陳皮精油對脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥的干預(yù)作用

摘 要： 基于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型研究陳皮精油抗炎作用。通過Griess法檢測一氧化氮（nitric oxide，NO）分泌水平，采用Real-time PCR法檢測細(xì)胞中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素 6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，陳皮精油顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的含量，抑制iNOS、COX-2、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)。綜上所述，陳皮精油通過抑制炎癥因子的分泌和表達(dá)，有效緩解由LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞： 陳皮；精油；抗炎；LPS；RAW264.7細(xì)胞

中圖分類號：S853.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4153-08

Intervention of Essential Oils from Citrus reticulata Blanco on Lipopolysaccharide-

induced Inflammation in RAW264.7 Cells

LIU" Ling "SHI" Wanyu "LI" Xiumei2， WANG" Minghua "ZHAI" Xianghe1*， ZHOU" Weiwei2*

（1.College of Chinese Veterinary Medicine， Hebei Agricultural University， Baoding 071000，

China;

2.Key Laboratory of Feed Biotechnology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

Institute of Feed Research， Chinese Academy of

Agricultural Sciences，" Beijing 10008 ""China）

Abstract：" The anti-inflammatory effect of essential oils from Citrus reticulata Blanco was investigated based on lipopolysaccharide （LPS）-induced RAW264.7 cell model. The level of Nitric oxide （NO） secretion was detected by Griess method， and the mRNA expression levels of tumor necrosis factor （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1β （IL-1β）， inducible nitric oxide synthase （iNOS） and cyclooxygenase 2 （COX-2） were determined by real-time PCR method. The results showed that essential oils from Citrus reticulata Blanco significantly decreased the level of NO released from LPS-induced RAW264.7 cells and inhibited the expression of iNOS， COX-2， IL-1β， IL-6 and TNF-α mRNA. In conclusion， essential oils from Citrus reticulata Blanco can inhibit the secretion and expression of inflammatory factors， and thus alleviate the inflammatory response induced by LPS in RAW264.7 cells effectively.

Key words：" Citrus reticulata Blanco; essential oils; anti-inflammatory; LPS; RAW264.7 cell

*Corresponding authors： ZHAI Xianghe， E-mail：zxh958@163.com; ZHOU Weiwei， E-mail： zhouweiwei@caas.cn

植物精油是由植物的根、莖、葉、花等部位提取出來的揮發(fā)性油狀液體，分子量較小，可隨水蒸氣蒸出，并伴有芳香氣味［1］。精油的主要成分是酚類化合物（萜類和苯丙類），如百里香酚、香芹酚和丁香酚［2］等。體外研究發(fā)現(xiàn)，精油在抗炎、抗菌、抗氧化、促生長和增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等方面都具有重要作用［2-3］。由于植物精油的天然性、安全性、有效性等優(yōu)勢使其在抗炎、增強(qiáng)免疫等方面的研究備受關(guān)注。

陳皮是蕓香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的成熟干燥果皮?！吨袊F藥典》2020版明確記載，藥材陳皮分為“陳皮”與“廣陳皮”，為我國傳統(tǒng)的中藥材之一，具有理氣健脾、燥濕化痰等功效［4］。它可改善食欲減少、腹脹、嘔吐泄瀉等癥狀［5］，常應(yīng)用于改善斷奶仔豬消化不良［6］、促進(jìn)豬生長［7］、改善肉雞生長性能和抗氧化功能［8］、提高蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)［9］、提高草魚免疫功能［10］等方面。陳皮的主要化學(xué)成分有揮發(fā)油類、黃酮類、生物堿類和微量元素等。其中陳皮精油為陳皮重要的藥效成分之一，果皮中含量較多，約為2%～4%，主要由單萜烯、倍半萜烯、含氧化合物三類成分組成，包括D-檸檬烯、γ-松油烯、β-月桂烯、α-蒎烯等［11］。其中，含量較高的成分主要為9，12-十八烷二烯酸甲酯、反-9-十八碳烯酸甲酯及亞麻酸甲酯［12］。目前，有研究表明陳皮精油主要通過降低大腸桿菌細(xì)胞脂代謝、三磷酸腺苷和生物膜合成以及延長細(xì)胞適應(yīng)期和降低細(xì)胞生長繁殖，來實現(xiàn)對大腸桿菌的抑菌作用［13］。另外，有研究發(fā)現(xiàn)陳皮精油在濃度高于40 mg·mL－1時，對 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）有較好的清除能力，濃度高于10 mg·mL－1時，對2，2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-硫磺）（ABTS＋）有較好的清除能力［14］。但目前有關(guān)陳皮精油抗炎活性的基礎(chǔ)研究相對較少。

因此，本研究嘗試基于細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，研究陳皮精油對炎性因子一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素 6（IL-6）、白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）、一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧化酶2（COX-2）的調(diào)節(jié)作用，以揭示陳皮精油的抗炎效果，為陳皮精油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳皮飲片（批號2106002）購自安國市康德瑞琪商貿(mào)有限公司；脂多糖（O127：B8）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素購自Life Technologies Gibco 公司；胎牛血清購自四季青公司；PBS緩沖液購自索萊寶公司；NO檢測試劑盒、CCK8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；TransScript RFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Green QpcrSuperMix購自北京全式金生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HEPA-100型CO2恒溫培養(yǎng)箱：美國Thermo Forma公司；TY201800010型全波長酶標(biāo)儀：Thermofisher Scientific公司；T100型cycler PCR儀：美國伯樂公司；CEX96實時熒光定量PCR儀：美國伯樂公司；Velocity 18R低溫高速離心機(jī)：美天儀拓實驗室設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藥物的配制

DMEM完全培養(yǎng)基的配制：在DMEM中加入10%胎牛血清和1%雙抗；陳皮精油工作液的配制：取適當(dāng)陳皮精油溶于DMSO中，用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋至所需工作濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用［15］。

1.3.2 精油的提取

本試驗通過水蒸氣蒸餾法萃取陳皮精油，稱取陳皮8 kg，加入15倍水，置于精油提取器中浸泡24 h，蒸餾時間12～14 h直至油量不再增加，收集陳皮精油備用，見圖1。

1.3.3 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)

在DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁至80%～90%時，棄去原有培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次，按照1∶3比例進(jìn)行傳代，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 細(xì)胞存活率

CCK8法測定陳皮精油對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響。取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以每孔2.0×104個細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL。每組濃度設(shè)置3個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁長至60%～70%時，棄上清，PBS洗2次。藥物組分別加入用完全培養(yǎng)基稀釋的陳皮精油工作液，使其最終濃度分別為1 000、800、600、400、200、100 μg·mL- 每組設(shè)置3個復(fù)孔，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。6 h后取出96孔板，每孔加入10 μL的CCK8工作液，放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育45 min，隨后在450 nm下檢測各孔OD值。根據(jù)以下公式計算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞活力（%）=［A加藥-A空白］/［A0加藥-A空白］×100。

A加藥：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的 OD 值；A0加藥：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的OD值；A空白：沒有細(xì)胞的孔的OD值。

1.3.5 NO水平檢測

通過Griess法測定陳皮精油對 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7細(xì)胞NO的分泌。取對數(shù)期生長的RAW264.7細(xì)胞，以每孔2.0×105個細(xì)胞接種于12孔板，每孔加入細(xì)胞懸液1 mL。待細(xì)胞貼壁長至60%～70%時，將完全培養(yǎng)基吸出，PBS洗2次，藥物組加入不同濃度的陳皮精油工作液（100、200、400 μg·mL-1），對照組與模型組更換新的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)6 h后，模型組以及藥物組每孔加入1 μL LPS處理12 h。細(xì)胞處理結(jié)束后，取細(xì)胞上清液于1.5 mL EP管中，600×g、4℃離心5 min。用完全培養(yǎng)基稀釋標(biāo)準(zhǔn)品為0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol·L－1。分別將樣品上清、標(biāo)準(zhǔn)品加入到96孔板中，每個孔50 μL，每個處理組設(shè)3個復(fù)孔。分別于各孔依次加入恢復(fù)室溫的Griess Reagent Ⅰ、Ⅱ 試劑各50 μL。在540 nm處測量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品NO含量。

1.3.6 炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平檢測

取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以每孔5.0×105個細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液2 mL。待細(xì)胞貼壁長至60%～70%時，將完全培養(yǎng)基吸出，PBS洗2次，藥物組加入不同濃度的陳皮精油工作液（100、200、400 μg·mL-1），對照組與模型組更換新的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)6 h后，模型組以及藥物組每孔加入2 μL LPS處理12 h。棄去細(xì)胞上清，預(yù)冷PBS洗3次，每孔加入1 mL TRIzol提取細(xì)胞的總RNA，使用cDNA合成試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，。將cDNA、引物、sybr qPCR Master Mix共同加入8連管制成20 μL溶液。實時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件為：95℃ 15 min（預(yù)變性）;95℃ 10 s（變性），60℃ 30 s（退火/延伸），擴(kuò)增 39 個循環(huán);95℃ 10 s，65℃ 5 s，95℃ 5 s（熔解曲線分析）。根據(jù)目的基因的Ct值和內(nèi)參基因GAPDH的Ct值，按照2-ΔΔCt法，計算樣本中目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，試驗結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”表示。組間數(shù)據(jù)差異性采用單因素方差分析，P＜0.05為有顯著性差異；P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 陳皮精油對 RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響

如圖2所示，通過CCK8法測定了陳皮精油對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)陳皮精油不同工作液濃度（1 000、800、600、400、200、100μg·mL-1）處理后與空白對照組相比，當(dāng)工作液濃度為600 μg·mL-1以下時細(xì)胞活力未受顯著抑制，且濃度為100、200 μg·mL-1的陳皮精油工作液對細(xì)胞活力有增強(qiáng)效果。

2.2 陳皮精油對 RAW264.7 細(xì)胞上清中NO含量的影響

NO是炎癥過程中重要的生物標(biāo)志物，大量的NO釋放會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇。通過檢測陳皮精油對 RAW264.7上清中NO含量的影響發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后NO釋放量極顯著增高（Plt;0.01），不同濃度的陳皮精油工作液處理后能夠有效抑制NO的釋放，且呈劑量依賴性，如圖3所示。

2.3 陳皮精油對 RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子iNOS和COX-2 mRNA表達(dá)水平的影響

iNOS和COX-2作為炎癥過程中的重要酶類，其可以催化大量促炎因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。通過檢測不同濃度陳皮精油工作液對 RAW264.7細(xì)胞中iNOS和COX-2 mRNA的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后 iNOS和COX-2的mRNA表達(dá)水平極顯著增高（Plt;" 0.01）。經(jīng)過100、200、400μg·mL-1劑量陳皮精油工作液處理后均能明顯地抑制由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥細(xì)胞中iNOS以及COX-2的表達(dá)，且存在劑量依賴關(guān)系，如圖4所示。

2.4 陳皮精油對 RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平的影響

TNF-α、IL-6、IL-1β在炎癥和自身免疫性疾病發(fā)展的過程中起到關(guān)鍵作用，在LPS誘導(dǎo)的炎癥模型中會大量產(chǎn)生。通過檢測陳皮精油對 RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)量"" 發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后，TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)水平均極顯著增高（Plt;0.01）。不同濃度的陳皮精油工作液預(yù)處理后能顯著抑制由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥細(xì)胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)，且存在劑量依賴關(guān)系，如圖5所示。

3 討 論

炎癥是機(jī)體正常的一種防御反應(yīng)，是機(jī)體在受到損傷時產(chǎn)生的一種保護(hù)性應(yīng)答。通常情況下，炎癥對于機(jī)體來說是有益的。但是，長時間持續(xù)、過度的炎癥會給機(jī)體造成巨大的損傷［16］。目前，應(yīng)用于臨床上的抗炎藥物主要有兩種，包括甾體抗炎藥和非甾體抗炎藥。盡管這兩種藥物都有較好的抗炎作用，但是長時間使用或過量使用都會對機(jī)體造成損害［17］。因此，研究者嘗試從天然植物中尋找綠色、安全的抗炎活性物質(zhì)。

目前，用于研究的體外炎癥模型有很多，誘導(dǎo)劑有葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium，DSS）、LPS等。王康等［18］研究發(fā)現(xiàn)，10 mg·mL－1 DSS可作用于Caco-2細(xì)胞構(gòu)建體外潰瘍性結(jié)腸炎細(xì)胞損傷模型。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，通常用于研究免疫系統(tǒng)和炎癥性疾病。丁青等［19］研究發(fā)現(xiàn)，100 ng·mL-1 LPS為誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生炎癥的最佳劑量。另外，孔祥鵬等［20］在優(yōu)化RAW264.7細(xì)胞炎癥模型時發(fā)現(xiàn)，LPS為20 ng·mL－1、誘導(dǎo)12 h能較好誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上本課題組進(jìn)一步試驗確定LPS為1 μg·mL－1、誘導(dǎo)時間為12 h時能夠誘導(dǎo)出較好的炎癥模型。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7可在LPS刺激下活化成M1型巨噬細(xì)胞，合成和釋放大量的炎癥介質(zhì)如NO、TNF-α、IL-6和IL-1β等［21］對機(jī)體造成損傷。IL-1β介導(dǎo)了炎癥的重要過程，在炎性疼痛中主要介導(dǎo)炎性痛敏。IL-1β可由多種細(xì)胞分泌，在生理條件下，其含量特別低，但在許多病理情況下會大量產(chǎn)生［22］。TNF-α作為炎癥反應(yīng)中始動因子，可使黏附的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，并促進(jìn)其他促炎細(xì)胞因子的表達(dá)［23］。IL-6為多功能炎性細(xì)胞因子，具有致炎和抗炎的雙向功能，當(dāng)產(chǎn)生過多時會引起一系列的炎性損害，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生［24］。NO在炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制復(fù)雜，不同酶產(chǎn)生的NO作用不一，在病理狀態(tài)中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）廣泛表達(dá)，NO水平升高造成局部組織損傷［25］。環(huán)氧化酶2（COX-2）是一種誘導(dǎo)酶，其在正常組織中少有表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激時能夠大量表達(dá)［26］。這些炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)了炎癥的重要過程，少量的促炎因子能夠在體內(nèi)免疫系統(tǒng)的幫助下發(fā)揮防御作用，而過量的促炎因子會對其它正常的組織細(xì)胞進(jìn)行攻擊，最終導(dǎo)致其大量產(chǎn)生時引起發(fā)熱和惡病質(zhì)。因此，抑制促炎因子的過度產(chǎn)生，阻止這些炎性介質(zhì)擴(kuò)大炎癥反應(yīng)范圍是抑制炎癥反應(yīng)的有效手段。

此外，有大量研究表明，植物精油及其單體成分均具有抗炎作用。Shen 等［27］發(fā)現(xiàn)，苦橙花精油在炎癥模型中能抑制炎癥因子NO、IL-6、IL-1β、TNF-α 基因的表達(dá)從而發(fā)揮抗炎效果。朱玲等［28］研究發(fā)現(xiàn)，大西洋雪松精油可以抑制炎癥相關(guān)酶iNOS的活力從而產(chǎn)生抗炎效果。De Morais Oliveira-Tintino等［29］發(fā)現(xiàn)，β-石竹烯協(xié)同 8-桉葉油素等成分，能夠抑制花生四烯代謝途徑中的炎癥細(xì)胞因子。同時， 8-桉葉油素可以緩解角叉菜膠引起的足腫脹和大鼠棉球肉芽腫脹。Kummer 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，寬葉柑橘精油中的檸檬烯可通過降低TNF-α的水平以及減少粒細(xì)胞和白細(xì)胞趨化因子從而緩解酵母多糖誘導(dǎo)的腹膜炎癥反應(yīng)。而陳皮精油中含有β-石竹烯、檸檬烯等單體成分，表明陳皮精油有一定的抗炎作用。另外，有研究證明陳皮精油中4-萜烯醇及二氫香芹酮等在一定濃度下可通過調(diào)節(jié)TNF-α炎癥信號通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖、修復(fù)胃腸炎癥損傷［31］。

4 結(jié) 論

本研究通過體外試驗發(fā)現(xiàn)，陳皮精油工作液在400 μg·mL-1及以下濃度時，可顯著降低LPS對RAW264.7細(xì)胞造成的損傷，并且呈劑量依賴性顯著降低LPS刺激細(xì)胞產(chǎn)生的NO、iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6和IL-1β，提示陳皮精油具有抗炎作用，為其今后的臨床應(yīng)用以及制劑開發(fā)提供了可靠的依據(jù)。

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（編輯 范子娟）