Rab32對(duì)禽偏肺病毒C型復(fù)制的影響

摘 要： 為探究Rab32對(duì)禽偏肺病毒C型（aMPV/C）復(fù)制的影響，將A549細(xì)胞接種aMPV/C后進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察，并用Image J軟件對(duì)所采集圖像的共定位系數(shù)進(jìn)行分析；將pCMV-Flag-Rab32、pCMV-Flag、siRab32以及siNC分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后接種aMPV/C，分別采用熒光定量PCR（qPCR）、Western blot和TCID50檢測(cè)收集樣品中aMPV/C N基因轉(zhuǎn)錄水平、aMPV/C N和Rab32蛋白的表達(dá)水平以及病毒效價(jià)；將pCMV-mcherry-Rab32分別與可融合表達(dá)GFP的aMPV/C結(jié)構(gòu)蛋白的重組載體共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，24 h后采用激光共聚焦顯微鏡觀察；將pCMV-Flag-Rab32分別與可融合表達(dá)GFP的aMPV/C結(jié)構(gòu)蛋白的重組載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，36 h后收集細(xì)胞樣進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)。結(jié)果顯示，Rab32與aMPV/C在細(xì)胞質(zhì)中存在明顯的共定位；Rab32與aMPV/C的共定位系數(shù)極顯著高于未接毒組（Plt;0.01）；過(guò)表達(dá)Rab32后aMPV/C N基因轉(zhuǎn)錄水平，Rab32和N蛋白表達(dá)水平以及病毒效價(jià)均極顯著升高（Plt;0.01）；而干擾Rab32表達(dá)后，N基因的轉(zhuǎn)錄水平，Rab32和N蛋白的表達(dá)水平以及病毒效價(jià)均極顯著降低（Plt;0.01）；Rab32可與多個(gè)aMPV/C 蛋白（N、F、M、G、SH、P、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）在細(xì)胞質(zhì)中存在共定位，而與L3蛋白無(wú)明顯共定位；IP樣品中表達(dá)N和M2-2蛋白的樣品出現(xiàn)特異性條帶，其他蛋白無(wú)特異性條帶。綜上表明Rab32可能通過(guò)與aMPV/C N和M2-2蛋白之間的互作從而調(diào)控病毒的復(fù)制。相關(guān)研究結(jié)果可為深入闡明Rab32調(diào)控aMPV/C復(fù)制的分子機(jī)理提供研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： Rab32；禽偏肺病毒C型；復(fù)制；表達(dá)水平；互作

中圖分類號(hào)： S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)： 0366-6964（2024）09-4041-10

Effect of Rab32 on the Replication of Avian Metapneumovirus Type C

FENG" Xufei 4， QI" Yuxiang3， YU" Hanzhe3， ZHANG" Zhengzhou3， WANG" Rujia3， MENG" Chuang4， DONG" Kui1，2*

（1.School of Public Health，Shanxi Medical University， Taiyuan 030001，" China;

2.College of veterinary medicine （institute of comparative medicine）， Yangzhou University，

Yangzhou 225009，" China;

3.Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou University，

Yangzhou 225009，" China;

2. Key Laboratory of Coal Environmental Pathogenicity and Prevention of Ministry of Education，

Shanxi Medical University， Taiyuan， 030001， China;

3. College of Veterinary

Medicine （Institute of Comparative Medicine）， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China;

4.Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis， Yangzhou University， Yangzhou 225009，" China）

Abstract：" To investigate the effect of Rab32 on the replication of avian metapneumovirus type C （aMPV/C）， confocal images were obtained and co-localization coefficients were analyzed by Image J software after infected with A549 cells by aMPV/C. Furthermore， the plasmids of pCMV-Flag-Rab32 or pCMV-Flag as well as siRab32 or siNC RNA sequences were transfected into A549 cells before aMPV/C infection， respectively. The transcription level of aMPV/C N gene， the expression level of aMPV/C N and Rab32 proteins， and the viral titers in collected samples were detected by quantitative real-time PCR （qPCR）， Western blot， and the half tissue culture infective dose （TCID50） method， respectively. Then， the plasmids of pCMV-mcherry-Rab32 and GFP-tagged aMPV/C proteins were co-transfected into A549 cells before conducting confocal imaging， respectively. Subsequently， the plasmids of pCMV-Flag-Rab32 and GFP-tagged aMPV/C proteins were co-transfected into HEK293T cells before collecting cell samples at 36 h post-transfection and conducting the co-immunoprecipitation assay. The results showed that obvious co-localized fluorescent signals of Rab32 and aMPV/C were observed in the cytoplasm. The co-localization coefficients of Rab32 and N proteins were significantly higher than that of mock-infected group. The transcription level of the N gene， the expression level of Rab32 and N proteins， and the viral titers were significantly increased （Plt;0.01） after overexpression of Rab32， respectively. On the contrary， the transcription level of the N gene， the expression level of Rab32 and N proteins， and the viral titers were significantly decreased （Plt;0.01） after knockdown expression of Rab32， respectively. Obvious co-localized fluorescent signals of Rab32 and aMPV/C proteins （N， F， M， G， SH， P， M2-1， M2-2， L1， L2， and L4） were observed in the cytoplasm， while scarcely co-localized signals of Rab32 and L3 protein were found. Specific bands of N and M2-2 proteins were found in immunoprecipitation samples while no bands of other GFP-tagged aMPV/C proteins were found. These results indicating that Rab32 interacts with aMPV/C N and M2-2 proteins. In summary， Rab32 might affect aMPV/C replication by interacting with multiple viral proteins （N and M2-2）. The relevant results can provide the basis for elucidating the mechanism of Rab32 regulating aMPV/C replication via protein interaction.

Key words： Rab32; avian metapneumovirus type c; replication; expression level; interaction

*Corresponding author：" DONG Kui， E-mail： sxdongkui@163.com

禽偏肺病毒C型（avian metapneumovirus type C，aMPV/C）屬于副黏病毒科，肺炎病毒亞科，偏肺病毒屬，是一種單股負(fù)鏈RNA病毒，其基因組大小約13 kb，共編碼9個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核蛋白（N）、磷蛋白（P）、囊膜蛋白（M）、融合蛋白（F）、小膜蛋白1（M2-1）、小膜蛋白2（M2-2）、小疏水蛋白（SH）、糖蛋白（G）、大蛋白（L）。鳥(niǎo)類感染該病毒后可引起明顯的產(chǎn)蛋量降低和呼吸道癥狀。在我國(guó)，雞群和鴨群體內(nèi)均檢測(cè)到該病毒的感染，嚴(yán)重威脅我國(guó)家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［1-3］。

Rab蛋白是一大類GTP酶依賴性膜運(yùn)輸相關(guān)蛋白。目前為止，哺乳動(dòng)物體內(nèi)共鑒定出大約60個(gè)不同的Rab成員。這些Rab蛋白定位于不同的細(xì)胞器/亞細(xì)胞區(qū)室，與真核細(xì)胞內(nèi)的貨物分選、囊泡出芽、囊泡形成、囊泡運(yùn)輸以及囊泡與靶膜的對(duì)接、系結(jié)和融合等生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)［4］。其中，Rab32在調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與其他細(xì)胞器（如線粒體、高爾基體）的接觸、自噬體的形成以及溶酶體相關(guān)細(xì)胞器（如黑素體）的生物過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用［5-6］。此外，Rab32 也參與了調(diào)控病原對(duì)宿主的感染過(guò)程。研究顯示，Rab32可特異性靶定于包裹沙門菌的囊泡膜上，抑制宿主細(xì)胞內(nèi)鼠傷寒沙門菌的復(fù)制［7］。而沙門菌的SopD2蛋白在不改變宿主細(xì)胞內(nèi)Rab32總量的情況下，以抑制Rab32向包裹沙門菌囊泡膜招募的方式促進(jìn)其復(fù)制［8］。同樣，Rab32可定位于結(jié)核分枝桿菌的吞噬體表面，招募組織蛋白酶D（一種溶酶體蛋白酶）靶向該吞噬體的轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制該病原的進(jìn)一步感染與復(fù)制［9］。然而，Rab32 是否影響aMPV/C的復(fù)制目前尚不清楚。因此，該研究聚焦于宿主因子Rab32，旨在探索Rab32是否參與調(diào)控aMPV/C的復(fù)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及病毒

本研究所使用的細(xì)胞系分別為人胚腎細(xì)胞（HEK-293T）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）。重組質(zhì)粒pCMV-Flag-Rab32、pCMV-Flag、pCMV-GFP-C3、pCMV-mcherry-Rab32以及融合表達(dá)GFP的aMPV/C結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3、L4）的重組質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。aMPV/C JC株由本實(shí)驗(yàn)室保存［10］。

1.2 主要試劑

HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix、CCK-8 Cell Counting Kit、Trizol裂解液、180 kDa Plus Prestained Protein Marker以及ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；aMPV/C N蛋白鼠單克隆抗體（mAb），由本實(shí)驗(yàn)室自制并保存；Flag mAb、GFP mAb、GAPDH 兔多克隆抗體（pAb）以及Rab32 pAb均購(gòu)自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、Alex488標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體、Alex546標(biāo)記的驢抗鼠IgG抗體均購(gòu)自上海生工生物有限公司；轉(zhuǎn)染試劑jet PRIME和INTERFERin均購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；RIPA蛋白裂解液、NP-40蛋白裂解液以及4×蛋白上樣緩沖液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Rab32 siRNA（GCUAGUGGCUCUGUAACUUTT）和siNC（UUCUCCGAACGUGUCACGU）均購(gòu)自蘇州吉瑪生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

分別根據(jù)NCBI中人源GAPDH mRNA（NM_002046.7）和aMPV/C JC株N基因（MZ274340.1）序列，分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于定量擴(kuò)增GAPDH和 aMPV/C N基因。引物由擎科生物科技有限公司合成（表1）。

1.4 Rab32與aMPV/C的共定位分析

將A549細(xì)胞（1×104個(gè)·孔-1）接種于共聚焦小皿中，待其匯合度達(dá)到60%以上時(shí)接種aMPV/C（MOI 1），感染48 h后收集細(xì)胞樣品。經(jīng)40 g·L-1多聚甲醛固定，2 mL·L-1 Triton X-100 37℃破膜和50 g·L-1脫脂奶室溫封閉2 h后，用aMPV/C N mAb和Rab32 pAb（1∶100）4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)Alex546標(biāo)記的驢抗鼠IgG和Alex488標(biāo)記的驢抗兔抗體（1∶400）室溫孵育2 h，DAPI染色15 min后，用激光共聚焦顯微鏡觀察和拍照。同時(shí)設(shè)置無(wú)病毒感染對(duì)照。隨后用Image J軟件對(duì)aMPV/C N蛋白和Rab32的共定位系數(shù)進(jìn)行分析。

1.5 細(xì)胞活力的測(cè)定

按照CCK-8 Cell Counting Kit的操作指南測(cè)定細(xì)胞活力。測(cè)定方法如下：將A549細(xì)胞（1×103個(gè)·孔-1）接種于96孔板中，待其匯合度達(dá)到80%左右時(shí)采用轉(zhuǎn)染試劑jet PRIME（或INTERFERin）分別將pCMV-Flag-Rab32和pCMV-Flag（siRab32或siNC）（0.5 μg·孔-1）分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，24 h后棄液，加入110 μL CCK-8溶液，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后采用多功能酶標(biāo)儀（TECAN P200）測(cè)量各孔的OD450 nm吸光值。同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)8孔。

1.6 過(guò)表達(dá)Rab32對(duì)aMPV/C復(fù)制影響的檢測(cè)

將A549細(xì)胞接種到6孔板中（1×105 個(gè)·孔-1），待其匯合度達(dá)到70%左右時(shí)利用轉(zhuǎn)染試劑jet PRIME將pCMV-Flag-Rab32和pCMV-Flag（2 μg·孔-1）分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，24 h后接種aMPV/C（MOI 1），感染48 h后收集細(xì)胞上清和細(xì)胞樣品。

將部分細(xì)胞樣品利用Trizol裂解法提取總RNA，按照HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper） 操作說(shuō)明將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用表1中引物和Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)aMPV/C N基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

將另一部分細(xì)胞樣品用適量RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000×g離心10 min后收集上清，加入適量4×蛋白上樣緩沖液，用12% SDS-PAGE膠進(jìn)行蛋白電泳。將分離的蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜上，經(jīng)50 g·L-1脫脂奶室溫封閉2 h，特異性一抗（GAPDH pAb、aMPV/C N mAb、Rab32 pAb）（1∶500）4℃孵育過(guò)夜，隨后用HRP標(biāo)記的（山羊抗鼠IgG與山羊抗兔IgG）二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，滴加適量ECL顯色液進(jìn)行顯示，用蛋白成像儀（AI800， GE生命科學(xué)）采集圖像。采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，檢測(cè)aMPV/C N的相對(duì)表達(dá)水平。

將收集的細(xì)胞上清進(jìn)行10倍系列稀釋，然后加入鋪有單層Vero細(xì)胞的96孔板中（100 μL·孔-1），48 h后用40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，經(jīng)2 mL·L-1 Triton X-100破膜和50 g·L-1脫脂奶封閉后，用aMPV/C N mAb（1∶100）4℃孵育過(guò)夜，用Alex546標(biāo)記的驢抗鼠IgG抗體（1∶400）室溫孵育2 h后用熒光倒置顯微鏡觀察并計(jì)算熒光陽(yáng)性孔數(shù)。病毒滴度（TCID50）按照Reed and Muench 法進(jìn)行測(cè)定［11］。

1.7 干擾Rab32的表達(dá)對(duì)aMPV/C復(fù)制影響的檢測(cè)

將A549細(xì)胞接種到6孔板中（1×105個(gè)·孔-1），待其匯合度達(dá)到60%左右時(shí)利用轉(zhuǎn)染試劑INTERFERin將siRab32和siNC（40 nmol·L-1）分別轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞內(nèi)，24 h后接種aMPV/C（MOI 1），感染48 h后收集細(xì)胞上清和細(xì)胞樣品。按照“1.4”中樣品處理方法用qPCR、Western blot、TCID50分別測(cè)定aMPV/C N基因轉(zhuǎn)錄水平、aMPV/C N表達(dá)水平以及病毒滴度。

1.8 Rab32與aMPV/C各蛋白在A549細(xì)胞中的共定位分析

將A549細(xì)胞（1×104個(gè)·孔-1）接種于共聚焦小皿中，待其匯合度達(dá)到60%左右時(shí)利用轉(zhuǎn)染試劑jet PRIME將pCMV-mcherry-Rab32分別與表達(dá)融合GFP標(biāo)簽的aMPV/C蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3、L4）的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，24 h后用40 g·L-1多聚甲醛固定，經(jīng)DAPI染色后用激光共聚焦顯微鏡觀察Rab32與aMPV/C各蛋白的共定位。隨后用Image J軟件對(duì)aMPV/C N蛋白和Rab32的共定位系數(shù)進(jìn)行分析。

1.9 Rab32與aMPV/C的相互作用的免疫共沉淀

將239T細(xì)胞接種到6孔板中（1×105 個(gè)·孔-1），待其匯合度達(dá)到70%左右時(shí)利用轉(zhuǎn)染試劑jet PRIME將pCMV-Flag-Rab32分別與表達(dá)融合GFP標(biāo)簽的aMPV/C蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。其中，pCMV-Flag-Rab32和pCMV-GFP-C3共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞為對(duì)照組。36 h后收集細(xì)胞樣品，使用NP-40裂解液冰上裂解30 min，12 000×g離心15 min收集上清液，一部分做input樣品，另一部分上清蛋白樣品用proteinA/G瓊脂糖珠孵育2 h，3 000×g離心5 min后收集上清液，用Flag或GFP抗體標(biāo)記的瓊脂糖珠4℃孵育過(guò)夜，3 000×g離心5 min后沉淀用NP-40裂解液洗滌3次，加入適量4×蛋白上樣緩沖液后，按照“1.4”中方法進(jìn)行Western blot分析。其中，一抗為（Flag mAb、GFP mAb）（1∶500）。

1.10 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

本研究中所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均來(lái)自于3次重復(fù)的結(jié)果，所有結(jié)果均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”表示，采用Graphpad prism 7軟件中t-test分析各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異性，采用origin 2018軟件繪圖，**表示差異極顯著，即Plt;0.01。

2 結(jié) 果

2.1 Rab32與aMPV/C共定位的共聚焦檢測(cè)

激光共聚焦顯微鏡成像結(jié)果顯示，Rab32蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)后呈點(diǎn)狀綠色熒光，aMPV/C N蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)后呈小點(diǎn)狀的紅色熒光，Rab32與aMPV/C N蛋白的熒光存在明顯的共定位，而未接毒對(duì)照組無(wú)紅色熒光信號(hào)，也無(wú)重疊的黃色熒光（圖1A）。進(jìn)一步用Image J軟件對(duì)綠色和紅色熒光的共定位系數(shù)的分析結(jié)果顯示，接種aMPV/C組的共定位系數(shù)極顯著高于未接毒組（Plt;0.01）（圖1B）。

為了分析Rab32是否參與調(diào)控aMPV/C的復(fù)制，將A549細(xì)胞感染aMPV/C后進(jìn)行激光共聚焦成像。結(jié)果顯示，Rab32蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)后呈點(diǎn)狀（綠色），aMPV/C N蛋白在細(xì)胞質(zhì)中同樣表達(dá)后呈小點(diǎn)狀（紅色），Rab32與aMPV/C N蛋白的熒光信號(hào)存在重疊現(xiàn)象，而未接毒對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)明顯的N蛋白表達(dá)信號(hào)，也無(wú)重疊的熒光（圖1A），表明Rab32與aMPV/C N蛋白存在共定位。進(jìn)一步用Image J軟件對(duì)共聚焦圖片的共定位系數(shù)分析結(jié)果顯示，接種aMPV/C組的共定位系數(shù)極顯著高于未接毒組（Plt;0.01）（圖1B），表明Rab32可能參與調(diào)控aMPV/C的復(fù)制。

2.2 過(guò)表達(dá)Rab32對(duì)aMPV/C復(fù)制的影響

樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pCMV-Flag-Rab32和pCMV-Flag后的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之間的細(xì)胞活力無(wú)明顯差異（Pgt;0.05）（圖2A）；與未接毒對(duì)照組相比，接種aMPV/C后可在約40 ku位置出現(xiàn)一條特異性的N蛋白條帶（圖2B）；與轉(zhuǎn)染pCMV-Flag的樣品相比，轉(zhuǎn)染pCMV-Flag-Rab32的樣品中Rab32蛋白的表達(dá)水平明顯增加（圖2B），其中，N蛋白的表達(dá)水平極顯著增加（Plt;0.01）（圖2C）；qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pCMV-Flag-Rab32的樣品中aMPV/C N基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于轉(zhuǎn)染pCMV-Flag的樣品（Plt;0.01）（圖2D）；TCID50檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pCMV-Flag-Rab32的樣品中病毒滴度極顯著高于轉(zhuǎn)染pCMV-Flag的樣品（Plt;0.01）（圖2E）。為了分析增加Rab32表達(dá)后對(duì)aMPV/C復(fù)制的影響，將pCMV-Flag-Rab32或pCMV-Flag轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后接種aMPV/C，48 h后分別用qPCR、Western blot和TCID50檢測(cè)aMPV/C N基因轉(zhuǎn)錄水平、 aMPV/C N蛋白（Rab32蛋白）表達(dá)水平和病毒效價(jià)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pCMV-Flag-Rab32或pCMV-Flag后的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間的細(xì)胞活力無(wú)明顯差異（Pgt;0.05）（圖2A），表明本試驗(yàn)中轉(zhuǎn)染pCMV-Flag-Rab32或pCMV-Flag無(wú)細(xì)胞毒性；接種aMPV/C后可檢測(cè)到特異性的N蛋白條帶（約40 ku），而未接毒對(duì)照組無(wú)此現(xiàn)象（圖2B）；轉(zhuǎn)染pCMV-Flag-Rab32的樣品中Rab32蛋白的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)染pCMV-Flag的樣品相比發(fā)生了明顯的升高（圖2B），其中，N蛋白的表達(dá)水平也出現(xiàn)了相同的現(xiàn)象（Plt;0.01）（圖2C）；與轉(zhuǎn)染pCMV-Flag組相比，轉(zhuǎn)染pCMV-Flag-Rab32的樣品中aMPV/C N基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高（Plt;0.01）（圖2D）；細(xì)胞上清中的病毒滴度也發(fā)生了相同的趨勢(shì)（Plt;0.01）（圖2E）。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)Rab32表達(dá)促進(jìn)aMPV/C的復(fù)制。

2.3 干擾Rab32表達(dá)對(duì)aMPV/C復(fù)制的影響

為了探究干擾Rab32表達(dá)對(duì)aMPV/C復(fù)制的影響，將siRab32和siNC分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后接種aMPV/C，48 h后收集細(xì)胞樣品和上清，分別用qPCR檢測(cè)aMPV/C N基因轉(zhuǎn)錄水平、Western blot檢測(cè)aMPV/C N蛋白表達(dá)水平、TCID50檢測(cè)病毒效價(jià)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRab32和siNC后的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間的細(xì)胞活力無(wú)明顯差異（Pgt;0.05）（圖3A）；與未接毒對(duì)照組相比，接種aMPV/C后可在約40 ku位置出現(xiàn)一條特異性的N蛋白條帶（圖3B）；與轉(zhuǎn)染siNC的樣品相比，轉(zhuǎn)染siRab32的樣品中組Rab32蛋白的表達(dá)水平明顯降低（圖3B），其中，N蛋白的表達(dá)水平極顯著減少（Plt;0.01）（圖3C）；qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRab32的樣品中aMPV/C N基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著低于轉(zhuǎn)染siNC的樣品（Plt;0.01）（圖3D）；TCID50檢測(cè)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRab32的樣品中病毒滴度極顯著低于轉(zhuǎn)染siNC的樣品（Plt;0.01）（圖3E）。表明，干擾Rab32表達(dá)抑制aMPV/C的復(fù)制。

為了分析降低Rab32表達(dá)后對(duì)aMPV/C復(fù)制的影響，將siRab32或siNC轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后接種aMPV/C，48 h后分別用qPCR、Western blot和TCID50檢測(cè)aMPV/C N基因轉(zhuǎn)錄水平、 aMPV/C N蛋白（Rab32蛋白）表達(dá)水平和病毒效價(jià)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRab32或siNC后的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間的細(xì)胞活力無(wú)明顯差異（Pgt;0.05）（圖3A），表明本試驗(yàn)中轉(zhuǎn)染siRab32或siNC無(wú)細(xì)胞毒性；接種aMPV/C后可檢測(cè)到特異性的N蛋白條帶（約40 ku），而未接毒對(duì)照組無(wú)此現(xiàn)象（圖3B）；轉(zhuǎn)染siRab32的樣品中Rab32蛋白的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)染siNC的樣品相比發(fā)生了明顯的降低（圖3B），其中，N蛋白的表達(dá)水平也出現(xiàn)了相同的現(xiàn)象（Plt;0.01）（圖3C）；與轉(zhuǎn)染siNC組相比，轉(zhuǎn)染siRab32的樣品中aMPV/C N基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著降低（Plt;0.01）（圖3D）；細(xì)胞上清中的病毒滴度也發(fā)生了相同的趨勢(shì)（Plt;0.01）（圖3E）。結(jié)果表明，干擾Rab32表達(dá)抑制aMPV/C的復(fù)制。

2.4 Rab32與aMPV/C 各蛋白的共定位分析

為探究Rab32與aMPV/C各蛋白是否存在共定位，將pCMV-mcherry-Rab32分別與表達(dá)融合GFP的aMPV/C各蛋白和pCMV-GFP-C3轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，24 h后利用激光共聚焦顯微鏡成像。結(jié)果顯示，Rab32蛋白呈紅色表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中；aMPV/C N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3、L4和GFP蛋白呈綠色主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；Rab32與多個(gè)aMPV/C結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3）存在熒光信號(hào)共定位，而Rab32與aMPV/C L3蛋白或轉(zhuǎn)染vector的GFP蛋白無(wú)明顯的共定位（圖4A）。進(jìn)一步用Image J對(duì)共聚焦圖像的共定位系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，Rab32與多個(gè)aMPV/C結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）之間的共定位系數(shù)極顯著高于Rab32與Vector（Plt;0.01），而Rab32和L3蛋白之間的共定位系數(shù)與Rab32和Vector之間無(wú)明顯差異（Pgt;0.05）（圖4B）。表明，Rab32可以與多個(gè)aMPV/C結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3）存在共定位為分析Rab32與aMPV/C各蛋白是否存在共定位現(xiàn)象，將pCMV-mcherry-Rab32分別與攜帶GFP標(biāo)簽的aMPV/C各蛋白或pCMV-GFP-C3（Vector）轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，24 h后進(jìn)行激光共聚焦觀察。結(jié)果顯示，Rab32蛋白可在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（紅色）；aMPV/C各蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3、L4）均在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（綠色）而Vector中GFP蛋白均勻表達(dá)于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中； Rab32與多個(gè)aMPV/C結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）的熒光信號(hào)存在重疊，而Rab32與aMPV/C L3蛋白或Vector的GFP蛋白無(wú)明顯的熒光信號(hào)重疊現(xiàn)象（圖4A）。進(jìn)一步用Image J進(jìn)行共定位系數(shù)分析結(jié)果顯示Rab32與多個(gè)aMPV/C結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）之間的共定位系數(shù)極顯著高于Rab32與Vector（Plt;0.01），而Rab32與L3蛋白或Vector之間的共定位系數(shù)無(wú)明顯差異（Pgt;0.05）（圖4B）。表明，Rab32可以與多個(gè)aMPV/C結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）存在共定位。

2.5 Rab32與aMPV/C結(jié)構(gòu)蛋白相互作用的免疫共沉淀分析

將pCMV-Flag-Rab32分別與表達(dá)融合GFP的aMPV/C結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，隨后進(jìn)行Co-IP試驗(yàn)。結(jié)果顯示，Input樣品中Rab32和aMPV/C的結(jié)構(gòu)蛋白分別與Flag抗體或GFP抗體結(jié)合后出現(xiàn)特異性條帶，表明Rab32和aMPV/C結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3）在HEK293T細(xì)胞中均獲得了高效表達(dá)（圖5）。" IP結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染pCMV-Flag-Rab32和表達(dá)融合GFP的aMPV/C N或M2-2蛋白的細(xì)胞樣品，分別與Flag MAb或GFP MAb反應(yīng)后出現(xiàn)了特異性條帶，而其他樣品（N、F、M、G、SH、M2-2、L1、L2、L4、C3）均無(wú)特異性條帶（圖5），進(jìn)一步表明Rab32與aMPV/C N和M2-2蛋白存在特異性相互作用。

將pCMV-Flag-Rab32分別與攜帶GFP標(biāo)簽的aMPV/C各結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，隨后按照常規(guī)方法進(jìn)行Co-IP試驗(yàn)。結(jié)果顯示，Input樣品中分別用Flag抗體和GFP抗體孵育后檢測(cè)到Rab32和aMPV/C各結(jié)構(gòu)蛋白的特異性條帶，表明Rab32和aMPV/C結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3）在HEK293T細(xì)胞中均成功表達(dá)（圖5）。共轉(zhuǎn)染pCMV-Flag-Rab32和攜帶GFP標(biāo)簽的aMPV/C N或M2-2質(zhì)粒的IP細(xì)胞樣品經(jīng)Flag MAb或GFP Mab孵育后檢測(cè)到特異性條帶，而其他樣品（F、M、G、SH、P、M2-1、L1、L2、L4、C3）均未檢測(cè)到特異性條帶（圖5），進(jìn)一步表明Rab32與aMPV/C N和M2-2蛋白存在相互作用。

3 討 論

aMPV/C最早在美國(guó)患有呼吸道疾病的火雞中被發(fā)現(xiàn)［12］，此后各國(guó)的研究人員從綠頭鴨、番鴨、野雞、珍珠雞、鴕鳥(niǎo)、鵝以及一些野生鳥(niǎo)類中分離到該病原［13-16］。在中國(guó)，自1999年首次發(fā)現(xiàn)aMPV感染以來(lái)［3］，研究人員開(kāi)展了一系列的血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明aMPV已在雞群中流行［17-18］。2013年，研究人員首次從中國(guó)東南地區(qū)患有急性呼吸道疾病的當(dāng)?shù)?0日齡肉雞中分離出一株aMPV/C（JC株）［10］。該毒株的成功分離為深入探究aMPV/C的致病機(jī)理提供了重要的生物材料。盡管Vero細(xì)胞是培養(yǎng)aMPV/C常用的細(xì)胞系，該細(xì)胞是否為擴(kuò)增aMPV/C的最佳細(xì)胞仍不是很清楚。研究人員利用17種不同細(xì)胞對(duì)從明尼蘇達(dá)州分離的aMPV/C毒株的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了評(píng)估，細(xì)胞病變（CPE）結(jié)合免疫熒光的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，aMPV/C在BGM、QT-35和DF-1細(xì)胞中生長(zhǎng)后可獲得較高的病毒滴度［19］。然而aMPV/C是否可感染A549細(xì)胞，目前尚不清楚。該研究發(fā)現(xiàn)aMPV/C不僅可感染A549細(xì)胞，而且可利用A549細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)完成子代病毒的復(fù)制（圖2、3）。研究人員利用該毒株接種BALB/c小鼠后發(fā)現(xiàn)，aMPV/C可在小鼠肺中進(jìn)行高效的復(fù)制，肺部炎癥因子和趨化因子（MCP-1、MIP-1α、RANTES、IL-1β、IFN-γ和TNF-α）的表達(dá)水平也顯著上調(diào)［20］。這些結(jié)果提示，aMPV/C可能為一種潛在的人畜共患病原體。

Rab超家族中的成員以GTP酶依賴的方式在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、核內(nèi)體以及質(zhì)膜的運(yùn)輸中發(fā)揮作用。如：Rab1、Rab2、Rab6和Rab33等Rabs可以調(diào)節(jié)高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體網(wǎng)絡(luò)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間囊泡的順行和逆行運(yùn)輸。然而，一部分Rabs （Rab32或Rab24）不僅調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與其他細(xì)胞器（如線粒體）的接觸，還調(diào)節(jié)自噬體的形成［5］。研究人員通過(guò)過(guò)表達(dá)GTP結(jié)合形式的Rab32（Rab32 WT與Rab32Q85L）或GTP非結(jié)合形式的Rab32（Rab32T39N-和rab32N143I），發(fā)現(xiàn)Rab32不僅通過(guò)影響LC3的募集來(lái)調(diào)節(jié)自噬體的形成，而且還會(huì)影響聚合體的形成［4-5］。Wang等［21］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Rab32通過(guò)影響果蠅體內(nèi)自噬的發(fā)生，從而調(diào)控果蠅的脂質(zhì)儲(chǔ)存。Rab32也參與了調(diào)控腫瘤的侵襲。有研究表明，Rab32將Drp1從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體，并招募ERK1/2，激活Drp1的ser616位點(diǎn)，進(jìn)而介導(dǎo)線粒體分裂，促進(jìn)星形膠質(zhì)瘤的間質(zhì)轉(zhuǎn)移、遷移和侵襲［22］。此外，Rab32在抑制細(xì)胞內(nèi)病原菌的擴(kuò)散方面也發(fā)揮重要作用［23］。研究表明Rab32可特異性靶向囊泡包裹的胞內(nèi)細(xì)菌，在抑制細(xì)菌的增殖和擴(kuò)散中發(fā)揮作用［7-9］。同樣，Rab32在宿主抗病毒感染過(guò)程中也發(fā)揮了作用。研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染后促進(jìn)了Rab32蛋白和mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染后可導(dǎo)致GTP結(jié)合型Rab32向GDP結(jié)合性Rab32的轉(zhuǎn)變，引起GDP結(jié)合型Rab32的累積，降低了Rab32的降解。而GDP結(jié)合的Rab32通過(guò)與HCV核心蛋白的相互作用，將病毒核心蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核周的病毒合成位點(diǎn)，從而利用病毒粒子的組裝［24］。該研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Rab32顯著增加了aMPV/C N基因的轉(zhuǎn)錄水平、N蛋白的表達(dá)和子代病毒的數(shù)量（圖2），而干擾Rab32顯著降低了aMPV/C N基因的轉(zhuǎn)錄水平、N蛋白的表達(dá)和子代病毒的數(shù)量（圖3）。結(jié)合激光共聚焦顯微鏡成像結(jié)果（圖1）可知，Rab32參與調(diào)控aMPV/C的復(fù)制。進(jìn)一步利用激光共聚焦顯微鏡成像和免疫共沉淀技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Rab32可與aMPV/C N和M2-2蛋白發(fā)生互作（圖4、5）。該結(jié)果與HCV感染過(guò)程中Rab32發(fā)揮的作用相似［24］。由此推測(cè)，宿主因子Rab32在促進(jìn)子代病毒的有效組裝過(guò)程中發(fā)揮作用，該猜想需要通過(guò)設(shè)計(jì)一系列的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，也是本研究后續(xù)開(kāi)展的主要側(cè)重點(diǎn)。

4 結(jié) 論

Rab32可能通過(guò)與aMPV/C N和M2-2蛋白之間的相互作用從而調(diào)控aMPV/C 的復(fù)制，相關(guān)研究結(jié)果可為深入探索Rab32調(diào)控aMPV/C復(fù)制的分子機(jī)理提供研究基礎(chǔ)，也可為進(jìn)一步探究Rab32是否參與調(diào)控其他肺炎病毒感染提供參考信息。

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（編輯 白永平）