UTI的用量為10000U/kg），每組7只。實(shí)驗(yàn)組建模前10min尾靜脈注射UTI，另兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同法注入生理鹽水。麻醉采取腹腔注射25%烏拉坦（5ml/kg），通過觀察睫毛反射、刺激下肢確定麻醉狀態(tài)，然后右下肢腹股溝區(qū)域切開，分離股動(dòng)脈、股靜脈并使用動(dòng)脈夾夾閉，同時(shí)借助橡皮筋在恒定張力下對(duì)該側(cè)肢體進(jìn)行環(huán)扎，對(duì)照組只進(jìn)行手術(shù)操作而未行夾閉。待肢體不再呈紅潤(rùn)狀態(tài)轉(zhuǎn)為暗紫色時(shí)，說明缺血成功，缺血3h，恢復(fù)血供2h，然后收集骨骼肌、血清，用于后續(xù)測(cè)定。

1.2主要試劑及儀器

UTI（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20040505，生產(chǎn)單位：廣東天普生化醫(yī)藥公司，規(guī)格：1ml：5萬U）；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗IgG（英國(guó)Abcam公司）；內(nèi)參β-actin（美國(guó)Bioworld Technology公司）；NLRP3單抗、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB） p65單抗（英國(guó)Abcam公司）；PCR引物（上海捷瑞公司）；IL-18、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），ELISA試劑盒（上海西塘公司）；乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒（南京建成研究所）；酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；顯微鏡（日本Olympus公司）；垂直電泳系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）；PCR儀（日本Bioer公司）；蛋白核酸分析儀（英國(guó)Thermo fisher公司）。

1.3 檢測(cè)方法

腓腸肌濕/干重（wet/dry，W/D）比值測(cè)定借助恒溫干燥箱（55℃）可獲得組織干重，W/D比值可反映組織水腫程度。將腓腸肌移入10%聚甲醛內(nèi)固定1d，行常規(guī)脫水處理，然后依次進(jìn)行透明、石蠟包埋與切片處理，再經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色，最后光鏡下觀察骨骼肌形態(tài)。

將大鼠血漿先于37℃下進(jìn)行5min水浴處理，然后離心處理（4℃、3000轉(zhuǎn)/min），采集上清。逐一把抗大鼠TNF-α、IL-18、IL-6單抗包被于酶標(biāo)板上，并分別結(jié)合樣品，再添加氧化抗大鼠TNF-α、IL-18、IL-6，完成免疫復(fù)合物制備，再完成與板的連接處理，把底物工作液放入其中，顯示藍(lán)色，添加硫酸終止液，450nm處測(cè)定值，此值和TNF-α、IL-18、IL-6濃度存在正向聯(lián)系，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線明確標(biāo)本內(nèi)各自的濃度值。

完成蛋白提取處理后，測(cè)定所提取蛋白濃度。在室溫環(huán)境下，蛋白用10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳，NF-κB和NLRP3向PVDF膜濕轉(zhuǎn)，結(jié)束后用5%脫脂奶粉封閉2h，用TBST進(jìn)行3遍洗膜處理，10min/遍，隨后將NLRP3（1：1500）、NF-κB（1：2000）、β-actin（1：500）一抗放入，4℃下進(jìn)行一整夜孵育，TBST進(jìn)行3遍洗膜處理，10min/遍，放入標(biāo)志物為生物素二抗，于室溫下孵育60min，TBST洗膜3遍，10min/遍。先充分混合增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，再將條帶覆蓋住，借助凝膠成像系統(tǒng)完成圖像采集工作，再對(duì)各目標(biāo)條帶通過軟件Image J逐一測(cè)定值。

提取RNA，同時(shí)測(cè)定濃度，對(duì)所得cDNA進(jìn)行擴(kuò)增處理，得到基因片段，于100V穩(wěn)定電壓下進(jìn)行半小時(shí)電泳處理，再通過凝膠成像系統(tǒng)開展攝像分析，借助Image J計(jì)算電泳條帶灰度值。大鼠NF-κB引物正向：5’-TTCAACATGGCAGACGA CGA-3’，反向5’-AGGTATGGGCCATCTGTTGAC-3’；NLRP3引物正向：5’-TGATGAGTGTTC GCT GCAAG-3’，反向：5’-GGATCGGAACACAGCC TTTC-3’；內(nèi)參β-actin引物正向：5’-ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3’，反向：5’-GCCAGGATAGAGCCACCAAT-3’。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ｘ±ｓ）表示，采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，兩兩對(duì)比時(shí)，對(duì)方差齊性數(shù)據(jù)選擇LSD法，對(duì)方差不齊性數(shù)據(jù)選擇Dunnet’檢驗(yàn)。<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1三組大鼠腓腸肌形態(tài)變化

對(duì)照組分布著規(guī)則的多邊形肌纖維，細(xì)胞未發(fā)

生腫脹，間質(zhì)呈正常結(jié)構(gòu)，血管周邊無明顯炎癥細(xì)胞。模型組肌纖維缺乏規(guī)則性，且染色深度大幅下降，細(xì)胞明顯腫脹，血管附近可觀察到較多炎性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞染色深度稍顯減小、界限顯得模糊，可觀察到血管附近有少量炎癥細(xì)胞，但與模型組比較有較大改善，見圖1。

2.2三組大鼠骨骼肌W/D比值與CK、LDH比較

對(duì)照組W/D比值偏小，與對(duì)照組比較，模型組W/D比值增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組W/D比值減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。與對(duì)照組比較，模型組CK、LDH含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組CK、LDH含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）見表1。

2.3三組大鼠血清IL-6、IL-18、TNF-α水平比較

與對(duì)照組比較，模型組IL-6、IL-18及TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組IL-6、IL-18及TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），見表2。

2.4 骨骼肌NF-κB和NLRP3基因表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，模型組骨骼肌NF-κB、NLRP3表達(dá)上調(diào)（<0.05）；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組骨骼肌NF-κB、NLRP3表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。見圖2。

2.5 骨骼肌NF-κB和NLRP3蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組骨骼肌NLRP3和NF-κB蛋白值與內(nèi)參值占比增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組骨骼肌NLRP3和NF-κB蛋白值與內(nèi)參值占比減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），見圖3。

3討論

IRI帶來的傷害不僅只有肢體，其他重要器官也會(huì)受累?；钚匝鯇W(xué)說與炎癥介質(zhì)學(xué)說表明，在炎癥出現(xiàn)時(shí)，會(huì)釋放一些炎性介質(zhì)，絕大部分是細(xì)胞因子、激活補(bǔ)體與趨化因子^[9-10]。TNF-α不僅具有促炎效能，還可誘發(fā)炎性活動(dòng)和免疫應(yīng)答，使淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞活化，有助于合成黏附分子、IL-6、IL-1等炎性因子，增加組織受損程度^[11]。研究表明肢體缺血再灌注后血中IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子水平上調(diào)^[12-13]。研究表明，下肢I(xiàn)RI后血中TNF-α水平在再灌注1h后達(dá)到高峰，IL-6水平與再灌注時(shí)長(zhǎng)呈正相關(guān)^[14]。本研究中肢體發(fā)生IRI時(shí)，骨骼肌細(xì)胞中釋放出大量CK、LDH、IL-6、IL-18、TNF-α，經(jīng)UTI干預(yù)后，各指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)。既往研究表明，IRI發(fā)生后，不僅細(xì)胞層面變化明顯，在組織層面也可觀察到骨骼肌肌纖維排列混亂、無規(guī)則，在肌纖維周圍出現(xiàn)炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞，組織W/D比值明顯升高^[15]。本研究實(shí)驗(yàn)光鏡下，肌纖維在每組表現(xiàn)不同，經(jīng)UTI處理后，肌纖維破壞有所減輕。

研究表明NF-κB/NLRP3通路在各器官IRI所致的炎性活動(dòng)中普遍存在，NF-κB屬于NF-κB/Rel家族，且起著關(guān)鍵性作用。在炎性活動(dòng)網(wǎng)格中，NF-κB激活發(fā)揮核心作用，激活態(tài)NF-κB向胞核中轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)促炎因子的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)^[16]。細(xì)胞焦亡是與炎癥相關(guān)的一類程序性細(xì)胞壞死，待其遭受攻擊后，激活NLRP3炎癥小體，促進(jìn)相關(guān)因子IL-1β和IL-18的釋放^[17-18]。細(xì)胞焦亡作為缺血再灌注進(jìn)展的原因之一，被認(rèn)為是最常見的炎癥細(xì)胞死亡途徑，其激活方式可分為經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑^[19]。經(jīng)典途徑中NLRP3是NF-κB的下游通路分子，若其為活化狀態(tài)，凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白釋放自身效能，通過其N端效應(yīng)結(jié)構(gòu)聯(lián)合未成熟caspase-1前體產(chǎn)生復(fù)合物，使得caspase-1前體呈活化狀態(tài)，再經(jīng)由切割效應(yīng)，使IL-1β、IL-18前體向成熟狀態(tài)發(fā)展，細(xì)胞的胞外水分進(jìn)而發(fā)生內(nèi)流，胞膜隨之失去完整性，其內(nèi)部炎癥因子被釋放，造成IRI^[3]。細(xì)胞焦亡的發(fā)生依靠NLRP3的激活，并通過正反饋調(diào)節(jié)IL-1β、IL-18等細(xì)胞因子的釋放，這些因子可加重炎癥反應(yīng)，造成IRI。因此NF-κB/NLRP3相互關(guān)聯(lián)相互作用加重炎癥反應(yīng)。

研究表明，在肢體缺血再灌注引起的肺損傷中，靶向下調(diào)NLRP3含量，可減慢IRI進(jìn)展，肺功能受到保護(hù)^[20]。UTI作為SPI蛋白酶家族的主要成員，與蛋白合成、降解活動(dòng)存在主要聯(lián)系，同時(shí)和炎癥、腫瘤受抑制有關(guān)，具有保護(hù)器官IRI能力，且被證實(shí)可有效抵抗急、慢性炎癥，其機(jī)制在于抑制NF-κB途徑，下調(diào)NF-κB/NLRP3通路中相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥^[16]。本研究中，與對(duì)照組比較，模型組NF-κB/NLRP3蛋白明顯升高，經(jīng)UTI干預(yù)后相關(guān)蛋白大幅下調(diào)。與對(duì)照組比較，模型組各指標(biāo)均上調(diào)?？梢娫跈C(jī)體處在缺血再灌注環(huán)境時(shí)，可釋放眾多炎癥相關(guān)因子，給予UTI干預(yù)，各項(xiàng)指標(biāo)均下調(diào)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–06–01）

（修回日期：2024–07–16）