阿爾茨海默病和血管性癡呆關(guān)鍵致病基因的篩選與鑒定

[摘要] 目的利用生物信息學(xué)方法分析阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）和血管性癡呆（vascular dementia，VD）與正常對照組的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），篩選關(guān)鍵基因并驗(yàn)證它們與這兩種癡呆的關(guān)系。方法 從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）獲取基因芯片數(shù)據(jù)集GSE122063，用GEO2R工具篩選AD、VD與正常對照組的DEGs，利用STRING數(shù)據(jù)庫建立蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape篩選關(guān)鍵基因；利用DAVID數(shù)據(jù)庫分析有網(wǎng)絡(luò)連接的DEGs的基因本體（gene ontology，GO）富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路，預(yù)測DEGs的生物學(xué)功能；最后驗(yàn)證關(guān)鍵基因的表達(dá)，采用受試者操作特征曲線檢測診斷效果。結(jié)果 AD和VD組分別篩選出1099個(gè)和505個(gè)DEGs，其中69個(gè)在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中有關(guān)聯(lián)。根據(jù)GO分析，DEGs主要存在于細(xì)胞的外側(cè)質(zhì)膜、表面和質(zhì)膜，它們通過影響信號傳導(dǎo)、炎癥應(yīng)答等生物過程和具有受體結(jié)合、信號受體活性等功能，共同導(dǎo)致癡呆的發(fā)生。根據(jù)KEGG分析，DEGs在微生物感染、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病等免疫相關(guān)信號通路中有顯著富集。鑒定4個(gè)關(guān)鍵基因：CCR5、CCL2、FCGR2A和ITGB2，它們在AD和VD組中均有高表達(dá)，這些基因的曲線下面積表明它們可能對癡呆的診斷有價(jià)值。結(jié)論通過生物信息學(xué)方法分析AD和VD，發(fā)現(xiàn)富集的信號通路和關(guān)鍵基因與免疫和炎癥有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 阿爾茨海默??；血管性癡呆；生物信息學(xué)分析；差異表達(dá)基因

[中圖分類號] R741.02 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.26.003

Screening and identification of key pathogenic genes for Alzheimer’s disease and vascular dementia

1.Department of Laboratory Medicine， the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， Zhejiang， China; 2.Department of Laboratory Medicine， Tongde Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou 310012， Zhejiang， China

[Abstract]Objective This study utilizes bioinformatics methods to analyze differentially expressed genes （DEGs） between Alzheimer’s disease （AD） and vascular dementia （VD） compared to normal controls. The aim is to identify key genes and validate their relevance to both types of dementia. Methods Gene chip dataset GSE122063 were obtained from the Gene Expression Omnibus （GEO） database. Using the GEO2R tool， DEGs in AD， VD， and normal control group were screened. We constructed a protein-protein interaction network using the STRING database and identified key genes through Cytoscape. Subsequently， DAVID database were used to analyze gene ontology （GO） enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathways associated with interconnected DEGs， predicting their biological functions. Finally， diagnostic performance were validated and assessed by using receiver operating characteristic curves. Results In the AD and VD groups， we identified 1099 and 505 DEGs， respectively， with 69 genes showing associations in the protein-protein interaction network. GO analysis revealed that DEGs are primarily located in the extracellular matrix， cell surface， and plasma membrane. They influence biological processes such as signal transduction and inflammatory responses， with functions related to receptor binding and signal receptor activity， collectively contributing to dementia development. KEGG analysis indicated significant enrichment of DEGs in immune-related signaling pathways， including microbial infections， rheumatoid arthritis， systemic lupus erythematosus， and inflammatory bowel disease. Four key genes—CCR5， CCL2， FCGR2A， and ITGB2—with significantly elevated expression in both AD and VD groups were indentified. The area under the curve suggests their potential diagnostic value for dementia.ConclusionThrough bioinformatics analysis of AD and VD， the enriched signaling pathways and key genes associated with immunity and inflammation were discovered. These findings may play a crucial role in dementia progression and provide new insights for early diagnosis.

[Key words]Alzheimer’s disease; Vascular dementia; Bioinformatics analysis; Differentially expressed genes

癡呆是一種逐漸剝奪人類記憶力、思維能力和社會能力的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，隨著中國及全球人口老齡化的加劇，其發(fā)病率不斷攀升，成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)^[1]。癡呆的發(fā)病機(jī)制尚未明確，這在某種程度上阻礙了疾病的早期識別和精準(zhǔn)治療。阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）和血管性癡呆（vascular dementia，VD）是癡呆的兩種主要類型，AD占所有類型癡呆的60%～80%，VD是最常見的非變性病癡呆^[2-4]。AD的病理學(xué)研究主要集中在兩種蛋白質(zhì)的異常沉積：β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）和tau蛋白^[5]。Aβ在細(xì)胞外形成斑塊，tau蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成纖維纏結(jié)。這些病理變化與神經(jīng)炎癥、突觸損傷和神經(jīng)元死亡相關(guān)，導(dǎo)致認(rèn)知功能喪失。VD主要與小血管疾病、動脈粥樣硬化、多發(fā)性梗死、血管性白質(zhì)腦病和海馬壞死等因素有關(guān)。盡管AD和VD在臨床和病理上有所不同，但都會導(dǎo)致認(rèn)知能力嚴(yán)重下降^[6-8]。盡管現(xiàn)有研究已開始關(guān)注AD和VD的發(fā)病機(jī)制，但對其分子機(jī)制的理解仍不足。本研究利用在線數(shù)據(jù)庫的組學(xué)數(shù)據(jù)，分析AD和VD患者與正常人間的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），并進(jìn)一步研究導(dǎo)致AD和VD發(fā)病的關(guān)鍵基因，為癡呆癥的早期識別和干預(yù)提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 獲取基因數(shù)據(jù)

從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）下載GSE122063的基因微陣列數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集基于GPL16699平臺，包括56個(gè)AD樣本、36個(gè)VD樣本和44個(gè)非癡呆對照組樣本。

1.2 篩選差異基因

GEO2R是一個(gè)在線工具，可比較GEO系列中的多個(gè)樣品組并篩選出差異基因，將AD組和VD組與對照組比較。DEGs的甄選標(biāo)準(zhǔn)：調(diào)整后<0.05且|log FC|≥1.0。

1.3 構(gòu)建蛋白網(wǎng)絡(luò)

STRING數(shù)據(jù)庫著力于構(gòu)建與分析蛋白質(zhì)間既有的及預(yù)測的交互網(wǎng)絡(luò)，采用結(jié)合分值超過0.4的閾值表示中等及以上強(qiáng)度的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）。利用Cytoscape軟件3.10.0對獲取的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化展示。

1.4 基因集富集分析

利用DAVID Version 6.8（https：//david.ncifcrf. gov/）對篩選的DEGs進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析。設(shè)定值和FDR值均<0.05作為篩選閾值，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 驗(yàn)證關(guān)鍵基因

GSE122063數(shù)據(jù)經(jīng)log2處理，利用R（4.3.0）preprocessCore包進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，對多個(gè)探針計(jì)算對應(yīng)基因的平均值。使用ggpubr包和Wilcoxon test比較兩組的表達(dá)差異。使用受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC曲線）分析評估關(guān)鍵基因在癡呆癥診斷中的有效性。

2 結(jié)果

2.1 篩選顯著DEGs

使用GEO2R工具繪制差異基因火山圖，AD組篩選出1099個(gè)DEGs，包括402個(gè)上調(diào)和697個(gè)下調(diào)。VD組篩選出505個(gè)DEGs，包括165個(gè)上調(diào)和340個(gè)下調(diào)。通過VENN工具得到兩組DEGs的255個(gè)重疊基因，見圖1。

2.2 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并篩選關(guān)鍵基因

從255個(gè)DEGs中剔除非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），專注于編碼蛋白的DEGs，利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape進(jìn)行關(guān)聯(lián)構(gòu)建和可視化。網(wǎng)絡(luò)中的139個(gè)節(jié)點(diǎn)代表剔除ncRNA后的139個(gè)DEGs，這些被STRING數(shù)據(jù)庫識別并用于構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中的69個(gè)DEGs通過209條邊形成緊密的蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，見圖2。使用Cytoscape的cytoHubba插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行基于4種拓?fù)浞治鏊惴ǖ姆治觯鹤畲髨F(tuán)中心性（maximal clique centrality， MCC）、最大鄰域組件密度（density of maximum neighborhood component，DMNC）、最大鄰域組件（maximum neighborhood component，MNC）、度中心性，分別可視化4種算法下位居前10的關(guān)鍵基因，并用韋恩圖取交集篩選得到4個(gè)重疊的關(guān)鍵基因：CCR5、CCL2、FCGR2A、ITGB2。

2.3 DEGs功能及通路分析

利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對上述69個(gè)具有蛋白交互關(guān)系的DEGs進(jìn)行GO和KEGG分析。GO分析表明，DEGs 在生物過程（biology process，BP）方面主要涉及細(xì)胞間信號傳導(dǎo)、炎癥應(yīng)答等；在細(xì)胞組分（cellular component，CC）方面主要分布于外側(cè)質(zhì)膜、血小板微粒等部位；在分子功能（moleclar function，MF）層面主要集中在受體結(jié)合、跨膜信號受體活性、信號受體活性等功能上。KEGG通路分析顯示，DEGs涉及多種與微生物感染相關(guān)的通路（如冠狀病毒和弓形蟲感染）及其他通路（如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病等），見圖3。

2.4 驗(yàn)證關(guān)鍵基因的表達(dá)和診斷效果

分析CCR5、CCL2、FCGR2A、ITGB2在癡呆疾病中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)AD和VD患者組織中的這些基因的mRNA表達(dá)上調(diào)，見圖4。采用ROC曲線對CCR5、CCL2、FCGR2A、ITGB2的診斷效率進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果顯示CCR5、CCL2、FCGR2A、ITGB2的曲線下面積（area under the curve，AUC）分別為0.840、0.795、0.804、0.809，均>0.75，見圖5。

3 討論

隨著全球人口老齡化的加速，癡呆（特別是AD和VD）已成為全球健康的主要挑戰(zhàn)之一^[9]。盡管癡呆癥的病理機(jī)制已有一定的研究，但其分子層面的復(fù)雜性仍是一個(gè)未解之謎，迫切需要更多的生物標(biāo)志物來輔助診斷和治療策略的發(fā)展。

本研究選取GSE122063數(shù)據(jù)集，分析其基因表達(dá)數(shù)據(jù)，尋找癡呆癥相關(guān)基因。首先分析AD、VD和對照組的差異基因，AD組1099個(gè)DEGs，VD組505個(gè)DEGs。其次，鑒定并驗(yàn)證關(guān)鍵基因CCR5、CCL2、FCGR2A、ITGB2在AD和VD中的高表達(dá)， AUC值均>0.75，具有良好診斷價(jià)值。這些基因與免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)，與癡呆的炎性發(fā)病機(jī)制是一致的^[10]。CCR5是一種趨化因子受體，可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的遷移和活化。研究表明CCR5與AD的發(fā)展有著緊密的聯(lián)系，是一種關(guān)鍵的炎癥受體家族成員，且在AD的發(fā)展中起加速作用^[11-12]。CCL2是一種趨化因子，可招募免疫細(xì)胞到炎癥部位。一項(xiàng)系統(tǒng)性回顧分析發(fā)現(xiàn)，CCL2在AD患者的血液和腦脊液中的濃度顯著增加^[13-14]；也有研究報(bào)道CCL2在大腦中的過表達(dá)可加速Tau蛋白病理學(xué)的發(fā)展^[15]。FCGR2A是一種免疫球蛋白受體，可介導(dǎo)免疫細(xì)胞的吞噬和活化，這暗示FCGR2A在免疫反應(yīng)中的作用可能與癡呆癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。ITGB2是一種整合素，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和遷移，其表達(dá)增加與微膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)。微膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦內(nèi)主導(dǎo)的免疫細(xì)胞，在AD的神經(jīng)炎癥及神經(jīng)退行性進(jìn)程中扮演核心角色，ITGB2的微膠質(zhì)細(xì)胞亞群在能量代謝、細(xì)胞周期、血管生成、神經(jīng)髓磷脂形成和修復(fù)等方面具有特定功能，在AD患者的血液和腦脊液中的濃度顯著增加，這或可揭示ITGB2在癡呆癥病理生理過程中的潛在影響，表明其在疾病機(jī)制中扮演重要角色^[16-20]。這些基因的高表達(dá)可導(dǎo)致癡呆患者的神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)過度的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷和死亡。在未來的研究中，需要進(jìn)一步探索這些基因在不同類型癡呆癥中的具體作用及其如何與其他已知的病理過程發(fā)生關(guān)系。

最后，KEGG通路富集分析揭示與微生物感染的關(guān)聯(lián)，這與廣泛討論的AD病理機(jī)制的微生物假說一致，微生物參與維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的潛在原因。這些DEGs顯著富集于冠狀病毒、弓形蟲感染、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病等信號通路上。研究發(fā)現(xiàn)新冠病毒可導(dǎo)致類似AD的癡呆，這種關(guān)聯(lián)可能通過神經(jīng)炎癥和腦微血管損傷機(jī)制^[21]。弓形蟲感染可導(dǎo)致宿主行為的改變，這種行為改變被認(rèn)為是弓形蟲在大腦中引起的免疫反應(yīng)，潛在影響人類的行為，導(dǎo)致認(rèn)知功能下降^[22]。同時(shí)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病可能與認(rèn)知障礙和癡呆有關(guān)^[23]。這些通路都與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)有關(guān)，這進(jìn)一步支持本研究的假設(shè)，即免疫系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)的交互作用可能構(gòu)成癡呆癥進(jìn)展中的一個(gè)關(guān)鍵驅(qū)動因素，這種神經(jīng)炎癥可歸因于微生物感染，如新冠病毒和弓形蟲感染，這些感染可加劇或觸發(fā)癡呆癥狀。此外，這些通路也可能是癡呆的潛在治療靶點(diǎn)，通過調(diào)控這些通路，可減輕癡呆患者的癥狀，甚至阻止癡呆的發(fā)展。

總之，本研究可為進(jìn)一步闡明癡呆的發(fā)病機(jī)制提供新的線索。但本研究仍存在一定的局限性，如樣本集的規(guī)模較為有限，故亟需在更大規(guī)模的樣本集中復(fù)現(xiàn)研究，以確保研究成果的可靠性。此外，鑒于當(dāng)前研究主要依賴生物信息學(xué)的理論分析，未來有必要開展體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，對研究結(jié)論進(jìn)行實(shí)證性的補(bǔ)充與確認(rèn)。本研究采用計(jì)算生物信息學(xué)方法分析癡呆患者中的DEGs，表明CCR5、CCL2、FCGR2A、ITGB2是上調(diào)基因，同時(shí)具有較高的診斷價(jià)值，可能在癡呆癥中發(fā)揮重要作用，為癡呆癥的早期診斷和治療提供新的可能性。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–06–12）

（修回日期：2024–07–16）