產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌內(nèi)化素G單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的建立

摘 要： 本研究旨在建立一種快速檢測產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的方法。通過 PCR 擴增產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌（LM）內(nèi)化素G（InlG）基因，構(gòu)建pET-32a-InlG重組表達(dá)載體，通過誘導(dǎo)表達(dá)獲得InlG重組蛋白，將其純化后免疫小鼠（100 μg·只-1），經(jīng)細(xì)胞融合、克隆和篩選共獲得了3株陽性雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1D2、1D2-1和2H10。經(jīng)鑒定，其分泌抗體亞型均為 IgG1。利用制備的1D2-1作為捕獲抗體，產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌兔多抗作為檢測抗體，初步建立檢測產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的雙抗體夾心ELISA方法。Western blot結(jié)果顯示3株單克隆抗體（mAb）與InlG均可發(fā)生特異性反應(yīng)。雙抗體夾心ELISA方法的特異性試驗結(jié)果顯示，與沙門菌、大腸桿菌、枯草桿菌、白色葡萄球菌和檸檬色葡萄球菌均不發(fā)生反應(yīng)。靈敏度試驗結(jié)果顯示，該方法檢測LM純培養(yǎng)物的檢測限為1.0×106 CFU·mL-1。重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，各組變異系數(shù)在5%～10%之間（lt;10%）。綜上，本研究利用抗內(nèi)化素G蛋白的mAb和兔多抗建立了雙抗體夾心ELISA方法，該方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，可用于產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌感染的快速診斷檢測。

關(guān)鍵詞： 產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌；內(nèi)化素G；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗

中圖分類號： S852.61;S854.43

文獻標(biāo)志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4069-08

Preparation of Monoclonal Antibodies against Internalin G of Listeria monocytogenes

and Their Preliminary Application

MA" Jinrui1， SHI" Wenjing1， TIAN" Changqing1， DONG" Zhijie1， ZHAO" Xuehui1， ZHI" Ji1， CAO" Qing1， WEI" Yanquan1， SONG" Weili2， XUE" Huiwen1， GOU" Huitian1*

（1.College of Veterinary Medicine Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China;

2.Animal Husbandry and Veterinary Station， Longmen Town， Lintao County， Lintao 730500，" China）

Abstract：" This study aimed to establish a rapid method for the detection of Listeria monocytogenes. Listeria monocytogenes （LM） internalin G （InlG） gene was amplified by PCR， pET-32a-InlG recombinant expression vector was constructed， and recombinant protein of InlG was obtained by induced expression， which was purified and immunized to mice （100 μg per mouse）. Three positive hybridoma cell lines were obtained by cell fusion， cloning， and screening， and were designated as 1D2， 1D2-1 and 2H10. The subtypes of the antibodies were identified as IgG1. Using the prepared 1D2-1 as the capture antibody and the Listeria monocytogenes rabbit-derived polyclonal antibody as the detection antibody， a preliminary double-antibody sandwich ELISA method for detecting Listeria monocytogenes was established. WESTERN BLOT results showed that all three monoclonal antibodies （mAb） reacted specifically with InlG. The results of the specificity test of the method showed that there was not reaction to Salmonella， Escherichia coli， Bacillus subtilis， Staphylococcus albicans and Staphylococcus citreus. The results of the sensitivity test showed that the limit of the method for the detection of LM pure cultures was 1.0×106 CFU·mL-1. The results of the reproducibility test showed that the coefficients of variation for each group ranged from 5%-10% （lt;10%）. In conclusion， this study established a double antibody sandwich ELISA method using anti-internalin G protein mAb and rabbit polyclonal antibody. The method showed good specificity， sensitivity and repeatability， and can be used for rapid diagnosis and detection of Listeria monocytogenes infection.

Key words： Listeria monocytogenes; internalin G; monoclonal antibody; enzyme-linked immunosorbent assay

*Corresponding author：" GOU Huitian， E-mail： gouht@gsau.edu.cn

產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌（Listeria monocytogenes，LM）也稱單核細(xì)胞增生李斯特菌，是一種機會性和高度侵襲性的食源性病原體，導(dǎo)致人畜李斯特菌?。╨isteriosis），表現(xiàn)為共濟失調(diào)、厭食、嗜睡、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等［1］。LM感染的各種臨床表現(xiàn)反映了其可在宿主中跨越三大屏障的能力［2］。

目前，用于LM檢測的傳統(tǒng)方法包括預(yù)富集、選擇性富集和分離培養(yǎng)等，檢測準(zhǔn)確度高，但步驟繁瑣，耗時長［3］。為解決這些問題，又開發(fā)了基于細(xì)菌核酸檢測的方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和DNA雜交等，雖然這些分子生物學(xué)方法靈敏度高，但價格昂貴，需要專業(yè)的技術(shù)知識和設(shè)備［4-5］。因此，以酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）為代表的免疫學(xué)檢測方法能較好地彌補傳統(tǒng)檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法的不足［6-7］，是檢測LM的潛在方法。根據(jù)反應(yīng)途徑的不同，可將ELISA分為直接競爭法、雙抗體夾心法和間接競爭法，其中雙抗體夾心法具有適用范圍廣、抗體用量少、特異性強、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡單等優(yōu)勢，常用于某些細(xì)菌、病毒和食品過敏原的批量檢測［8］。已有諸多LM的抗原被用于單克隆抗體和多克隆抗體的制備［9］，開發(fā)免疫學(xué)檢測方法。但LM抗原表達(dá)容易受到增菌肉湯［10-11］或生長條件中酸、鹽和溫度的影響［12］，劉圓園等［13］研究證明內(nèi)化素G（internalin G，InlG）具有較好的反應(yīng)原性和免疫原性，是免疫學(xué)診斷的重要靶點，因而InlG可以作為良好的抗原用于制備InlG單克隆抗體，進而進行后續(xù)雙抗體夾心ELISA方法的建立。

因此，本研究利用自制的LM內(nèi)化素G單克隆抗體作為捕獲抗體，以多抗作為檢測抗體，山羊抗兔HRP-IgG作為二抗識別檢測抗體，建立雙抗體夾心ELISA，進行初步應(yīng)用，以期為產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的監(jiān)測與預(yù)防提供一種快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料與實驗動物

骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0），pET-32a載體，產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌ATCC19111、伊氏李斯特菌、韋氏李斯特菌和無害李斯特菌由本實驗室保存；白色葡萄球菌、檸檬色葡萄球菌、枯草桿菌、沙門菌和大腸桿菌由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物實驗室惠贈。

6～8周齡SPF級BALB/c小鼠，3月齡新西蘭大白兔購于中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心。本研究所涉及的動物實驗符合甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物倫理委員會章程，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：GSAU-Eth-VMC-2023-039）。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購自賽默飛世爾科技公司；細(xì)胞融合劑PEG購自生工生物工程（上海）公司；50×HAT 添加劑、100×HT 添加劑，購自源培生物科技有限公司；單抗分型試劑盒購自北京博蕾德生物科技有限公司；單抗亞型鑒定試劑盒購自美國Southern Biotech公司；NP40裂解液、超敏 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；羊抗兔IgG-HRP、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma 公司；TMB單組分底物顯色液購自天根生化科技公司；兔抗LM多抗為自制。

1.3 InlG的特異性鑒定

本實驗室在前期工作中，參考GenBank中的InlG基因序列，設(shè)計特異性引物，成功擴增出1 473 bp的InlG 基因，表明 InlG 蛋白僅可與 LM 陽性血清反應(yīng)［14］。

1.4 抗體的制備

1.4.1 mAb的制備

使用實驗室構(gòu)建的pET-32a-InlG重組蛋白，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)純化后與弗氏佐劑（首次免疫用弗氏完全佐劑，加強免疫用弗氏不完全佐劑）混合乳化作為免疫抗原，免疫5只6～8周齡，健康且未生育的雌性BALB/c小鼠，背部多點皮下注射，首免100 μg·只-1，之后每隔2周50 μg·只-1加強免疫，每次免疫前1 d從尾靜脈采血分離抗血清，檢測效價，當(dāng)效價達(dá)到 1∶10 000 以上時，取免疫鼠的脾臟，分離脾細(xì)胞，與 SP2/0 細(xì)胞融合。以表達(dá)的InlG重組蛋白為檢測抗原，采用間接 ELISA 方法對融合的雜交瘤細(xì)胞進行篩選，有限稀釋法對陽性細(xì)胞株克隆 3 次。采用小鼠體內(nèi)誘生法制備單抗腹水，用無菌穿刺針在超凈臺收集淡黃色腹水，經(jīng)8 000 r·min-1離心10 min，留下淡黃色澄清液體，棄去沉淀和脂肪層。

1.4.2 兔抗LM多抗的制備

將LM（ATCC19111）滅活后與弗氏佐劑（首次免疫用弗氏完全佐劑，加強免疫用弗氏不完全佐劑）等比例混合乳化作為免疫抗原，免疫兩只3月齡雌性新西蘭大白兔，背部多點皮下注射，免疫劑量為1 mg·只-1，免疫5次。第3次免疫后耳緣靜脈采血并分離血清，檢測效價，第五次免疫后，動脈取全血，2 000 r·min-1離心10 min收集抗血清［15］。

1.5 mAb 的純化

采用Protein A/G柱親和純化，檢測抗體濃度，用單抗亞型鑒定試劑盒檢測各個上清的亞型。以LM全菌進行SDS-PAGE電泳，mAb作為一抗，羊抗兔IgG-HRP作為二抗進行蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）檢測單抗反應(yīng)性。

1.6 雙抗體夾心 ELISA 方法的建立

1.6.1 ELISA 最佳反應(yīng)條件的確定

從獲得的 mAb 中選擇一株效價較高的mAb用于后續(xù)試驗。以抗InlG的mAb為捕獲抗體，制備的兔抗LM多抗為檢測抗體，建立雙抗體夾心 ELISA 方法。利用間接ELISA確定mAb稀釋度（1∶200～1∶25 600）、兔抗LM多抗稀釋度（1∶200～1∶25 600）、包被條件（37℃ 1 h、37℃ 1 h+4℃12h、4℃ 12 h）、封閉液成分（1% BSA、2% BSA、5%脫脂乳和PBST）、細(xì)菌抗原孵育時間（37℃ 60 min、37℃ 90 min、37℃ 120 min、37℃ 150 min）、檢測抗體孵育時間（37℃ 30 min、37℃ 60 min、37℃ 90 min、37℃ 120 min）進行優(yōu)化，以確定最佳反應(yīng)條件。

1.6.2 特異性試驗

按照所建立的雙抗體夾心ELISA方法，將產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌、伊氏李斯特菌、韋氏李斯特菌、無害李斯特菌、沙門菌、大腸桿菌、枯草桿菌、白色葡萄球菌和檸檬色葡萄球菌作為檢測抗原對本方法的特異性進行檢測。

1.6.3 靈敏度試驗

取1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100 CFU·mL-1的LM菌液作為待測抗原，PBS作為陰性對照進行試驗，確定雙抗夾心ELISA的靈敏度。

1.6.4 重復(fù)性試驗

以上述建立的雙抗體夾心ELISA方法對14份陽性樣本和2份陰性樣本進行檢測，每個樣本做6次重復(fù)［16］。計算各組平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。變異系數(shù)反映了數(shù)據(jù)相對于其均值的離散程度，即在本研究中反映的是各樣本的OD450 nm值與其均值之間的偏差或波動的大小，其值越小，說明建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法重復(fù)性越好，計算公式為：變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值×100%。

1.7 人工增菌樣本的檢測

LM容易污染奶制品和肉制品，因此選擇生牛乳和生牛肉作為待測樣品。取25 mL生牛乳和25 g生牛肉（置于研缽中加入25 mL PBS研磨后取25 mL），分別加入225 mL BHI肉湯培養(yǎng)基進行高壓滅菌，分別制備7份生牛乳和生牛肉待測樣品。無菌操作向制備的樣品中分別加入濃度為1.0×100、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106 CFU·mL-1的 LM，置于30 ℃搖床，200 r·min-1培養(yǎng)［17］，10、15、18、21、24 h后分別取1 mL增菌培養(yǎng)物，8 000 r·min-1離心10 min，棄去上清，沉淀用1 mL PBS重懸，煮沸10 min，進行雙抗夾心ELISA檢測。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白的表達(dá)及純化

將重組菌擴大培養(yǎng)后誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blot鑒定，目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量為70 ku，在表達(dá)過程中無降解。

2.2 血清效價檢測

2.2.1 小鼠血清效價檢測結(jié)果

純化的InlG蛋白與弗氏佐劑混合乳化后免疫小鼠，間接ELISA測"" 定血清效價，結(jié)果顯示5只小鼠均產(chǎn)生了針對免疫蛋白的抗體，可以提供良好的脾細(xì)胞源，1號小鼠相較于其他小鼠血清效價最高，達(dá)到1∶128 000，所以選擇1號進行細(xì)胞融合。

2.2.2 兔血清效價檢測結(jié)果

將LM與弗氏佐劑混合乳化后免疫兔，間接ELISA測定血清效價，結(jié)果顯示2只兔均產(chǎn)生了抗LM的抗體，2號兔相較于1號兔血清效價最高，達(dá)到1∶640 000。

2.3 雜交瘤細(xì)胞的亞克隆

將1號小鼠脾細(xì)胞與 SP2/0 細(xì)胞融合后，采用間接 ELISA 方法對融合的雜交瘤細(xì)胞進行篩選，經(jīng)過兩輪亞克隆及復(fù)檢，成功篩選出三株單克隆細(xì)胞株：1D2、1D2-1、2H10（其OD值分別為2.505 6、2.447 6和1.598 9）。

2.4 單克隆抗體的亞型及濃度

利用單抗亞型鑒定試劑盒對篩選出的3株單克隆抗體進行亞型鑒定，結(jié)果顯示：1D2、1D2-1、2H10均為IgG1型，濃度分別為5、5.5、0.5 mg·mL-1。

2.5 單克隆抗體的鑒定

2.5.1 特異性鑒定ELISA結(jié)果

間接ELISA檢測結(jié)果顯示3株單克隆抗體與產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌反應(yīng)結(jié)果為陽性，與沙門菌、大腸桿菌、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌反應(yīng)結(jié)果均為陰性，無特異性交叉反應(yīng)，表明該方法有良好的特異性。

2.5.2 單克隆抗體反應(yīng)性檢測

1D2、1D2-1和2H10單克隆抗體與InlG蛋白反應(yīng)性分析如圖2所示。制備的InlG單克隆抗體在約70 ku處出現(xiàn)特異性條帶，表明本試驗制備的mAb可以特異性識別大小約為70 ku的內(nèi)化素G蛋白，具有較好的反應(yīng)原性。

2.6 捕獲抗體的確定

將純化后的單克隆抗體稀釋包被酶標(biāo)板，在37 ℃、1 h 捕獲產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌。結(jié)果顯示，1D2、1D2-1和2H10呈現(xiàn)出不同水平的細(xì)菌抗原捕獲能力（圖3），1D2-1相對較強，結(jié)合前期單克隆抗體鑒定結(jié)果，最終選擇1D2-1作為捕獲抗體進行后續(xù)試驗。

2.7 夾心ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

當(dāng)單克隆抗體1D2-1作為包被抗體稀釋至1∶3 200，兔抗LM多抗作為檢測抗體稀釋至1∶1 600時，相應(yīng)的OD450 nm值最高。分別將捕獲抗體用最佳稀釋度包被酶標(biāo)板，當(dāng)包被條件為4 ℃包被12 h時，細(xì)菌樣品的孵育時間為2 h時，檢測抗體的最佳孵育時間為1 h時，用5%脫脂乳作為封閉液時，其相應(yīng)的P/N值最高。因此，選擇上述條件建立ELISA方法。

2.8 雙抗夾心ELISA檢測方法的特異性評價

2.8.1 特異性試驗結(jié)果

按照所建立的方法，將產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌、伊氏李斯特菌、韋氏李斯特菌、無害李斯特菌、沙門菌、大腸桿菌、枯草桿菌、白色葡萄球菌和檸檬色葡萄球菌作為待檢測抗原對本方法的特異性進行檢測，同時設(shè)置陰性對照，試驗結(jié)果表明李斯特菌屬均可以檢測到，但與其他細(xì)菌無交叉反應(yīng)（表1）。表中“＋”表示P/Ngt;2.1，呈陽性；“-”表示P/Nlt;2，呈陰性。

2.8.2 靈敏度試驗結(jié)果

用LM的BHI培養(yǎng)物檢測該方法的靈敏度，P/N值＞2.1，判定為陽性。結(jié)果顯示當(dāng)接菌濃度為1.0×106 CFU·mL-1時，P/N值為2.528，表明該方法檢測LM純培養(yǎng)物的檢測限為1.0×106 CFU·mL-1。

2.8.3 重復(fù)性試驗結(jié)果

用上述建立的雙抗體夾心ELISA方法對14份陽性樣品和2份陰性樣品進行檢測，測定其OD450 nm值，將6次重復(fù)結(jié)果進行分析，結(jié)果顯示各組變異系數(shù)均在5%～10%之間（lt;10%），表明建立的 ELISA 方法重復(fù)性較好。

2.9 人工增菌樣本的檢測

按照“1.7”制備的生牛乳增菌液和生牛肉增菌液，進行雙抗體夾心ELISA方法檢測，結(jié)果顯示（表2），雙抗夾心ELISA檢測方法對于生牛乳和生牛肉樣品的檢出限分別如下：經(jīng)過增菌12 h可檢測樣品中LM的濃度為1.0×106（生牛乳）和1.0×105（生牛肉）CFU·mL-1；經(jīng)過增菌15 h可檢測樣品中LM的濃度為1.0×105（生牛乳）和1.0×104（生牛肉）CFU·mL-1；經(jīng)過增菌18 h可檢測樣品中LM的濃度均為1.0×104 CFU·mL-1；經(jīng)過增菌21和24 h可檢測樣品中LM的濃度為1.0×102 CFU·mL-1。

3 討 論

作為一種胞內(nèi)寄生菌，LM在感染宿主的過程中，內(nèi)化素蛋白家族成員起到重要作用［18］。目前已知的內(nèi)化素有25種，其中InlA與 InlB是最早鑒定出與宿主細(xì)胞特異性受體結(jié)合介導(dǎo)LM進入非吞噬細(xì)胞的毒力因子［19-20］。根據(jù)內(nèi)化素蛋白的C末端一級結(jié)構(gòu)的不同可將其分為3類：含LPXTG結(jié)構(gòu)的內(nèi)化素、含GW或WxL結(jié)構(gòu)的內(nèi)化素和分泌型內(nèi)化素［21］。InlG是由Lmo0262基因編碼的細(xì)胞表面蛋白，屬于含LPXTG結(jié)構(gòu)的內(nèi)化素，緊緊錨定在細(xì)菌細(xì)胞壁上［22］。研究發(fā)現(xiàn)InlG主要存在于分離自環(huán)境的LM分離株中，很少存在于人和動物臨床分離的樣本菌株中，表明InlG與LM在外部環(huán)境中的存活密切相關(guān)，而李斯特菌病感染通常與熟肉、熱狗、餡餅、熏魚、未經(jīng)巴氏消毒的牛奶制成的奶酪、冰淇淋、涼拌卷心菜等即食食品，以及冷凍蔬菜等產(chǎn)品有關(guān)［23］。因此，以InlG為靶基因建立的檢測方法，不但可用于食品中LM污染的檢測，還可初步對污染源進行溯源分析。

在雙抗體夾心ELISA方法中，檢測限、靈敏度、準(zhǔn)確性以及特異性等參數(shù)至關(guān)重要［24］。鐘子清等［25］以LM多克隆抗體偶聯(lián)羧基化磁珠，建立LM免疫磁珠富集方法，結(jié)果表明該方法特異性較低，與變形桿菌和金黃色葡萄球菌存在交叉反應(yīng)。段霞等［26］以福爾馬林滅活的LM 54007制備的多克隆抗體建立的雙抗體夾心ELISA方法，與綿羊李斯特菌、金黃色葡萄球菌26003和阪崎腸桿菌45401有輕微的交叉反應(yīng)，表明此方法特異性較低。張海洋等［27］基于制備的抗LM的單克隆抗體和多克隆抗體，成功建立了檢測LM的雙抗體夾心ELISA方法，具有良好的靈敏性和特異性，檢測限為1×105 CFU·mL-1。本團隊前有研究證明了內(nèi)化素G有良好的反應(yīng)原性和免疫原性［13］；以及驗證了InlG與LM的毒力有關(guān)［22］。所以，本研究制備了LM內(nèi)化素G單克隆抗體，并將其作為捕獲抗體建立了雙抗體夾心ELISA方法，用于檢測LM，雖然檢測限略高于其他學(xué)者建立的雙抗體夾心ELISA方法，但因為InlG是LM自身的毒力因子，有良好的反應(yīng)原性和免疫原性，所以在特異性和準(zhǔn)確性等方面要明顯優(yōu)于其他檢測方法，且傳統(tǒng)方法檢測LM整個過程需要72 h以上［28］，本研究所建立的方法在21 h左右就可檢出LM，相較于傳統(tǒng)檢測方法節(jié)省50 h左右，可達(dá)到快速檢測LM的目的。

綜上，本研究成功制備了內(nèi)化素G單克隆抗體，作為捕獲抗體檢測李斯特菌，不僅可以檢測產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌，還可以檢測李斯特菌屬的其他菌株，擴大了檢測范圍。使用本研究建立的雙抗體夾心ELISA方法來檢測LM，該方法的檢測限是1.0×106 CFU·mL-1，用此方法檢測4株不同的李斯特菌、5株非李斯特菌，結(jié)果表明該檢測方法對李斯特菌屬具有較好的特異性。選擇生牛乳和生牛肉接種不同濃度的LM，當(dāng)二者的接種量為1.0×102 CFU·mL-1時，經(jīng)21 h培養(yǎng)后本方法均可檢出。

4 結(jié) 論

本研究以自制的LM內(nèi)化素G單克隆抗體作為捕獲抗體成功建立了檢測LM的雙抗體夾心ELISA方法，該方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，為LM的檢測提供一種快速檢測方法。

參考文獻（References）：

［1］ OTTER A， HOULIHAN M G， DANIEL R G， et al. Ovine gastrointestinal listeriosis［J］. Vet Rec， 2004， 154（15）：479.

［2］ RADOSHEVICH L， COSSART P. Listeria monocytogenes：towards a complete picture of its physiology and pathogenesis［J］. Nat Rev Microbiol， 2018， 16（1）：32-46.

［3］ MALIC L， ZHANG X， BRASSARD D， et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes［J］. Lab Chip， 2015， 15（20）：3994-4007.

［4］ WANG Y， SALAZAR J K. Culture-independent rapid detection methods for bacterial pathogens and toxins in food matrices［J］. Compr Rev Food Sci Food Saf， 2016， 15（1）：183-205.

［5］ 王華健， 張 寧， 楊 威， 等， 李杰峰. 3種食源性致病菌TaqMan多重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報， 2022， 53（4）： 1201-1209.

WANG H J， ZHANG N， YANG W， et al. Establishment of a multiplex TaqMan fluorescence quantitative PCR method for detection of three foodborne pathogens［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2022， 53（4）： 1201-1209. （in Chinese）

［6］ LV X， HUANG Y M， LIU D F， et al. Multicolor and ultrasensitive enzyme-linked immunosorbent assay based on the fluorescence hybrid chain reaction for simultaneous detection of pathogens［J］. J Agric Food Chem， 2019， 67（33）：9390-9398.

［7］ XU L P， BAI X J， BHUNIA A K. Current state of development of biosensors and their application in foodborne pathogen detection［J］. J Food Prot， 2021， 84（7）：1213-1227.

［8］ 郝俊芳， 黃 凱， 崔艷艷， 等. 豬圓環(huán)病毒2型親和肽雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立及驗證［J］. 中國獸醫(yī)科學(xué)， 2023， 53（11）：1371-1376.

HAO J F， HUANG K， CUI Y Y， et al. Establishment and validation of a double-antibody sandwich ELISA method for the detection of porcine circovirus type 2 affinity peptide［J］. Chinese Veterinary Science， 2023， 53（11）：1371-1376. （in Chinese）

［9］ LATHROP A A， BAILEY T W， KIM K P， et al. Pathogen-specific antigen target for production of antibodies produced by comparative genomics［J］. Ant Technol J， 2014， 4：13-22.

［10］ LATHROP A A， BANADA P P， BHUNIA A K. Differential expression of InlB and ActA in Listeria monocytogenes in selective and nonselective enrichment broths［J］. J Appl Microbiol， 2008， 104（3）：627-639.

［11］ NANNAPANENI R， STORY R， BHUNIA A K， et al. Unstable expression and thermal instability of a species-specific cell surface epitope associated with a 66-kilodalton antigen recognized by monoclonal antibody EM-7G1 within serotypes of Listeria monocytogenes grown in nonselective and selective broths［J］. Appl Environ Microbiol， 1998， 64（8）：3070-3074.

［12］ GENG T， KIM K P， GOMEZ R， et al. Expression of cellular antigens of Listeria monocytogenes that react with monoclonal antibodies C11E9 and EM-7G1 under acid-， salt-or temperature-induced stress environments［J］. J Appl Microbiol， 2003， 95（4）：762-772.

［13］ 劉圓園， 曹啟航， 孫亞楠， 等. 單增李斯特菌內(nèi)化素基因inlG基因原核表達(dá)及小鼠免疫保護性分析［J］. 畜牧與獸醫(yī)， 2021， 53（9）：61-65.

LIU Y Y， CAO Q H， SUN Y N， et al. Prokaryotic expression of the internalin gene inlG of Listeria monocytogenes and its immunoprotection in mice［J］. Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine， 2021， 53（9）：61-65. （in Chinese）

［14］ 劉圓園. 單核細(xì)胞增生李斯特菌內(nèi)化素G的功能初探［D］. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2021.

LIU Y Y. Preliminary study on the function of internalin G in Listeria monocytogenes［D］. Lanzhou： Gansu Agricultural University， 2021. （in Chinese）

［15］ 趙 萌. 單增李斯特菌免疫檢測方法的建立［D］. 天津：天津科技大學(xué)， 2018.

ZHAO M. Development of an immunossay for Listeria monocytogenes［D］. Tianjin： Tianjin University of Science and Technology， 2018. （in Chinese）

［16］ 溫 穎. 豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體制備、鑒定及sIgA抗體ELISA檢測方法建立［D］. 咸陽：西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2022.

WEN Y. Preparation and characterization of monoclonal antibodies against porcine epidemic diarrhea virus， and establishment of ELISA for sIgA antibody detection［D］. Xianyang： Northwest Aamp;F University， 2022. （in Chinese）

［17］ 韓方方. 豬δ冠狀病毒雙抗體夾心ELISA抗原檢測試劑盒的制備與初步應(yīng)用［D］. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2022.

HAN F F. Development and preliminary application of Double antibody sandwich ELISA kit for detection of porcine delitacoronavirus［D］. Zhengzhou： Henan Agricultural University， 2021. （in Chinese）

［18］ 劉半紅， 胡梁斌， 陸 睿， 等. 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌內(nèi)化素InlJ對噬菌體敏感性及生物被膜形成的影響［J］. 食品科學(xué)， 2023， 44（16）：198-204.

LIU B H， HU L B， LU R， et al. Effect of internalin InlJ of Listeria monocytogenes on phage sensitivity and biofilm formation［J］. Food Science， 2023， 44（16）：198-204. （in Chinese）

［19］ ORSI R H， DEN BAKKER H C， Wiedmann M. Listeria monocytogenes lineages： Genomics， evolution， ecology， and phenotypic characteristics［J］. Int J Med Microbiol， 2011， 301（2）：79-96.

［20］ GRNDLER T， QUEDNAU N， STUMP C， et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier［J］. Microbes Infect， 2013， 15（4）：291-301.

［21］ 藍(lán) 瑩， 陳綿綿， 程昌勇， 等. 單增李斯特菌內(nèi)化素家族蛋白的研究進展［J］. 中國獸醫(yī)學(xué)報， 2021， 41（6）：1219-1228.

LAN Y， CHEN M M， CHENG C Y， et al. Research progress on internalins of Listeria monocytogenes［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2021， 41（6）：1219-1228. （in Chinese）

［22］ 史文靜， 劉圓園， 王子堅， 等. 內(nèi)化素G在單增李斯特菌入侵巨噬細(xì)胞中的作用研究［J］. 動物醫(yī)學(xué)進展， 2023， 44（10）：56-62.

SHI W J， LIU Y Y， WANG Z J， et al. Study on effect of internalin G in Listeria monocytogenes invasion into macrophages［J］. Progress in Veterinary Medicine， 2023， 44（10）：56-62. （in Chinese）

［23］ BALANDYT "L， BRODARD I， FREY J， et al. Ruminant rhombencephalitis-associated Listeria monocytogenes alleles linked to a multilocus variable-number tandem-repeat analysis complex［J］. Appl Environ Microbiol， 2011， 77（23）：8325-8335.

［24］ SWAMINATHAN B， GERNER-SMIDT P. The epidemiology of human listeriosis［J］. Microbes Infect， 2007， 9（10）：1236-1243.

［25］ 鐘子清， 熊勇華， 賴衛(wèi)華， 等. 納米免疫磁珠富集單核增生李斯特菌［J］. 食品科學(xué)， 2013， 34（23）：212-215.

ZHONG Z Q， XIONG Y H， LAI W H， et al. Nanoparticle-based immunom agnetic separation of Listeria monocytogenes［J］. Food Science， 2013， 34（23）：212-215. （in Chinese）

［26］ 段 霞， 黃 欣， 黃嶺芳， 等. 雙抗夾心ELISA方法檢測食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌［J］. 食品科學(xué)， 2010， 31（24）：272-276.

DUAN X， HUANG X， HUANG L F， et al. Detection of Listeria monocytogenes in food by sandwich ELISA［J］. Food Science， 2010， 31（24）：272-276. （in Chinese）

［27］ 張海洋， 劉 爽， 戚雪芹， 等. 單核細(xì)胞增生李斯特菌的單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的建立［J］. 中國獸醫(yī)科學(xué)， 2021， 51（8）：962-969.

ZHANG H Y， LIU S， QI X Q， et al. Preparation of monoclonal antibodies against Listeria monocytogenes and establishment of a double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detection of L. monocytogenes［J］. Chinese Veterinary Science， 2021， 51（8）：962-969. （in Chinese）

［28］ 趙夢迪， 張 琴， 徐 堯， 等. 單核細(xì)胞增生李斯特菌快速檢測技術(shù)的建立及應(yīng)用［J］. 揚州大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版， 2023， 44（3）：59-64.

ZHAO M D， ZHANG Q， XU Y， et al. Establishment and application of a rapid detection technology for Listeria monocytogenes［J］. Journal of Yangzhou University： Agricultural and Life Science Edition， 2023， 44（3）：59-64. （in Chinese）

（編輯 白永平）