TSG101基因敲低對豬偽狂犬病病毒體外增殖的影響

摘 要： 本研究旨在使用慢病毒包裝敲低技術(shù)構(gòu)建敲低腫瘤易感基因（tumor susceptibility gene 10 TSG101）的慢病毒質(zhì)粒及穩(wěn)轉(zhuǎn) PK15 細(xì)胞系，并驗證該敲低細(xì)胞系對偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）感染的影響。針對TSG101 基因構(gòu)建并篩選，成功獲得重組慢病毒，用獲得的重組慢病毒感染 PK15 細(xì)胞，并使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)敲低 TSG101 基因的 PK15 細(xì)胞系。通過 Real-time PCR 以及 Western blot 方法對所構(gòu)建的細(xì)胞系進(jìn)行編輯效率檢測；使用 CCK-8 法對篩選出的細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞活力及生長狀況檢測；通過流式細(xì)胞術(shù)、Real-time PCR、Western blot 以及子代病毒滴度方法驗證該細(xì)胞系對 PRV 復(fù)制的影響；最后對 PRV 的吸附、進(jìn)入以及復(fù)制階段的試驗探究敲低 TSG101 基因?qū)τ?PRV 感染有影響的階段。結(jié)果表明，1）本研究所構(gòu)建的細(xì)胞系中 TSG101 的表達(dá)明顯降低，并將該細(xì)胞系命名為 sh-TSG101 細(xì)胞系；2）細(xì)胞活性檢測結(jié)果顯示，敲低TSG101 基因?qū)?xì)胞活性及生長情況無顯著影響；3）使用 PRV-GFP、PRV-QXX 感染 sh-TSG10 體外試驗證明敲低TSG101 對 PRV 的增殖有顯著的抑制作用。4）病毒的吸附、進(jìn)入以及復(fù)制試驗證明，敲低TSG101 在 PRV 的復(fù)制階段有明顯的抑制作用。綜上，本研究成功構(gòu)建TSG101基因敲低的 PK15 細(xì)胞系，體外敲低 TSG101 能夠顯著抑制 PRV 增殖，為 PRV 等 DNA 病毒性疾病的防控提供了新思路，并為進(jìn)一步探究 TSG101 調(diào)控 PRV 感染的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 腫瘤易感基因 101；偽狂犬病病毒；PK15 細(xì)胞

中圖分類號：S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4110-11

Effect of TSG101 Gene Knockdown on Proliferation of Pseudorabies Virus in vitro

WANG" Mengdi2， WANG" Yumin "ZHANG" Zhen2， LU" Xiuxiang "WANG" Heng "FAN" Wenjie

YAO" Chen "LIU" Pengxiang "MA" Yanjie "CHU" Beibei "WANG" Jiang1*， YANG" Guoyu 2*

（1.Key Laboratory of Animal Biochemistry and Nutrition， Ministry of Agriculture and

Rural Affiars， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046，" China;

2.College of Food and Bioengineering， Henan University of Animal

Husbandry and Economy， Zhengzhou 450046，" China）

Abstract： The aim of this study is to use lentiviral packaging knockdown technology to construct lentiviral plasmids for knocking down tumor susceptibility gene 101 （TSG101） and stably transfect PK15 cell lines， and to verify the impact of this knockdown cell line on PRV infection. A recombinant lentivirus was successfully constructed and screened for the TSG101 gene， and PK15 cells were infected with the obtained recombinant lentivirus. Puromycin was used for screening to obtain PK15 cell lines that knocked down the TSG101 gene. Perform editing efficiency testing on the constructed cell line using Real time PCR and Western blot methods; Use CCK-8 method to detect cell viability and growth status of the selected cell lines; Verify the effect of this cell line on PRV replication through flow cytometry， Real time PCR， Western blot， and progeny virus titer methods; Finally， experiments were conducted on the adsorption， entry， and replication stages of PRV to explore the impact of knocking down the TSG101 gene on PRV infection. The results showed that： 1） the expression of TSG101 was significantly reduced in the cell line constructed in this study， and the cell line was named sh-TSG101 cell line; 2） The results of cell viability testing showed that knocking down the TSG101 gene had no significant effect on cell viability and growth; 3） Using PRV-GFP and PRV-QXX to infect sh-TSG10 "in vitro experiments have shown that knocking down TSG101 has a significant inhibitory effect on PRV proliferation. 4） The adsorption， entry， and replication experiments of the virus have shown that knocking down TSG101 has a significant inhibitory effect on the replication stage of PRV. In summary， this study successfully constructed PK15 cell lines with TSG101 gene knockdown. Knocking down TSG101 in vitro can significantly inhibit PRV proliferation， providing new ideas for the prevention and control of DNA viral diseases such as PRV， and laying a foundation for further exploring the molecular mechanism of TSG101 regulating PRV infection.

Key words： TSG101; pseudorabies virus; PK15 cells

*Corresponding authors： YANG Guoyu， E-mail： haubiochem@163.com; WANG Jiang， E-mail： wangjiang@henau.edu.cn

偽狂犬病（pseudorabies，PR）是一種高度傳染性病毒性疾病，其致病病原體是屬于皰疹病毒科的一種 DNA 囊膜病毒［1-2］，即偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）。在 PRV 的諸多宿主中豬是該病毒的自然宿主［3］。動物感染 PRV 后，能夠在不同的生長階段表現(xiàn)出不同的癥狀，仔豬感染 PRV 后，主要出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和抽搐等癥狀［4］；成年豬感染 PRV 主要表現(xiàn)為精神不振、采食減少以及呼吸系統(tǒng)疾?。?］；母豬感染 PRV 會出現(xiàn)繁殖障礙、死胎、流產(chǎn)以及不孕等癥狀［6］。PRV 于20世紀(jì)50年代首次在中國被報道，而自 2011 年以來，部分地區(qū)開始出現(xiàn)新型 PRV 變異菌株，給養(yǎng)豬行業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［7］。盡管科學(xué)家們在過去幾年里一直致力于診斷方法的設(shè)計以及疫苗的研發(fā)，但 PRV 仍然是全球流行的廣泛傳播的傳染病，其對人類健康也存在潛在威脅［8］。

TSG101 基因最早是在小鼠的成纖維細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的，由于 TSG101 基因具有抑制腫瘤等作用，因此被命名為腫瘤易感基因（tumor susceptibility gene 10 TSG101）［9-10］。TSG101 基因的表達(dá)產(chǎn)物 TSG101 蛋白屬于細(xì)胞內(nèi)體分選復(fù)合物（host cell endosomal sorting complex，ESCRT-Ⅰ）的組成部分之一，在細(xì)胞蛋白的分選途徑中起重要作用，是細(xì)胞正常生理功能所必需的［11-12］。目前有研究發(fā)現(xiàn) TSG101 蛋白參與了人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV）的出芽，如果敲除TSG101基因，那么就會抑制 HIV 晚期病毒粒子的出芽［13］，從而抑制 HIV 感染。另外，TSG101 同樣在愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus， EBV）、甲型流感病毒（influenza A， virusIAV）、馬爾堡病毒（Marburg virus， MARV）和禽肉瘤病毒（avian sarcoma virus，ASV）

等多種病毒的感染作用中也同樣起重要的作用，能夠與病毒的多種蛋白相互作用從而輔助病毒出芽過程［14］。

慢病毒載體（lentivirus vector， LV）是一類來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，能夠穩(wěn)定介導(dǎo)基因沉默，具有轉(zhuǎn)染效率高及穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)勢［15］。因此，為了探索 TSG101 是否也參與 PRV 感染宿主細(xì)胞的過程，本研究利用慢病毒載體包裝技術(shù)構(gòu)建了 pLKO.1-shTSG101 慢病毒敲低質(zhì)粒以及穩(wěn)轉(zhuǎn)的 PK15 細(xì)胞系，通過流式細(xì)胞術(shù)、實時熒光定量 PCR（real-time PCR）、免疫印跡（Western blot）以及病毒滴度（TCID50）等方法來驗證PRV在敲低 TSG101 的 PK15 多克隆細(xì)胞系中的增殖情況。本研究為探索 TSG101 調(diào)控 PRV 增殖的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，也為抗 PRV 新藥的篩選提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒、載體及酶

PK15、HEK293T、Vero 細(xì)胞均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實驗室保存并穩(wěn)定傳代。PRV-GFP 毒株、PRV-QXX 毒株均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生理生化實驗室保存。pLKO.1、pMD2.G 以及 pSPAX2 均購自 Addgene 公司；限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ、AgeⅠ 以及T4 DNA連接酶均購自 NEB 公司。

1.1.2 主要試劑

PRV-gB 單克隆抗體、大腸桿菌 TOP10 感受態(tài)細(xì)胞均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實驗室保存；CCK-8 試劑盒、高純度質(zhì)粒小提中量提取試劑盒均購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒、ECL 發(fā)光試劑盒、嘌呤霉素、RIPA 裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京密碼子生物科技有限公司；實時熒光定量 PCR 反應(yīng)試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；β-actin 單克隆抗體購自 Sigma 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠及羊抗兔 IgG 購自 Abbkine 公司；胎牛血清、培養(yǎng)基均購自 Thermo 公司；TSG101 單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

利用 NCBI 網(wǎng)站查找豬源 TSG101 基因組序列（Gene ID：100524238）進(jìn)行 shRNA 預(yù)測，最終設(shè)計 shRNA1、shRNA2、shRNA3 序列用于TSG101基因敲低。此外，通過 NCBI 查閱豬源β-actin以及PRV gB基因的 mRNA 序列，然后利用 Primer 8.0 軟件設(shè)計 Real-time PCR 反應(yīng)引物。本研究所使用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表 1。

1.3 TSG101-shRNA 載體構(gòu)建

1.3.1 shRNA 引物退火

將公司合成的引物12 000 r·min-1離心2 min后，用 ddH2O 溶解為50 μmol·L- 以 94 ℃預(yù)變性 4 min；70 ℃ 變性10 min；69 ℃梯度退火至 20 ℃（每 30 s 降低 1 ℃）；4 ℃保存1 h的程序退火雜交。

1.3.2 載體質(zhì)粒雙酶切

使pLKO.1質(zhì)粒在EcoRⅠ-HF和AgeⅠ-HF酶的作用下于37 ℃孵育3 h完成雙酶切，并用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并膠回收。

1.3.3 載體與退火片段連接

將雙酶切反應(yīng)后的載體片段與退火產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下，16 ℃連接3 h。

1.3.4 連接片段的轉(zhuǎn)化及挑菌并進(jìn)行基因測序鑒定

將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，隨后取適量菌液涂布于含有氨芐抗性的固體LB培養(yǎng)基上，并于37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落在37 ℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)，而后進(jìn)行基因測序鑒定，將測序結(jié)果正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，并使用高純度質(zhì)粒小提中量提取試劑盒提取質(zhì)粒用于后續(xù)試驗。

1.4 TSG101基因敲低細(xì)胞系的構(gòu)建

1.4.1 慢病毒包裝

將正處于對數(shù)生長期的HEK293T 細(xì)胞接種至T25培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到40%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將pMD2.G、pSPAX2以及重組質(zhì)粒TSG101-shRNA共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，將只轉(zhuǎn)染pLKO.1質(zhì)粒的細(xì)胞作為空白對照，記為sh-control細(xì)胞，48 h后收集慢病毒液。

1.4.2 敲低細(xì)胞株篩選

將對數(shù)生長期的 PK15 細(xì)胞接種于 6 孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到 40% 左右時進(jìn)行慢病毒感染，使用 1 mL 慢病毒液混合 1 mL 10%FBS/DMEM 的培養(yǎng)基接種細(xì)胞，培養(yǎng) 48 h 后，用含有 8 μg·mL-1嘌呤霉素的 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)對照組細(xì)胞徹底死亡，將嘌呤霉素濃度更換為 3 μg·mL- 對重組敲低細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4.3 Western blot 檢測 shRNA 編輯效率

將 PK15 細(xì)胞、sh-control 細(xì)胞以及篩選出的 sh-TSG101 細(xì)胞系分別接種于 6 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到 90% 左右時收集細(xì)胞，離心后，棄去上清，加入 RIPA 裂解液，置于冰上抽檢，離心后，吸取 1 μL 上清用于 BCA 蛋白濃度測定，剩余上清加入適量 4×Loading buffer，98 ℃ 孵育 10 min，測定蛋白濃度后進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳，將條帶轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上，用 5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h，以 β-actin 蛋白作為內(nèi)參，然后以 TSG101 單克隆抗體（1∶2 000稀釋使用）作為一抗，4 ℃ 搖床過夜孵育，以 HRP 標(biāo)記的羊抗兔 IgG 為二抗（1∶5 000稀釋使用）于室溫?fù)u床孵育 1 h，洗膜，將 ECL 顯色液均勻滴加在 PVDF 膜上，使用超靈敏多功能成像儀避光檢測 TSG101 蛋白的表達(dá)。

1.4.4 實時熒光定量 PCR 檢測 shRNA 編輯效率

將 PK15 細(xì)胞、sh-control 細(xì)胞以及 sh-TSG101 細(xì)胞系分別接種于 6 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到 90% 左右時收集細(xì)胞，利用 Trizol 法提取細(xì)胞 RNA，并將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以 cDNA 為模板，以 β-actin 為內(nèi)參，使用 SYBR Green Master Mix 試劑盒進(jìn)行 Real-time PCR 反應(yīng)，檢測 TSG101 基因 mRNA 的表達(dá)水平。

1.5 CCK-8 法檢測敲低細(xì)胞系的活性及生長情況

將PK15細(xì)胞、sh-control細(xì)胞以及sh-TSG101細(xì)胞系分別接種于96孔板中，分別于0、6、12、24、36、48、60、72、84、96 h進(jìn)行CCK-8 檢測，每個時間點(diǎn)設(shè)置3個重復(fù)試驗組，檢測前每孔加入10 μL CCK-8試劑，然后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，分別檢測空白細(xì)胞組以及敲低細(xì)胞系組450 nm處的吸光度值，并繪制成細(xì)胞生長曲線。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測 TSG101 敲低細(xì)胞系對 PRV-GFP 復(fù)制的影響

將PK15細(xì)胞、sh-control細(xì)胞以及sh-TSG101細(xì)胞系分別接種于24孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%左右時，用PRV-GFP（MOI=0.01）毒株感染PK15細(xì)胞，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，用1×PBS洗兩遍，更換為含有1% FBS的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)約24～30 h后，使用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況以及每個孔的熒光強(qiáng)度，待感染PRV-GFP的PK15細(xì)胞組熒光強(qiáng)度達(dá)到60％左右時，使用CytoFLEX流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測含綠色熒光信號的細(xì)胞量。

1.7 Western blot 檢測 TSG101 敲低細(xì)胞系對 PRV-gB 蛋白的影響

將PK15細(xì)胞、sh-control細(xì)胞以及sh-TSG101細(xì)胞系分別接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)60%左右時，棄去原有培養(yǎng)基，以MOI=0.1感染PRV-QXX，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，用1×PBS洗兩遍，更換為含有1% FBS的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30 h，收集細(xì)胞，離心，棄去上清，加入RIPA裂解液置于冰上抽檢，測定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，以β-actin蛋白作為內(nèi)參，以PRV-gB單克隆抗體作為一抗，于4 ℃搖床過夜孵育，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋使用）作為二抗，于室溫?fù)u床孵育1 h后洗膜，將ECL顯色液均勻滴加在膜上，使用超靈敏多功能成像儀避光檢測PRV-gB蛋白的表達(dá)。

1.8 實時熒光定量 PCR 檢測 TSG101 敲低細(xì)胞系對 PRV-gB mRNA 表達(dá)的影響

將 PK15 細(xì)胞、sh-control 細(xì)胞以及 sh-TSG101 細(xì)胞系分別接種于 6 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá) 60% 左右時，以 MOI=0.1 感染 PRV-QXX，于 37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1 h，更換為含有 1% FBS 的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 30 h，收集細(xì)胞，用 Trizol 裂解法提取細(xì)胞 RNA 并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以 cDNA 為模板，以β-actin為內(nèi)參，使用 SYBR Green Master Mix 試劑盒進(jìn)行 Real-time PCR 反應(yīng)，檢測TSG101基因 mRNA 的表達(dá)水平。

1.9 檢測TSG101敲低細(xì)胞系對 PRV-QXX 子代病毒滴度的影響

1.9.1 病毒的擴(kuò)增與收取

將 PK15 細(xì)胞、sh-control 細(xì)胞以及 sh-TSG101 細(xì)胞系分別接種于6 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)60%左右時，分別以MOI=0.01、MOI=0.1感染PRV-QXX毒株，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，用PBS清洗后，更換為含有1% FBS的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30 h左右，觀察細(xì)胞病變狀態(tài)，待病變程度達(dá)到80%左右，用塑料封口膜將6孔板纏好，置于-20 ℃冰箱凍融3次后，4 000 r·min-1離心6 min收取上清液，置于-80 ℃保存，用于后續(xù)滴度檢測。

1.9.2 病毒滴度測定

將對數(shù)生長期的 Vero 細(xì)胞以 1×104·孔-1接種于 96 孔板中，待細(xì)胞密度至 50% 時將病毒液配制成 10-1～10-10 10 個濃度梯度，分別接種至 Vero 細(xì)胞上，于 37 ℃ 培養(yǎng)箱吸附 1 h，換為維持培養(yǎng)基，在 37℃、5% CO2 條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每隔 6 h 觀察細(xì)胞病變情況并記錄，連續(xù)觀察 5 d，通過 Reed-Muench 兩氏法計算病毒的 TCID50 值，并使用 GraphPad Prism 9 軟件繪制病毒生長曲線。

1.10 檢測TSG101敲低細(xì)胞系對 PRV 的吸附、進(jìn)入以及復(fù)制階段的影響

1.10.1 吸附階段

將 PK15 細(xì)胞、sh-control 細(xì)胞以及 sh-TSG101 細(xì)胞系用 10% FBS/DMEM 的培養(yǎng)基以 1×107·皿-1接種于 60 mm培養(yǎng)皿中，于 37 ℃、5% CO2 條件下培養(yǎng)至細(xì)胞密度為 80% 時，用 1×PBS 洗 2 遍，使用 PRV-QXX（MOI=0.01、MOI=0.1）病毒液接種細(xì)胞，同時設(shè)置感染 PRV 組和未處理組作為陽性對照和陰性對照，在 4 ℃孵育 1 h 后收集細(xì)胞，使用病毒基因組 DNA 提取試劑盒提取PRV基因組 DNA，通過 Real-time PCR 檢測 PRV 基因組 DNA 的拷貝數(shù)，測定 TSG101 基因敲低細(xì)胞系對 PRV 感染的吸附階段的影響。

1.10.2 進(jìn)入階段

將 PK15 細(xì)胞、sh-control 細(xì)胞以及 sh-TSG101 細(xì)胞系用 10% FBS/DMEM 的培養(yǎng)基以 1×107·皿-1接種于 60 mm培養(yǎng)皿中，5% CO2 條件下培養(yǎng)至細(xì)胞密度為 80% 時，用 1×PBS 洗 2 遍，使用 PRV-QXX（MOI=0.01、MOI=0.1）病毒液感染細(xì)胞，同時設(shè)置感染 PRV 組和未處理組作為陽性對照和陰性對照，在 37 ℃ 培養(yǎng)箱孵育 1 h 后收集細(xì)胞，使用病毒基因組 DNA 提取試劑盒提取 PRV 基因組 DNA，通過 Real-time PCR 檢測 PRV 基因組 DNA 的拷貝數(shù)，測定 TSG101 基因敲低細(xì)胞系對 PRV 感染進(jìn)入階段的影響。

1.10.3 復(fù)制階段

將 PK15 細(xì)胞、sh-control 細(xì)胞以及 sh-TSG101 細(xì)胞系用 10% FBS/DMEM 的培養(yǎng)基以 1×107·孔-1接種于 60 mm培養(yǎng)皿中，5% CO2 條件下培養(yǎng)至細(xì)胞密度為 70% 時，用 1×PBS 洗 2 遍，使用 PRV-QXX（MOI=0.01、MOI=0.1）病毒液感染細(xì)胞，同時設(shè)置感染 PRV 組和未處理組作為陽性對照和陰性對照，于 37℃ 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后收集細(xì)胞，使用病毒基因組 DNA 提取試劑盒提取 PRV 基因組 DNA，通過 Real-time PCR 檢測 PRV 基因組 DNA 的拷貝數(shù)，測定 TSG101 基因敲低細(xì)胞系對 PRV 感染復(fù)制階段的影響。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗均設(shè)置 3 個平行試驗組，利用 GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析并作圖，t-test 檢驗結(jié)果：NS. Pgt;0.05為差異不顯著；*. Plt;0.05 為差異顯著；**. Plt;0.01 為差異極顯著；***. Plt;0.001 為差異非常顯著。

2 結(jié) 果

2.1 載體鑒定

用 EcoRⅠ 和 AgeⅠ 酶對 pLKO.1 載體雙酶切后進(jìn)行電泳檢測，以 pLKO.1 質(zhì)粒作為對照，結(jié)果（圖1A）顯示，該載體雙酶切后有一個 7 023 bp 的條帶以及一個 27 bp 的條帶（由于該片段條帶大小太小，導(dǎo)致進(jìn)行凝膠電泳時條帶丟失，因此未能顯影出來）。測序結(jié)果（圖1B） 表明，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pLKO.1-shTSG101-1、pLKO.1-shTSG101-2、pLKO.1-shTSG101-3。

2.2 TSG101 敲低 PK15 多克隆細(xì)胞系的編輯效率檢測

分別使用Western blot以及Real-time PCR法檢測所構(gòu)建細(xì)胞系的敲減效率，Western blot結(jié)果（圖 2A）與實時熒光定量PCR結(jié)果（圖 2B）表明，設(shè)計的shRNA1、shRNA2、shRNA3均可對TSG101基因進(jìn)行有效編輯，且三株細(xì)胞系編輯效率都較高，挑選 shRNA1、shRNA2 編輯的 sh-TSG101-1 以及 sh-TSG101-2 兩株細(xì)胞系作為后續(xù)試驗所用細(xì)胞系。

2.3 TSG101基因敲低對細(xì)胞活力以及生長情況的影響

通過CCK-8檢測敲低TSG101基因?qū)K15細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果（圖3）顯示，空載體細(xì)胞以及TSG101敲低細(xì)胞活力及生長情況與PK15細(xì)胞無顯著差異。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測

PK15 細(xì)胞中 TSG101 基因敲低對 PRV-GFP"" 復(fù)制的影響。為了檢測 TSG101 基因敲低細(xì)胞系對 PRV-GFP 復(fù)制的影響，利用熒光倒置顯微鏡觀察以及流式細(xì)胞術(shù)檢測 PRV-GFP 熒光強(qiáng)度的變化，結(jié)果（圖4A、B）顯示，與對照組相比，TSG101 基因敲低細(xì)胞系的熒光強(qiáng)度顯著低于對照組，同時流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，相同時間點(diǎn)的 TSG101 基因敲低細(xì)胞系感染 PRV-GFP 的比例極顯著低于對照組細(xì)胞，表明敲低 TSG101 基因抑制了 PRV-GFP 在 PK15 細(xì)胞中的復(fù)制。

2.5 Western blot 檢測TSG101基因敲低對 PRV-gB 蛋白表達(dá)的影響

當(dāng) PRV-QXX 同時感染 PK15 細(xì)胞、空載體細(xì)胞以及TSG101敲低細(xì)胞后，Western blot 檢測相同時間點(diǎn) PRV-gB 蛋白的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，如圖5，與對照組 PK15 以及空載體細(xì)胞相比，TSG101 敲低細(xì)胞中的 PRV-gB 蛋白的表達(dá)量極顯著低于對照組。因此，在 PK15 細(xì)胞中敲低 TSG101 基因能夠抑制 PRV 的增殖。

2.6 實時熒光定量 PCR 檢測 TSG101 基因敲低對 PRV-gB 基因 mRNA 水平的影響

當(dāng) PRV-QXX 同時感染 PK15 細(xì)胞、空載體細(xì)胞以及 TSG101 敲低細(xì)胞后，利用實時熒光定量 PCR 檢測相同時間點(diǎn) PRV-gB 基因 mRNA 相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，如圖 6 所顯示，與對照組 PK15 以及空載體細(xì)胞相比，TSG101 敲低細(xì)胞中的 PRV-gB 基因 mRNA 的表達(dá)量顯著低于對照組細(xì)胞，此結(jié)果同樣也說明了敲低 TSG101 基因能夠抑制 PRV 在 PK15 細(xì)胞中的增殖。

2.7 TSG101基因敲低對PRV子代病毒滴度的影響

用PRV-QXX分別感染PK15細(xì)胞、空載體細(xì)胞以及TSG101敲低細(xì)胞系后，結(jié)果如圖7A可知，

當(dāng)MOI=0.01或0.1時，TSG101敲低細(xì)胞系的子代病毒滴度均顯著低于對照組，這表明體外敲低TSG101基因能夠顯著抑制PRV的滴度。圖7B顯示出TSG101敲低細(xì)胞的PRV病毒生長情況明顯低于對照組細(xì)胞，也同樣說明體外敲低TSG101基因能夠抑制PRV的生長。

2.8 TSG101 基因敲低對 PRV 感染的吸附、進(jìn)入、復(fù)制階段的影響

為了探究TSG101基因敲低如何抑制PRV感染，利用實時熒光定量PCR分別檢測PRV感染的不同階段中PRV基因組DNA的拷貝數(shù)，結(jié)果如圖8A～C所示，與 PK15 以及空載體細(xì)胞對照組相比，TSG101 基因敲低細(xì)胞系在PRV感染的復(fù)制階段有極顯著的抑制作用。這表明，敲低 TSG101 基因在 PRV 感染的復(fù)制階段有顯著的抑制效果。

3 討 論

PRV 是急性、高度接觸性病毒，具有導(dǎo)致神經(jīng)中樞系統(tǒng)、肺、腎和其他器官壞死的作用，且發(fā)病具有區(qū)域性、突發(fā)性和反復(fù)性等特點(diǎn)［16-17］，目前，對于該病的防治還沒有特效藥物，疫苗免疫是預(yù)防偽狂犬病的主要措施。然而，由于變異毒株的出現(xiàn)以及疫苗濫用等原因，導(dǎo)致現(xiàn)有的疫苗無法提供針對新型流行性毒株的完全保護(hù)作用［18］，使當(dāng)前 PRV 的防控受阻。因此，尋找新藥靶點(diǎn)，深入探討 PRV 與宿主蛋白的關(guān)系對于闡明 PRV 和抗 PRV 感染的致病機(jī)制以及有效的新型抗 PRV 感染藥物的研發(fā)具有重要意義。Xie等［19］研究發(fā)現(xiàn)，DDX56 蛋白通過直接與病毒蛋白或宿主蛋白相互作用，可以影響某些病毒的復(fù)制，證實 DDX56 對PRV 的增殖有抑制作用，且過表達(dá) DDX56 基因能夠更顯著地抑制PRV的增殖；Li等［20］研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá) HSP27 能夠促進(jìn) PRV 的感染，敲低 HSP27 則能夠抑制 PRV 的感染，并證實 HSP27 蛋白能通過 cGAS 的泛素化減弱 cGAS 介導(dǎo)的 IFN-β 信號通路從而促進(jìn) PRV 感染；Xu等［21］發(fā)現(xiàn)過表達(dá) HDAC6 能夠促進(jìn)PRV的復(fù)制，研究結(jié)果表明HDAC6 可能是 PRV 誘導(dǎo) atm 依賴的 DDR 從而促進(jìn) PRV 感染的關(guān)鍵。

TSG101 基因是新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因候選者，其編碼產(chǎn)物 TSG101 蛋白是 ESCRT-Ⅰ 的組成部分之一，而 ESCRT 已被許多研究證實其參與了胞質(zhì)分裂、自體吞噬以及包膜病毒的出芽等多個過程［22］。近年來，多種研究也表明，TSG101 與多種病毒的出芽過程密切相關(guān)，因此 TSG101 有望成為抗病毒感染研究的新靶點(diǎn)［23］。Zhang等［24］研究發(fā)現(xiàn) TSG101 通過與 PRRSV-N 蛋白以及早期分泌途徑的相互作用，促進(jìn) PRRSV 病毒粒子的形成，從而促進(jìn)了 PRRSV 的感染；Mannemuddhu等［25］研究發(fā)現(xiàn)靶向 TSG101 的哌唑類藥物能夠有效抑制 EBV 晚期顆粒的釋放，從而抑制 EBV 感染；Leis等［26］和Strickland等［27］發(fā)現(xiàn)靶向 TSG101 的新型哌唑類藥物能夠抑制 HSV1/2 以及 HIV 的病毒出芽過程；Kumar等［28］也證實了 ESCRT-Ⅰ 蛋白 TSG101 在卡波西肉瘤相關(guān)的皰疹病毒對內(nèi)皮細(xì)胞的胞吞后的運(yùn)輸和感染中發(fā)揮重要作用。

然而，有關(guān) TSG101 與 PRV 的相互關(guān)系還鮮有報道，因此本研究使用慢病毒包裝技術(shù)，構(gòu)建了 pLKO.1-shTSG101 重組慢病毒質(zhì)粒，以及穩(wěn)轉(zhuǎn)的TSG101 敲低 PK15 細(xì)胞系，探究 TSG101 對 PRV 感染的影響。通過流式細(xì)胞術(shù)、實時熒光定量 PCR 以及蛋白免疫印跡等方法證實了穩(wěn)轉(zhuǎn)敲低TSG101的PK15細(xì)胞系中 PRV-gB 的表達(dá)量都顯著低于對照組細(xì)胞；病毒滴度試驗證實該細(xì)胞系中子代病毒的滴度顯著低于對照組。以上結(jié)果均說明體外敲低TSG101基因?qū)τ?PRV 的復(fù)制有抑制作用，同樣也說明 TSG101 是抑制 PRV 感染的潛在藥物靶點(diǎn)。本研究為新型抗 PRV 藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)，也為 PRV 的防控提供了新思路。然而目前 TSG101 對 PRV 復(fù)制的調(diào)控機(jī)制尚未明確，仍需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了豬 TSG101-shRNA 重組質(zhì)粒并最終得到 TSG101 敲低 PK15 細(xì)胞系，通過多種手段檢測敲低 TSG101 基因?qū)?PRV 復(fù)制的影響，證明了敲低 TSG101 基因能夠在一定程度上抑制 PRV 的體外增殖。

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（編輯 白永平）