一株廣譜沙門菌噬菌體的分離鑒定及其生物學(xué)特性

摘 要： 噬菌體能夠特異性裂解靶向細(xì)菌，被認(rèn)為是抗生素有效替代者。為了篩選到有效裂解沙門菌的噬菌體，為探索新的沙門菌防控方法提供理論依據(jù)和參考。本研究用絲裂霉素C誘導(dǎo)并分離純化沙門菌噬菌體，通過噬菌斑與電子顯微鏡觀察、宿主譜測定、生物學(xué)特性測定以及對該噬菌體的全基因組進(jìn)行測序分析評估該噬菌體。結(jié)果顯示：成功誘導(dǎo)出1株廣譜的長尾沙門菌噬菌體，命名為SP18-108，該噬菌體能夠裂解至少14種不同血清型沙門菌；在30～40 ℃及pH 4～12條件下活性穩(wěn)定；全基因組分析結(jié)果顯示，該噬菌體全長為43 250 bp，GC%含量為49.96%，已知功能編碼序列（coding sequences， CDS）占比為52%。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析表明，該噬菌體屬于長尾病毒科（Siphoviridae）。本研究誘導(dǎo)過程中分離出1株不具有溶源基因的廣譜沙門菌噬菌體，為進(jìn)一步研究沙門菌抗菌劑提供了良好的材料。

關(guān)鍵詞： 沙門菌；噬菌體；生物學(xué)特性；全基因組分析

中圖分類號：Q939.48

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4061-08

Isolation， Identification and Characterization of a Broad Spectrum Salmonella Phage

LIU" Wei， MA" Jiayi， GENG" Haoyu， XIE" Tian， MIAO" Sunan， LIAO Zongjie， GENG" Shizhong*

（Jiangsu Key Laboratory of Zoonoses， Yangzhou University， Yangzhou 225009，" China）

Abstract：" Bacteriophages can specifically lyse target bacteria and are usually considered as effective alternatives to antibiotics. In order to screen for bacteriophages that are efficient to lyse Salmonella， and provide experimental data and reference for exploring the prevention and control method of Salmonella. In this study， Salmonella phage was induced and purified by mitomycin C. Phage was evaluated by plaque and electron microscopy observation， host spectrum determination， biological characterization and whole genome sequencing analysis. A broad-spectrum Salmonella long-tail phage was successfully induced， named SP18-108， which could lyse at least 14 different serotypes of Salmonella. The activity is stable at 30-40℃ and pH 4-12.The whole genome analysis showed that the length of the phage was 43 250 bp， and the GC content was 49.96%， the proportion of known coding sequences （CDS） was 52%. Phylogenetic tree analysis showed that phage SP18-108 belonged to the （Siphoviridae）. In summary， in this study， we isolated a broad-spectrum Salmonella bacteriophage without lysogenic genes， which providing a good material for further research on Salmonella antibacterial agents.

Key words： Salmonella; phage; biological characteristics; whole genome analysis

*Corresponding author：" GENG Shizhong， E-mail： gszzsg115@163.com

沙門菌屬于革蘭陰性菌，是一種常見的人畜共患病病原體［1］。迄今為止，已經(jīng)辨認(rèn)出超過2 700個(gè)沙門菌的血清型別，此細(xì)菌能感染包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物，全球各地均有其蹤跡，有些沙門菌甚至在某些昆蟲與植被中檢測到其存在。人感染沙門菌的首要途徑是經(jīng)由食用受到污染的食物，如肉類、蛋類和奶制品等?？股氐钠毡槭褂脤?dǎo)致了抗藥性問題的日益嚴(yán)峻，這對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人們的健康造成了重大威脅［2-4］。

噬菌體是目前地球上發(fā)現(xiàn)的最豐富的微生物，廣泛存在于各種環(huán)境中與抗生素相比，噬菌體分布廣泛，易于獲得，對宿主細(xì)菌具有高度的特異性并可以有效裂解靶細(xì)菌，具有較好的安全性，是細(xì)菌的天然殺手。因此，噬菌體己被提議作為抗生素的替代策略之—，用于食品安全和公共衛(wèi)生［4-7］。

本研究通過細(xì)菌誘導(dǎo)獲得多個(gè)沙門菌噬菌體，通過測序發(fā)現(xiàn)一株不具有溶源基因的噬菌體，并且對噬菌體進(jìn)行生物特性分析，考察其溶菌范圍與消毒能力，旨在為開發(fā)噬菌體抗菌藥物奠定科學(xué)基礎(chǔ)和提供生物性原料，并為阻止沙門菌的傳播提出創(chuàng)新策略及對策［8］。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)室臨床分離并保存，共246株沙門菌。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

美國Amresco公司生產(chǎn)的細(xì)胞分裂誘導(dǎo)藥物絲裂霉素C；美國Millipore公司制造的0.22 μm過濾器；以及美國Thermo Scientific公司出品的37 ℃微生物孵育設(shè)備。

1.3 噬菌體的誘導(dǎo)與純化

1.3.1 噬菌體的誘導(dǎo)采用絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）誘導(dǎo)的方法［9］。以1 mL LB液態(tài)培養(yǎng)基為載體，加入沙門菌，在37℃，180 r·min-1的震蕩器中震蕩，直到細(xì)菌生長至對數(shù)期，且以600 nm波長測定光密度值達(dá)到0.5～0.7。向每個(gè)菌液樣本中加入MMC，確保其最終濃度穩(wěn)定在1 μg·mL-1。經(jīng)由37℃恒溫培養(yǎng)箱暗處培養(yǎng)3 h，隨后利用0.22 μm濾膜進(jìn)行誘導(dǎo)液的過濾處理，對過濾后的液體進(jìn)行編號標(biāo)記，并存放于4℃的低溫冷藏中保存。

1.3.2 噬菌體的鑒定

采用經(jīng)過高溫殺菌處理的棉簽各蘸取51個(gè)沙門菌株的培養(yǎng)液，并在LB瓊脂培養(yǎng)基上逐一涂抹3次，以達(dá)到均勻分布的效果。采用“1.3.1”節(jié)描述的噬菌體激活溶液2 μL，平均滴加于涂布有沙門菌的培養(yǎng)基上。在采集過濾液樣本時(shí)，各取樣點(diǎn)應(yīng)相隔較遠(yuǎn)距離，避免菌斑之間互相侵蝕，從而確保評估結(jié)果的準(zhǔn)確性。在固態(tài)培養(yǎng)介質(zhì)干透之后，將倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育8 h，隨后檢查有無清楚可見的細(xì)菌裂解斑點(diǎn)［10］。

1.3.3 噬菌體的純化半固體培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，先保溫于50℃ 水浴中。隨后挑選出能形成透明清晰噬菌斑的噬菌體溶液，并將此液體以SM緩沖液作為稀釋劑，按10倍遞減法進(jìn)行稀釋，具體挑取了稀釋倍數(shù)為10-4、10-5、10-6的溶液。將這些稀釋后的噬菌體與生長至對數(shù)增長階段的宿主細(xì)菌進(jìn)行等體積（各200 μL）混合，隨后在37℃環(huán)境下孵化10 min。從這一混合液中取出300 μL，加入到預(yù)先加熱至50 ℃的5 μL半固態(tài)培養(yǎng)基中，借此制備雙層瓊脂的半固體平板。將這些平板在37 ℃的條件下繼續(xù)培養(yǎng)8 h，待觀察到分散的單個(gè)噬菌斑后，選取直徑比較大（2 mL以內(nèi)）、且呈現(xiàn)透明狀的噬菌斑，使用接種環(huán)進(jìn)行挑選并再一次進(jìn)行純化處理。經(jīng)過三輪純凈化作業(yè)，直到噬菌斑的尺寸與外觀均勻一致。

1.3.4 噬菌體的滴度

經(jīng)過連續(xù)10倍濃度梯度稀釋的噬菌體溶液，采用雙層瓊脂板技術(shù)來評估不同稀釋濃度的活性。在37 ℃下孵育8 h之后，對噬菌斑進(jìn)行的計(jì)數(shù)。噬菌體滴度I/（PFU·mL-1）=噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.3.5 噬菌體的形態(tài)學(xué)觀察

磷鎢酸負(fù)染用于透射電鏡，用磷鎢酸對網(wǎng)格上的樣品進(jìn)行染色；樣品干燥后，在樣品凹陷處鋪設(shè)薄層重金屬鹽，突出處無染料沉積，產(chǎn)生負(fù)染色效果。噬菌體形態(tài)觀察采用Tecnai 12透射電鏡，在揚(yáng)州大學(xué)檢測中心完成。

1.4 噬菌體的宿主譜

用點(diǎn)滴法測定噬菌體宿主譜。利用涂抹棒將細(xì)菌平均分布于瓊脂固定的LB培養(yǎng)基上。待靜止10 min，接著把不同噬菌體液點(diǎn)樣于瓊脂平板指定部位，風(fēng)干作用完畢之后，將其反轉(zhuǎn)置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)8 h，隨后檢查是否形成透明噬菌斑點(diǎn)。

1.5 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)

依據(jù)MOI分別為0.001、0.01、0.1、1、10和100的標(biāo)準(zhǔn)，將病毒與LB液體培養(yǎng)基按比例混合以達(dá)到一致的總?cè)萘?。?jīng)過以180 r·min-1的速度振蕩且保持在37 ℃條件下培育4 h，隨后采用雙層瓊脂平板法對比不同MOI條件下的噬菌體滴度，其中，最高滴度對應(yīng)的MOI即為最適宜的噬菌體MOI。

1.6 噬菌體生長曲線的測定

先將噬菌體液和接受細(xì)菌的MOI（即感染比例）為0.01的組合，放入37 ℃恒溫水浴中孵育15 min，然后經(jīng)過離心處理除去上清液，對殘留的沉淀進(jìn)行兩遍清洗。接著向其中注入10 mL已經(jīng)加熱至適宜溫度的LB液態(tài)培養(yǎng)基，然后立即將其放入37 ℃、180 r·min-1的恒溫?fù)u床里進(jìn)行震動(dòng)孵育，并從此刻起開始記時(shí)?？偣埠臅r(shí)120 min，每隔10 min對噬菌體的滴度進(jìn)行一次測量。對于各個(gè)時(shí)刻，分別執(zhí)行3組并列試驗(yàn)，并計(jì)算其平均數(shù)。最后，采用感染時(shí)刻作為圖表的橫軸，而以噬菌體效能的對數(shù)作為縱軸，描繪出噬菌體的增殖曲線，進(jìn)而明確其潛藏期、增殖高峰期以及破裂釋放的數(shù)量。

1.7 pH對噬菌體活性影響

分別取0.9、0.1 mL pH為2～13的SM緩沖液，與純噬菌體培養(yǎng)物混合，在37℃ 恒溫水浴中保持2 h。待反應(yīng)徹底完成，采用雙層瓊脂平板法對每個(gè)管內(nèi)的噬菌體溶菌能力進(jìn)行測定，并進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)以計(jì)算其平均效價(jià)。

1.8 溫度對噬菌體活性影響

對噬菌體的溫度耐受性進(jìn)行了一系列恒定溫度試驗(yàn)，具體包括在30、40、50、60、70以及80℃的水浴中分別孵化30及60 min，之后讓樣本自然冷卻10 min。接下來應(yīng)用雙層瓊脂板技術(shù)來評估噬菌體在上述各個(gè)不同溫度環(huán)境下的活性，并通過多次試驗(yàn)取平均數(shù)以確保結(jié)果的精確性。

1.9 噬菌體基因組分析

從已分離并純化的噬菌體中提取出核酸，并對其進(jìn)行基因組序列分析。采用BLAST技術(shù)進(jìn)行序列匹配，分析噬菌體遺傳物質(zhì)中的已鑒定基礎(chǔ)功能蛋白質(zhì)。深入探索噬菌體在遺傳層面的認(rèn)識。測序工作由生工生物公司完成，該公司完成了基因庫的構(gòu)建和全基因組測序。應(yīng)用GeneMarkS程序?qū)κ删w遺傳物質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析，并利用CGView工具來描畫噬菌體基因組的環(huán)狀圖。依據(jù)毒性元素資料庫與全面抗藥性基因庫，挑選出假定的毒力元素及抗性基因。用mega X軟件對本研究分離的噬菌體進(jìn)行進(jìn)化分析。基于53個(gè)噬菌體構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，其中包括本研究分離的噬菌體。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體效價(jià)測定

純化處理完的噬菌體，通過雙層瓊脂板計(jì)數(shù)法得出其效價(jià)達(dá)1.6×1012 PFU·mL-1。

2.2 噬菌體的形態(tài)學(xué)鑒定

本項(xiàng)研究成功從沙門菌中誘導(dǎo)并純化出一株噬菌體，并將其定名為SP18-108。噬菌體SP18-108展現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)溶菌特性，其形成的噬菌斑鮮亮，四周劃一且輪廓分明（圖1A），該狀況與用作對照組的噬菌體SP13所形成的噬菌斑（圖1B）相類似。通過電子顯微鏡的檢測（圖2）發(fā)現(xiàn)，噬菌體的頭部部分展現(xiàn)出圓形的構(gòu)造，其橫截面直徑大約是50 nm，而尾部的長度大概為130 nm，并且其寬度接近7 nm。依照世界病毒分類學(xué)會，SP18-108噬菌體被分類到有尾病毒目、長尾病毒科（Siphoviridae）。

2.3 噬菌體裂解沙門菌的宿主譜分析

噬菌體對多種血清型沙門菌裂解能力的分析顯示，噬菌體SP18-108能裂解至少14種血清型沙門菌（表1），而噬菌體SP13裂解的沙門菌種類較少，且裂解效果較差，表明噬菌體SP18-108具有寬譜性。

2.4 噬菌體SP18-108的生物學(xué)特性

2.4.1 感染復(fù)數(shù)

圖3A所示，采用S108沙門菌作為宿主菌，在MOI比例達(dá)到1∶10的條件下，觀察到所有組別中，噬菌體的活性呈現(xiàn)最大值，由此可推斷SP18-108噬菌體的理想MOI為0.1。

2.4.2 生長曲線

依據(jù)生長曲線圖示（圖3B）來看，噬菌體SP18-108在侵染寄生細(xì)菌最初的10 min內(nèi)其效力并未見顯著波動(dòng)，表明其隱藏期限為10 min，效力在100 min時(shí)攀升至頂峰，據(jù)此推斷，爆發(fā)期大致需要80 min。

2.4.3 pH對噬菌體活性影響

在效價(jià)為1.0×1012 （PFU·mL-1）下，噬菌體SP18-108在pH 4～12作用2 h后，通過雙層瓊脂法對噬菌斑計(jì)數(shù)，其效價(jià)可以達(dá)到1.0×106（PFU·mL-1）以上，表明大部分噬菌體仍然具有裂解活性；而當(dāng) pH≤2或pH=13時(shí)，檢測不到噬菌斑，其效價(jià)為0，表明噬菌體完全失活（圖4A）。

2.4.4 溫度對噬菌體活性影響

在效價(jià)為1.0×1012（PFU·mL-1）下，噬菌體SP18-108在30～40 ℃作用30 min后，通過雙層瓊脂法對噬菌斑計(jì)數(shù)，效價(jià)基本不變，而作用60 min后效價(jià)降低，但效價(jià)依然維持在1.0×1010 PFU·mL-1高水平，表明絕大部分噬菌體仍然具有裂解活性。溫度高于70 ℃時(shí)，作用60 min后檢測不到噬菌斑，其效價(jià)為0，表明噬菌體完全失活（圖4B）。

2.5 噬菌體全基因組分析

噬菌體SP18-108基因組序列總長度為43 250 bp，基序組為線性雙鏈DNA， GC含量為49.96%（圖5）。噬菌體SP18-108基因組共預(yù)測了63個(gè)CDSs，其中，31個(gè)（52.0%）編碼功能蛋白。在噬菌體SP18-108基因組中未發(fā)現(xiàn)與抗生素耐藥性、毒力和溶源因子相關(guān)的基因。

2.6 噬菌體的基因組進(jìn)化分析

經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)平臺上BLAST工具對核酸序列進(jìn)行的比較分析顯示，SP18-108噬菌體與FSL SP-101噬菌體在基因組DNA層面上具有極高的一致性（相似性為96%，參考序列號為NC_042065.1）。基于DNA聚合酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，噬菌體SP-108和噬菌體 FSL SP-101屬于同一分支，屬于有尾目，長尾病毒科（Siphoviridae）（圖6）。

3 討 論

本研究成功篩選到一株寬譜噬菌體SP18-108，其至少可裂解14種不同血清型沙門菌，拓展了人們對噬菌體只對特定血清型沙門菌具有裂解能力的傳統(tǒng)認(rèn)識。前人研究發(fā)現(xiàn)，其宿主譜的差異與噬菌體鞭毛蛋白（Fllic、FljB、FliK）、噬菌體外膜蛋白（OmpC、BtuB、TolC、FhuA）及一些表面抗原（O、VI抗原）和脂多糖有關(guān)，而這些蛋白和脂多糖是在不同的細(xì)菌中是有差異的，表明寬譜噬菌體SP18-108可能存在特殊的機(jī)制［16］。

該噬菌體從細(xì)菌中得到，通過基因組測序發(fā)現(xiàn)該噬菌體并不具有溶源性基因。作者查詢了相關(guān)資料，發(fā)現(xiàn)近年來，在不同的細(xì)菌體中噬菌體會以假溶原/攜帶者狀態(tài)的存在，而很多文獻(xiàn)僅描述了噬菌體載體狀態(tài)的發(fā)現(xiàn)，并未對其進(jìn)行機(jī)制研究，如空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）中的一些噬菌體存在較穩(wěn)定的攜帶者狀態(tài)［11］，烈性噬菌體可以持續(xù)與空腸彎曲桿菌結(jié)合，但并未發(fā)生基因組結(jié)合到宿主菌的基因組上［12］。

酸堿度（pH）和溫度是一個(gè)容易控制的理化因子，清楚環(huán)境pH、溫度與噬菌體存活及吸附效率之間的關(guān)系后，可通過控制發(fā)酵液酸堿度及溫度，如鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis）噬菌體HQ103存在攜帶者狀態(tài)［13］。而且，研究發(fā)現(xiàn)鼠疫菌編碼的組蛋白樣核結(jié)構(gòu)蛋白H-NS在21℃高表達(dá)，以沉默該噬菌體的Cox啟動(dòng)子Pe，從而抑制其進(jìn)入裂解周期；而在37℃時(shí)，由于鼠疫菌H-NS的減少，且該噬菌體抑制蛋白CI的截短以及啟動(dòng)子Pc的突變，從而使噬菌體HQ103從攜帶者狀態(tài)轉(zhuǎn)換成裂解狀態(tài)，裂解鼠疫菌。同時(shí)，經(jīng)土壤中細(xì)菌-噬菌體協(xié)同進(jìn)化試驗(yàn)證實(shí)，在環(huán)境溫度（21℃）下，噬菌體HQ103的攜帶者狀態(tài)可以促進(jìn)噬菌體-宿主菌共存［14-16］。

細(xì)菌體中可能同時(shí)存在不止一種噬菌體感染模式，目前常用的噬菌體分離檢測方法，更容易檢測到噬菌體經(jīng)典的溶原/裂解狀態(tài)，而掩蓋了噬菌體的假溶原/攜帶者狀態(tài)的發(fā)現(xiàn)，作者通過誘導(dǎo)的方式意外地發(fā)現(xiàn)了一株不具有溶源基因的噬菌體。讓人們意識到噬菌體-宿主菌相互作用的復(fù)雜性，遠(yuǎn)超經(jīng)典的裂解-溶原途徑，并引起足夠的重視和促進(jìn)相關(guān)的機(jī)制研究。

噬菌體的最佳MOI值是不同的，最佳 MOI值越小，需要裂解相同數(shù)量細(xì)菌的噬菌體就越少。單個(gè)噬菌體產(chǎn)生最多的后代并具有最高的增殖效率。在進(jìn)行噬菌體商業(yè)量產(chǎn)時(shí)，為保證制得高濃度的病毒液，常依據(jù)最適宜的相對感染量進(jìn)行培育，以此減低制造費(fèi)用并提升經(jīng)濟(jì)效益。然而，在畜牧業(yè)中動(dòng)物體內(nèi)沙門菌的確切數(shù)量難以得知，導(dǎo)致為了節(jié)約成本，不得不依據(jù)體外試驗(yàn)中的理想噬菌體感染比例作進(jìn)一步調(diào)節(jié)［17］。

生長速率圖展示了SP18-108顯示出卓越的分裂效率，其對噬菌體的孵化周期較為迅速，能夠在相同時(shí)間內(nèi)促進(jìn)更多噬菌體的繁殖。調(diào)查結(jié)果表明，噬菌體能夠隨著它們的細(xì)菌寄主的演變同步演化，這意味著在治療時(shí)，噬菌體能夠適應(yīng)并侵染那些具有耐藥性的變異細(xì)菌株。因此，在消除細(xì)菌方面，將噬菌體與抗生素聯(lián)合使用的效果，勝過單獨(dú)應(yīng)用噬菌體的療法。理想情況下，噬菌體和抗生素的結(jié)合具有積極的效果，但是噬菌體和抗生素之間的相互作用機(jī)制未知，需要進(jìn)一步研究，因此噬菌體-抗生素聯(lián)合療法，可能成為對抗耐藥菌的一種新的治療思路［18］。

4 結(jié) 論

噬菌體SP18-108展現(xiàn)出對不同溫度和pH波動(dòng)的較高適應(yīng)性。特別是，它對于某些關(guān)鍵的沙門菌血清型顯示出強(qiáng)效的溶菌作用，包括但不限于感染性腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌和雞源性白痢沙門菌。該噬菌體擁有相對廣泛的宿主范圍，并有潛力通過聯(lián)合使用其他噬菌體或經(jīng)過基因工程手段來進(jìn)一步拓展對宿主的適用性。如此可確保制備出的噬菌體制劑持有對環(huán)境溫度和酸堿度波動(dòng)的高度耐性，從而在多變的環(huán)境下依然能夠發(fā)揮出色的抗菌效果，促進(jìn)在臨床上更有效地預(yù)防和控制沙門菌相關(guān)疾病。

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（編輯 白永平）